一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法

摘要

本发明基于illumina公司的Hiseq测序平台提供的接头序列和测序流程，设计了内切酶特异性的粘性末端序列接头，成功的建立了DNA标签文库的建库方法，并应用于Hiseq2000测序，开发分子标记，从而应用于群体遗传学研究和遗传图谱的绘制。

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，尤其涉及一种标记开发的高通量测序的接头及其运用方法。

背景技术

RAD（restriction association site DNA） 是酶切位点附近的DNA序列标签。RAD可以作为一种分子标记应用于基因定位，图谱绘制等。RAD标记的密度可以通过在分离的过程中应用不同的内切酶获得。RAD标记技术与第二代测序技术的完美结合，能够快速而且高通量的实现标记开发，图谱绘制等。RAD标记技术能够降低基因组的复杂度，不受基因组序列有无的限制，操作简便，能够快速的开发出大量的分子标记，从而广泛应用于群体的遗传研究。

发明内容

为了实现上述的技术目的，本发明提供了一种标记开发的高通量测序的接头及其运用方法。

本发明的一个目的是提供两种特殊结构的接头分子A和B。

本发明提供的双链接头DNA序列分子A，包括正向和反向两条链。正向链从5’末端到3’末端依次由如下部分组成：与Illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列P7相同的寡核苷酸片段和与待测DNA的3’端互补的粘性酶切位点序列；反向链与正向链除了突出的粘性末端外，其余序列与正向链互补，并在5’末端进行磷酸化修饰。接头A的结构如图1所示。

前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的正向链为序列表中序列1。

前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的与illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列p7相同的寡核苷酸片段，为序列表中序列1的第5-61位。

前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的与待测DNA的3’端互补的粘性酶切位点序列，为序列表中序列1的第1-4位。

前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的反向链为序列表中序列2。

前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的在反向链5’末端进行磷酸化修饰，为序列表中序列1的第1位的脱氧核糖核苷酸进行的磷酸化修饰。

本发明提供的局部双链的接头DNA序列分子B，包括一个长的正向链和一个短的反向链。正向链从5’末端到3’末端依次由如下部分组成：与Illumina公司的测序平台测序序列P5相同的寡核苷酸片段和与待测DNA的3’端互补的一个脱氧核糖核苷酸突出末端；反向链与正向链的一部分序列互补并在5’末端进行磷酸化修饰。接头B的结构如图2所示。

前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的正向链为序列表中序列3。

前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的与Illumina公司的测序平台测序序列P5相同的寡核苷酸片段，为序列表中序列3的第1-57位。

前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的与待测DNA的3’端互补的一个脱氧核糖核苷酸为序列表中序列3的第58位。

前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的反向链为序列表中序列4。

前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的在反向链5’末端进行磷酸化修饰，为序列表中序列4的第1位的脱氧核糖核苷酸进行的磷酸化修饰。

本发明的第二个目的是提供一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，包括如下步骤： 1）将所述用于标记开发的基因组DNA用特定的限制性内切酶消化，并将所述的接头A与消化产物连接，得到含有接头A的连接产物；2）对步骤1）得到的连接产物进行打碎，打碎大小集中在300—700bp之间；3）对步骤2）得到的打碎产物纯化回收之后，进行末端补平，加dATP，并进行接头B的连接；4）对步骤3）得到的连接产物进行纯化并定量后进行PCR扩增，并将扩增产物纯化后，在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序；5）进行生物信息分析后，确定酶切位点SNP或INDEL等标记。流程图如图3所示。

前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，步骤1）中，所述将基因组DNA消化的酶切体系包括：酶切缓冲液、限制性内切酶、0.1—1ug的基因组DNA，所述限制性内切酶在酶切体系中的浓度为0.5 U/ul；所述的连接体系包括：上述酶切产物、接头A、ATP、连接酶，所述的接头A 的浓度为100nM，所述的ATP的浓度为1mM，所述连接酶在所述连接体系中的浓度为0.5 U/ul。

前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，步骤2）中，所述的打碎的条件为使用covaris打碎仪器并调整相应的参数。

前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，步骤3）中，所述的回收打碎产物的方法为采用PCR产物回收试剂盒进行回收；所述的末端补平体系为使用NEB 公司的Quick Blunting kit 进行；所述的加dATP的体系包括：dATP，加A缓冲液，加dATP的聚合酶，所述的dATP 的浓度为5 mM，所述的聚合酶在所述的反应体系中的浓度为0.05 U/ul；所述的接头B的连接体系包括：接头B，ATP、连接酶，所述的接头B 的浓度为10 uM，所述的ATP的浓度为1mM，所述连接酶在所述连接体系中的浓度为0.5 U/ul。

前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，步骤4）中，所述的PCR体系包括：引物，聚合酶混合物，以及步骤3）中得到的连接产物。所述的引物的浓度为0.2 uM，所述聚合酶混合物在所述PCR体系中所占的50%的体积。

前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，其中所述的基因组DNA为任何单倍体或二倍体材料的DNA，包括动物、植物、微生物等。

本发明的实验证明，本发明提供的接头分子A和B，能够连接到DNA片段的两端，运用本发明的建库方法，成功的构建了DNA文库，并成功的运用在illumina公司的Hiseq2000的测序平台进行测序，获得大量的分子标记位点；同时，可以实现多个样本的混合建库，根据需要调整获取的分子标记的数目。本发明提供了一种便捷，高效，快速的标记开发的方法，在居群遗传、图谱绘制、种质评价和鉴定等研究和应用领域有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为接头A的结构示意图；

图2为接头B的结构示意图；

图3为建库流程示意图；            

图4为所述材料基因组DNA酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；

图5为对酶切基因组DNA产物加上接头A之后的打碎产物的琼脂糖凝胶电泳图（切胶回收前后）；

图6 为对加上接头B的连接产物进行PCR扩增产物的电泳图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用核苷酸序列均由上海Invitrogen生物公司合成。所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品，所用水均为超纯水。

1、基因组DNA的酶切和接头A的连接。

1）样品浓度测定：使用Qubit (美国)对样品DNA浓度测定，进行精准定量，并使用0.8% 琼脂糖凝胶，120v电压，电泳1小时，检测样品质量，确保水稻基因组DNA样品完整无降解。

2）以步骤1）检测的水稻基因组DNA100ng~1ug为模板进行限制性酶切。反应体系和反应条件如下：样品DNA (150~250 ng/μl) 0.1-1 μg ，Restriction Enzyme(EcoRI) 1 μl，10×NEB Buffer 2 5 μl，补加H₂O至总体积为50 μl，将上述混合液37℃处理15 min~2 h后，65℃处理20 min。取出1ul进行电泳检测，结果表明，酶切充分，得到均匀弥散的条带，如附图4。

3）接头A的连接：在步骤2）得到的消化产物中，补加ATP，T4连接酶，连接缓冲液以及接头A，在室温连接。具体的反应体系和反应条件如下：步骤2）中的消化产物50ul，100 mM ATP       1 μl，10×NEB Buffer 2   1 μl，（1000 u）T4 DNA Ligase，0.5 μl，加H2O 5 μl，100nM Adaptor1     2.5 μl，总共60 ul，室温(或16℃)下连接2h；连接产物65℃20 min，连接酶活性失活。

2、 连接产物的随机打碎，补平，加dATP。

1）将步骤1中得到的连接产物使用 covaris（美国）破碎至300-700bp，使用Qiagen PCR试剂盒回收打碎产物，具体步骤按照Qiagen试剂盒操作说明书进行。

2）对上述回收产物进行末端补平。反应体系和反应条件如下：打碎产物DNA 30 μl，10×Blunting Buffer 5 μl，1 mM dNTP 10 μl，Quick Blunting kit Enzyme Mix，1 μl，加H₂O 9 μl，总体系50 μl；反应条件：30 ℃孵育30 min。

3）对步骤2）的补平产物进行纯化：将上述产物进行胶回收，纯化目的片段。1.0% 琼脂糖凝胶电泳，切胶回收300-700bp范围的条带。整个回收过程按照Qiagen胶回收试剂盒操作说明书进行。如附图5。

4）对步骤3）中的纯化产物进行加dATP，反应体系和条件如下：步骤3）中的补平产物，20 μl，100 mM dATP1 μl，10×NEB Buffer 2 3 μl，Klenow exo^- (NEB) (50，000 units/ml) 0.3 μl，H₂O 5.5 μl，总体积30 μl；反应条件：充分混匀，37 ℃孵育30 min， 75 ℃20 min 热失活。

3、 接头B的连接。

1）将步骤2的连接产物，加入接头B，反应体系和条件具体如下:连接产物30 μl，NEB Buffer 22 μl，10 uM 接头B 2.5 μl，（1000 u）T4 DNA Ligase 0.5 μl，加H₂O15 μl，总体积50 μl，室温(或16℃)下连接2小时，连接产物65℃20min，连接酶活性失活。

2）将步骤1）中的连接产物等体积AMP μre XP Beads纯化1次。纯化过程严格按照使用说明书进行。

3）将步骤2）中的回收产物进行Qubit定量，用于下一步PCR反应。

4、 PCR扩增目的片段。

1）将步骤3中回收的产物，精准定量10ng用于PCR反应，得到的PCR产物，即为所构建的文库。反应体系和条件如下：DNA样品3 μl，PCR Primer 11 μl，PCR Primer 2 1 μl，2×Phusion PCR Master Mix 25 μl，H₂O 20 μl，总共50 μl，应条件为：先98℃预变性1min；然后98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共10个循环；最后72℃ 延伸5 min。Primer 1的序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’；Primer 2的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。

2）将步骤1）中的PCR产物等体积AMP μre XP Beads纯化两次。纯化过程严格按照使用说明书进行。取出1ul进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到300—700富集的条带，如附图6。

3）将步骤2）中的纯化产物进行Qμbit精准定量。 

5、 文库库检和上机。

1）将步骤4中所得的纯化产物稀释到1ng/ul，取出1ul用于Agilent2100（美国Agilent公司）检测，另外再取1ul用于QPCR（Biorad公司）检测，根据检测结果，决定上机浓度。

2）根据步骤1）所得的浓度，将文库稀释到上机要求后，在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序。

6、上机结果质控。

1）对水稻RAD基因组数据进行酶切位点分析，共5，533个。 

2）对下机数据16M过滤出有酶切位点的reads，再将PEreads用BWA是用较严格的参数比对到水稻基因组上，可以正确成对比上基因组的reads为42，6410对，read2上含酶切位点的总数目为590，905对。

3）BWA比对位置和基因组上酶切位点能够完全重合的数目情况统计如下：过滤后reads正向比对的有4546处，和基因组能完成重合的数目为4370处。

4）有78.9%的酶切位点被覆盖到。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表1

<110>  北京诺禾致源生物信息科技有限公司

<120> 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法

<160>  4

<210>  1

<211>  61

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>           

<223> 在第1位碱基进行磷酸化修饰

<400> 1

aattgatcgg aagagcgtcg tgtagggaaa gagtgtagat ctcggtggtc gccgtatcat       60

t                                                                                      61

 

序列表2

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<120> 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法

<160>  4

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>           

<223> 在第1位碱基进行磷酸化修饰

<400> 2

acgtgtgctc ttccgatc                                          19

序列表3

<110>  北京诺禾致源生物信息科技有限公司

<120> 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法

<160>  4

<210>  3

<211>  58

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>           

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct      58

 

序列表4

<110>  北京诺禾致源生物信息科技有限公司

<120> 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法

<160>  4

<210>  4

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>           

<223> 在第1位碱基进行磷酸化修饰

<400> 4

CTAGCCTTCT CGCAGCAC                                           18