临床样本前处理方法以及临床样本中诺如病毒的检测方法和试剂盒

摘要

本发明公开了临床样本前处理方法以及临床样本中诺如病毒的检测方法和试剂盒。非疾病的诊断和治疗目的的临床样本中诺如病毒的检测方法，包括临床样本的前处理，利用检测诺如病毒的扩增引物对前处理后的临床样本进行RT-PCR扩增，检测是否有特异性扩增产物以判断临床样本中是否含有诺如病毒，所述的临床样本的前处理是用固相聚苯乙烯对临床样品中的诺如病毒进行吸附，然后洗涤去除非吸附物，再解吸附收集吸附物，即为前处理后的临床样本。本发明的检测方法具有操作简单、成本低廉，反应快速，无环境污染，并且在2h内即可处理多达96份样本，是医院常规检测或病毒暴发检测的重要快速检测工具。

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种临床样本前处理方法以及临床样本中诺如病 毒的检测方法和试剂盒。

背景技术：

诺如病毒（Norovirus，NoV）是全球流行性腹泻的首要病原，也是散发性腹泻的主要病 原之一，每年大约发生2.67亿起相关感染事件，并且80~95%的流行腹泻疫情与NoV有关， 造成巨大经济损失，世界卫生健康组织（WHO）已将其定义为B类病原。NoV于1968年首 次被报道，造成当地一所学校50%的学生及32%的接触者感染。上世纪90年代US95/96变 异株的出现标志着GⅡ.4型成为流行株主要基因型，此后每隔两三年就会出现新的GⅡ.4变 异株。近二十年来已经暴发了至少四次大范围的病毒流行，包括1995~1996，2002~2003， 2004~2005，2006~2007。由于缺乏合适的体外培养和复制体系，人类的病毒感染背景比较复 杂，以及宿主敏感性呈现多样化等因素，加大了NoV研究难度。

NoV主要以粪口方式进行传播，病人的腹泻或呕吐样本一般含有大量的病毒粒子。除此 之外，受污染的水源和食物，如牡蛎、冰、鸡蛋、色拉等，尤其是生吃或食用加工不当的贝 类是导致NoV胃肠炎暴发流行的最常见原因。NoV的高危性由两个因素造成，一是低感染剂 量，10~100个病毒颗粒就能引起感染；二是高稳定性，病毒对加热、低温、酸碱和去污剂等 都具有较强的抵抗性。室温、pH2.7的环境下3h或20%的乙醚4℃处理18h后仍有感染性； 可耐受普通饮用水中3.75~6.25mg/L的氯离子浓度（游离氯0.5~1.0mg/L），在10mg/L高浓度 氯离子（处理污水采用浓度）条件下才被灭活。NoV对高温、冰冻、高压等也有一定的耐受 度，60℃孵育30min后，病毒不能完全灭活；冰冻3个月对食品中NoV活性没有任何影响； 商业上通用的烹饪高压对贝类中病毒的灭活作用有限。

NoV感染引起的胃肠炎为自限性疾病，患者一般会在72h内自愈，但病毒传播能力强， 感染剂量低，在环境中能长期稳定存在，易在学校、医院、疗养院、军队、轮船等封闭的环 境中短时间内就造成大范围感染，并且对老人、儿童及免疫力低下人群还易造成其他并发症 甚至脱水性死亡。NoV被称为“胃肠炎流感病毒（Gastric Flu）”，其进化模式类似于流感病毒， 具有明显的季节性，目前还缺少有效的预防和治疗手段，对抗病毒研究以及监测网络的建立 提出了严峻的挑战。

NoV基因组大约7.5~7.7kb，包括3个开放阅读框，分别编码非结构蛋白前体、衣壳蛋白 VP1和次衣壳蛋白VP2。衣壳蛋白包裹病毒，易受到外界的影响而发生变异，对于逃逸宿主 免疫、增强病毒粒子稳定性及适应外界变化等具有重要意义，常用作病毒分型的标准。根据 其衣壳蛋白序列同源性可分成5个基因组（Genogroup），基因组之间的核酸序列同源性约46 %，其中G Ⅰ、GⅡ和GⅣ为人源病毒。同一基因组内的核酸同源性为69%~97%，进一步分 成不同的基因型（Genotype），例如G Ⅰ含有8个基因型，GⅡ含有19个（并不断增加）。病 毒的基因多样性增加了研究的困难，因此加强国际之间的合作，建立标准的病毒分型和命名 规则，将有助于诺如病毒的深入研究。目前美国和欧洲都已建立了相应的病毒数据库（Calic iNet:www.cdc.gov/foodsafety/activities.html#calicinet;NoroNet:www.noronet.nl/noronet/），为 流行株变化分析和病毒进化研究提供了数据信息。而我国相应的监测与积累工作还不太成熟， 有必要加强临床样本的收集，同时，更要重视环境与食品中的NoV污染状况的监测，这对于 病毒的传播特点、分布规律以及稳定性等研究具有指导意义。

随着检测技术的发展，越来越多未知因素的胃肠炎被证明是由诺如病毒引起的。目前NoV 检测技术主要包括电镜观察、免疫技术及RT-PCR检测技术等，然而电镜观察到的病毒颗粒 仍然很少，使得该方法的灵敏度比较低，，需要腹泻样本中病毒粒子的浓度至少为10⁶个/mL， 并且还需要贵重的仪器以及有经验的操作人员，从而限制了该技术的应用。免疫学检测方法 具有操作简单、检测快速、不需要昂贵仪器等诸多优点，但由于病毒的抗原变异性强，多株 病毒可能同时流行的特点可能是免疫学方法检出率低的原因，并且用于检测的抗原，可能与 带检样本中病毒的抗原相差比较大，以至于没有足够的交叉反应，降低了方法的灵敏度。 RT-PCR检测方法经过几十年的发展，已经被认为是诺如病毒检测的“金标准”，该方法已经可 以达到快速、简单、灵敏度高的检测要求，并且通过序列分析，为病毒溯源等工作提供了数 据支持。

然而临床样本中经常含有能够抑制反转录酶和DNA聚合酶活性的抑制物，因此有必要 在进行RT-PCR反应之前，对病毒核酸进行纯化或者其它方法预处理方法。良好的核酸提取 方法不但要求有较好的病毒回收率和除杂能力，并且还要求满足操作简单及高通量处理的效 果。目前已经有大量的前处理方法被报道，然而往往包括繁琐的操作步骤，并且成本较高， 需要较高的技术操作，采用的试剂还会造成环境的污染，以及难以高通量处理等不足。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能够去除临床样本中抑制反转录酶和DNA聚合酶活性的抑制 物的影响，能高质量、高通量、快速的检测临床样本中是否含有诺如病毒的检测方法和试剂 盒，该检测方法具有操作简单、成本低廉，反应快速，无环境污染，可作为医院常规检测或 病毒暴发检测的重要快速检测工具。

本发明的非疾病的诊断和治疗目的的临床样本中诺如病毒的检测方法，包括临床样本的 前处理，利用检测诺如病毒的扩增引物对前处理后的临床样本进行RT-PCR扩增，检测是否 有特异性扩增产物以判断临床样本中是否含有诺如病毒，其特征在于，所述的临床样本的前 处理是用固相聚苯乙烯对临床样品中的诺如病毒进行吸附，然后洗涤去除非吸附物，再 解吸附收集吸附物，即为前处理后的临床样本。此前处理后的临床样本就可以作为RT-PCR 的RNA模板。

所述的固相聚苯乙烯优选为高亲和力酶标板。

所述的临床样本的前处理优选为：

（a）临床样本处理：用DEPC处理的PBS溶液稀释采集的待检测临床样本至10%（w/v） 浓度，充分振荡混匀，并于12000g下离心10min，收集上清用于诺如病毒捕获；

（b）取上清加入高亲和力酶标板上，37℃放置1.5h，然后弃去板中的溶液，用DEPC 处理的PBS溶液洗涤三次，加入无RNase的水，置于95℃加热5min，并立即冰浴，得到前 处理后的临床样本。

所述的利用检测诺如病毒的扩增引物对前处理后的临床样本进行RT-PCR扩增优选为采 用20μL的一步法RT-PCR反应体系，反应体系含有2×one-step RT-PCR MIX 10μL，10μmol/L 的检测诺如病毒上游引物和下游引物各1μL，MLV/RNasin/HS-Taq混合酶0.8μL，RNA模板 7.2μL，反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，50℃30s，72℃30s， 共35次循环后，72℃最后延伸7min。

所述的检测诺如病毒上游引物和下游引物优选为以诺如病毒的N/S区为靶序列设计检测 诺如病毒GⅡ型通用引物，其为：

上游引物：5’-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3’；

下游引物：5’-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3’。

本发明的临床样本中诺如病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括高亲和力酶标板，检测 诺如病毒上、下游引物，RT-PCR反应试剂，DEPC处理的水，DEPC处理的PBS溶液。

所述的检测诺如病毒上游引物和下游引物优选为以诺如病毒的N/S区为靶序列设计检测 诺如病毒GⅡ型通用引物，其为：

上游引物：5’-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3’；

下游引物：5’-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3’。

所述的RT-PCR反应试剂包括2×one-step RT-PCR MIX和MLV/RNasin/HS-Taq混合酶。

本发明的第二个目的是提供一种临床样本前处理方法，其特征在于，所述的临床样本前 处理是用固相聚苯乙烯对临床样本中的诺如病毒进行吸附，然后洗涤去除非吸附物，再 解吸附收集吸附物，即为前处理后的临床样本。此前处理后的临床样本就可以作为RT-PCR 的RNA模板。

所述的固相聚苯乙烯优选为高亲和力酶标板。

所述的临床样本的前处理优选为：

（a）临床样本处理：用DEPC处理的PBS溶液稀释采集的待检测临床样本至10%（w/v） 浓度，充分振荡混匀，并于12000g下离心10min，收集上清用于诺如病毒捕获；

（b）取上清加入高亲和力酶标板上，37℃放置1.5h，然后弃去板中的溶液，用DEPC 处理的PBS溶液洗涤三次，加入无RNase的水，置于95℃加热5min，并立即冰浴，得到前 处理后的临床样本。

本发明巧妙的利用固相聚苯乙烯，即高亲和力酶标板能够吸附蛋白的性质，使临床 样本中的诺如病毒粒子结合在板上，从而起到纯化病毒的作用，消除临床样本中能够抑 制反转录酶和DNA聚合酶活性的抑制物的影响，能高质量、高通量、快速的检测临床样本 中是否含有诺如病毒，该检测方法具有操作简单、成本低廉，反应快速，无环境污染，并且 在2h内即可处理多达96份样本，是医院常规检测或病毒暴发检测的重要快速检测工具。

附图说明：

图1是本发明的检测方法的灵敏度测试，电泳顺序为M，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10， 11，12，13，14，15，其中1~7为TRIzol法提取RNA进行10×梯度稀释后的RT-PCR电泳结 果，9~14为利用本发明的检测方法提取RNA进行10×梯度稀释后的RT-PCR电泳结果，8和 15为阴性对照。

图2是本发明的检测方法用于检测临床样本中的诺如病毒，电泳顺序为M，1~24，其中2~23 为被检测临床样本，1为阳性对照，24为阴性对照。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

检测临床样本中的诺如病毒

（1）临床样本的采集与处理

收集医院的疑似腹泻病例样本22份，用DEPC处理的PBS（在1升PBS溶液中加入1ml 的DEPC，搅拌均匀，使DEPC油状散开，静置6小时以上，灭菌即可）稀释采集的待检测 临床样本至10%浓度（w/v），充分振荡混匀，并于12000g下离心10min，收集上清。

（2）病毒捕获与核酸释放

取100μL样本上清，加入高亲和力酶标板（美国Corning Costar/康宁公司，产品名称“96 孔高亲和力酶标板”）上，37℃放置1.5h；然后弃去板中的溶液，用DEPC处理的PBS（pH7.4） 洗涤三次，加入50μL无RNase的水，置于95℃加热5min，并立即冰浴，得到前处理后的临 床样品，可作为RT-PCR的RNA模板。

（3）RT-PCR扩增

采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR MIX 10μL，10μmol/L 的诺如病毒上游引物（5’-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3’）和下游引物（5’- CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3’）各1μL，MLV/RNasin/HS-Taq混合酶0.8μL，RNA模 版7.2μL。反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，50℃30s，72℃30s， 共35次循环后，72℃最后延伸7min，获得PCR扩增产物。

一步法RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司，产品名称为“One Step RT-PCR Kit Ver.2”

（4）电泳、PCR产物序列测定

取PCR扩增产物5μL，制备1.5%的琼脂糖凝胶（含0.05‰Gold View核酸染料）进行电 泳，凝胶成像系统分析观察结果，诺如病毒的扩增条带理论为344bp。电泳结果如图2所示， 从图2可以看出样本1、2、6、9、10、14、16、23中含有诺如病毒。

实施例2：

临床样本中诺如病毒的检测方法的灵敏度测试。

收集医院的疑似腹泻病例样本1份，将样品分成2组进行实验。需要注意的是，实验中 诺如病毒的含量采用了RTPCRU单位来定义，即为采用标准的TRIzol-RT-PCR方法对进行10 ×梯度稀释的病毒液进行检测，则稀释至到恰能检出时的病毒浓度为一个RTPCRU。

其中一组按照实施例1的方法对进行检测，RT-PCR前，其模板RNA进行10×梯度稀释， 由此得到10^-1，10^-2，10^-3，10^-4和10^-5稀释度模板RNA，分别以原始模板RNA和各稀释度 RNA作为RNA模板进行RT-PCR检测，其RT-PCR产物检测结果如图1中的泳道9-14所示。

另外一组利用常规的TRIzol法提取RNA，再进行10×稀释，由此得到10^-1，10^-2，10^-3， 10^-4，10^-5和10^-6稀释度模板RNA，分别以原始模板RNA和各稀释度RNA作为RNA模板进 行RT-PCR检测，其RT-PCR产物电泳结果如图1中的泳道1-7所示。

其中泳道1-9（模板RNA），2-10（10^-1稀释的模板RNA），3-11（10^-2稀释的模板RNA）， 4-12（10^-3稀释的模板RNA），5-13（10^-4稀释的模板RNA），6-14（10^-5稀释的模板RNA）， 泳道7（10^-6稀释的模板RNA），从图1中可以看出，利用本发明的检测方法，其9-13号泳 道阳性结果（13号条带比较模糊），14号泳道阴性结果，由此可见，本发明能够检测到10^-4稀释度（即10RTPCRU）以上的样本，其灵敏度高。本发明的检测方法步骤简单，无需利用 繁琐的TRIzol法提取RNA，再进行RT-PCR，因此利用本发明的检测方法可以高质量、快速、 高通量的检测临床样本中是否含有诺如病毒，该检测方法具有操作简单、成本低廉，反应快 速，无环境污染的优点。