氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒及方法

摘要

本发明涉及基因检测领域，具体涉及荧光PCR-熔解曲线法对氨基糖苷类药物性耳聋易感基因进行检测的试剂盒及方法。本发明的技术方案为提供一种氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液、阴性质控品和阳性质控品，所述PCR反应液包括引物、PCR Buffer、dNTP混合液、饱和荧光染料、Taq酶、UNG酶。本发明根据氨基糖苷类药物性耳聋易感基因SNP位点，设计特异的PCR引物，能在同一PCR反应中检测2个氨基糖苷类药物性耳聋易感位点，一管操作，检测范围广并且快速、准确。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及荧光PCR-熔解曲线法对氨基糖苷类药物性耳聋易感基因进行检测的试剂盒及方法。 

背景技术

据我国2006年第二次全国残疾人抽样调查显示，听力残疾者2004万人，占全国8296万残疾人的24.16%，其中药物致聋的占30%-40%，人数多达800万。药物性耳聋指的是使用某些药物治病或人体接触某些化学制剂所引起的耳聋。目前已发现耳毒性药物达100多种，而耳毒性抗生素最为常见。氨基糖苷类抗生素是最常见的耳毒性抗生素，包括临床上常用的链霉素、庆大霉素等。近十年来已经明确了几个与氨基糖苷类抗生素有关的线粒体突变，其中A1555G、C1494T等在中国人群中的发生频率高达4%。因此，检测氨基糖苷类药物性耳聋线粒体突变位点，对耳聋的诊断、早期筛查，以及提供用药指导有着重要的意义。 

目前市场上针对耳聋基因检测的试剂盒种类较少，常见的线粒体突变检测方法有PCR-RFLP法、微阵列芯片法、ARMS-PCR法、荧光定量PCR法、直接测序法等。国内临床常用的方法为微阵列芯片法和荧光定量PCR法等，他们主要的技术缺陷如下： 

1、微阵列芯片法能对突变基因位点具体分型，且检测基因型相对多，但其有几大缺点： 

检测需经过全血DNA提取（30min）、PCR扩增（2h以上）、产物杂交分析（1h以上）等步骤，检测时间长（4h以上），操作繁琐，不能满足临床对致聋基因大量筛查的需求；由于操作流程过多，容易造成样本交叉污染；其次，对单个碱基的辨识率比较低，易出现假阴性和假阳性，使结果的准确率受到影响；此外，微阵列芯片成本过高，需要专门的芯片扫描仪器，检测成本高，如博奥生物生产的“晶芯”系列产品，一人份检测需要千元以上，难以在临床上大范围推广。 

因此，有必要研发检测时间短、成本低且适合对药物致聋基因进行筛查的产品。 

2、现有PCR法产品的优点是检测时间短，操作相对简单，成本低，但其有以下缺点： 

普通ARMS-PCR产品的扩增效率仅为正常扩增的1-10%，因此扩增体系缺乏稳定性；四引物ARMS-PCR的一个反应只能检一个突变位点：中生北控生物有限公司的产品可以检测四个耳聋基因突变位点，但是每个位点需要一个反应管，多重PCR难以实现，检测过程繁琐。 

普通PCR产品共有的缺点：在结果判读时需要通过条带大小判断基因型，缺乏直观性。凝胶电泳检测结果容易造成PCR交叉污染、检测灵敏度低且耗时长。 

3、利用Taqman探针进行基因分型，灵敏度高，特异性强，但有以下缺点： 

利用Taqman探针进行SNP突变检测，每检测一个位点需要2条探针，且对探针灵敏度有较高要求。探针合成成本较高，对荧光PCR仪的通道数有要求，不利于推广。 

当前的检测试剂盒每个反应仅检测一个位点。如目前北京科聆金仪生物技术有限公司，解放军301医院开发的荧光检测产品也仅一次检测单一位点。尚无能一次检测多位点的产品问世。 

4、直接测序法的优点是能够确切的知道所检测区域的基因序列，准确度高，但是有以下缺点： 

检测过程繁琐，周期过长：测序之前需要对目的片段进行PCR扩增，对扩增产物进行纯化，再进行毛细管电泳测序，整个过程需要严格质控；测序反应成本较高，需要昂贵的荧光标记的核酸和专业的测序仪，不适合临床推广。测序结果的判读比较复杂，需要经过专业训练。 

综上所述：现有的常用方法，如荧光定量PCR法检测基因，仅检测线粒体上单一突变位点，大部分荧光定量PCR法无内标，不能进行质量控制；微阵列态芯片产品操作时间长、成本高、准确度低且需特殊仪器。大规模筛查线粒体基因突变，要求快速、低成本、检测范围广，以上产品无法同时满足。 

针对上述问题，急需一种比现有方法操作简单、检测范围广、检测灵敏度高的产品，切实满足氨基糖苷类药物性耳聋易感基因筛查的需求。 

发明内容

本发明的目的是利用等位基因特异性PCR（Allele Specific PCR），联合熔解曲线分析(Melting Curve Analysis)，利用产物Tm值的差异对不同样本进行基因检测，无需探针、无需对引物进行特殊修饰，成本低廉。能快速、准确检测线粒体上两个易感基因位点。 

本发明的技术方案为提供一种氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液、阴性质控品和阳性质控品；所述PCR反应液包括引物、PCR Buffer、dNTP混合液、饱和荧光染料、Taq酶和UNG酶；所述dNTP混合液为dATP、dCTP、dGTP和dUTP的混合液； 

所述引物包括： 

1494位点特异性引物T，所述引物T的序列为：SEQ ID NO:1； 

1555位点特异性引物G，所述引物G的序列为：SEQ ID NO:2； 

两位点公用的下游引物R，所述引物R的序列为：SEQ ID NO:3； 

一对内参beta-actin引物A1和引物A2，所述引物A1的序列为SEQ ID NO:4，所述引物A2的序列为SEQ ID NO:5。 

其中，所述阴性质控品为带有正常人线粒体DNA片段的质粒载体。 

所述阳性质控品分为1494阳性质控品和1555阳性质控品，即带有1494突变或1555突变的人线粒体DNA片段的质粒载体。 

优选的，上述的氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒，所述PCR反应液中引物终浓度为50-500nM，PCR Buffer中的MgCl₂终浓度为1.5-9mM，所述dNTP混合液的各组分终浓度为100-300nM，Taq酶终浓度为1-7.5IU/反应，UNG酶终浓度为0.05-0.3IU/反应。 

优选的，上述的氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒，所述饱和荧光染料为EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料或SYTO 9染料。 

优选的，上述的氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒，所述的PCR 反应液各组分含量为： 

去离子水：16.14μL； 

10×PCR buffer：2.5μL； 

10mM dATP、dCTP、dGTP、dUTP的等体积混合液：2μL； 

10mM dUTP：0.5μL； 

100μM引物A1：0.01μL； 

100μM引物A2：0.01μL； 

100μM引物G：0.04μL； 

100μM引物T：0.03μL； 

100μM引物R：0.02μL； 

20×Evagreen：1.25μL； 

5U/μL超纯Taq酶：0.2μL； 

1U/μL UNG：0.3μL。 

本发明的又一技术方案为提供一种氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测方法，包括如下步骤: 

（1）采用上述任一项所述的试剂盒对样品的模板DNA的目的基因进行PCR扩增； 

（2）对PCR产物的目的基因的突变位点进行熔解曲线分析。 

上述的氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测方法，所述步骤（1）进行PCR扩增反应的条件为： 

50℃、1-10min； 

90-95℃、10min； 

95℃、5-30s，50-65℃、30-90s，30-45个循环。 

优选的，上述的氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测方法，所述步骤（1）进行PCR扩增反应的条件具体为： 

50℃、5min； 

90-95℃、10min； 

95℃、15s，60℃、30s，72℃、30s，35个循环。 

优选的，上述的氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测方法，所述步骤（2）PCR产物进行熔解曲线分析的程序为：70℃-90℃连续检测，15次/s。 

现有的常用方法，如荧光定量PCR法检测基因，仅检测线粒体上单一突变位点，大部分荧光定量PCR法无内标，不能进行质量控制；微阵列态芯片产品操作时间长、成本高、准确度低且需特殊仪器，大规模筛查线粒体基因突变，要求快速、低成本、检测范围广，以上产品无法同时满足。本发明根据氨基糖苷类药物性耳聋易感基因SNP位点，设计特异的PCR引物，使得仅突变模板能扩增，在熔解曲线分析时显示Tm值特征峰，而正常模板只能扩增内控基因，采用多重PCR荧光检测法及熔解曲线分析法，能在同一PCR反应中检测2个氨基糖苷类药物性耳聋易感位点，实现一管操作对线粒体基因突变位点的分型。本发明基因检测无需探针、无需对引物进行特殊修饰，成本低廉，并且检测快速、准确。相比现有方法操作简单，检测范围更广，检测灵敏度更高，切实满足氨基糖苷类药物性耳聋易感基因筛查的需求。 

附图说明

图1：荧光PCR熔解曲线检测线粒体C1494T突变阳性样本的溶解曲线； 

图2：荧光PCR熔解曲线检测线粒体A1555G突变阳性样本的溶解曲线； 

图3：荧光PCR熔解曲线检测线粒体突变阴性样本的溶解曲线。 

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。 

本发明采用等位基因特异性PCR，是利用Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性，当引物的3’端不能与模板完全配对，则PCR扩增不能进行。因此，理想状况下，将引物3’端设计为仅与突变模板匹配，而与正常模板不匹配，此引物即只能扩增突变模板，而对正常模板不扩增，从而达到分型的作用。同时，在引物3’端其他位置，如2、3、4位，引入突变碱基，可以增强引物的特异性，彻底抑制非特异扩增。因此，针对某一位点，可以设计方向相反的两条特异性引物，一 条仅扩增突变模板，另一条仅扩增正常模板，同时设计相配合的上下游引物，使得正常模板的扩增片段长度与突变模板的扩增片段长度有差异，通过电泳时片段大小的差异，可以判断样本的基因型。 

从这一方面来说，等位基因特异性PCR是一种简便易行的基因检测方法，引物不需要昂贵的特殊的标记，操作简便，适用于检测本发明中氨基糖苷类药物致聋易感基因位点的检测。 

不同序列的DNA，Tm值与GC含量，长度和二级结构有关。利用DNA双链嵌合染料可以进行熔解曲线分析，在缓慢升温的过程中，DNA逐渐解链并释放出染料分子，荧光值随即下降，由此可以计算出此DNA链的Tm值，根据Tm值的不同判断扩增片段的性质。 

荧光熔解曲线法能够通过产物Tm值的不同区分不同片段长度的产物，较凝胶电泳法灵敏度更高；同时可以杜绝由于产物开盖引起的PCR产物气溶胶污染。熔解曲线法与等位基因特异性PCR联用，可以制造低成本、简便性和实用性强的诊断试剂盒，极为适合临床诊断和大规模筛查。 

实施例1本发明试剂盒的制备使用 

本发明试剂盒包含PCR反应液及质控品。PCR反应液中包含Taq酶、DNA双链嵌合染料、扩增引物、扩增缓冲液和dN(U)TP等，dN(U)TP即为dNTP混合液。PCR反应程序在荧光PCR仪上运行并读取检测结果。 

1、氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测引物设计 

根据位点特异性引物设计原理，将突变位点设为引物的3’端，并在3’端的第2、3、4位引入点突变以提高特异性。最终从20条引物中筛选出了5条可以使用的位点特异性引物，其中针对1555位点两条，针对1494位点三条。突变位点的位置对引物的特异性至关重要，一些突变位点不能够阻遏引物对正常模板的扩增；或者由于过强的扩增抑制作用，造成突变模板亦不能扩增。要确保筛选得到的引物在一定的扩增系统中仅能扩增突变模板，而对正常模板不扩增。 

同时，筛选10条1494和1555共同的下游的引物，使得C1494T、A1555G突变模板的PCR产物的Tm值能够在熔解曲线分析时分离，Tm值分离才能够通过 判断Tm值达到分型的目的；同时必须避免副产物的发生，副产物会产生非特异的Tm峰值，对结果的判读造成干扰。 

选择基因组上的管家基因beta-actin，作为扩增体系验证的内控。 

最终，选定一条1555位点特异性引物、一条1494位点特异性引物、一条两位点公用的下游引物和一对beta-actin引物。经过筛选后的引物序列如表1所示。 

表1 

2、耳聋位点特异性引物、内控引物以及反应体系其他组分浓度确定： 

各引物终浓度选择50nM-500nM，PCR buffer含有MgCl₂，其终浓度选择1.5mM-9mM，dN(U)TP终浓度选择100nM-300nM，其包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP，Taq酶终浓度选择1-7.5IU/反应，UNG选择0.05-0.3IU/反应，利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系如表2所示。 

表2 

上述表2的PCR反应液中DNA加样量为2μL，总反应体积为25μL，其中dUTP额外多加，增强了扩增效率。 

其中：一对内参beta-actin引物A1和引物A2，所述引物A1的序列为SEQ ID NO:4，所述引物A2的序列为SEQ ID NO:5； 

1555位点特异性引物G，所述引物G的序列为：SEQ ID NO:2； 

1494位点特异性引物T，所述引物T的序列为：SEQ ID NO:1； 

两位点公用的下游引物R，所述引物R的序列为：SEQ ID NO:3。 

3、PCR反应及熔解曲线法反应条件的确定 

本试剂采用含U（尿嘧啶）体系，UNG可以消除产物带来的污染。荧光PCR及熔解曲线分析反应条件分以下步骤优化： 

50℃：1min-10min（UNG作用时间） 

90-95℃：10min（灭活UNG） 

经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应条件为： 

50℃：5min 

95℃：10min 

熔解曲线：70℃-90℃连续检测，15次/s。 

退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会造成非特异性扩增信号，在熔解曲线上显示出产物峰值外地其他熔解峰，对结果判读造成影响。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到无其他副产物，特异性好，扩增效率高，检测DNA模板下限为2ng。 

实施例2本发明试剂盒的使用效果 

1、本发明试剂盒和现有同类技术的比较 

本发明同现有技术相比，建立了一种适用于快速检测和大量筛查的氨基糖苷类抗生素药物性耳聋位点筛查的方法。仅一管反应，可以检测两个在中国人群中流行的线粒体突变位点，避免了繁琐操作，交叉污染，准确度低的问题。 

2、使用本发明试剂盒检测临床样本中C1494T、A1555G突变情况 

利用本试剂盒检测普通人群样本200例，检测临床样本中C1494T、A1555G突变情况，所有样本均采用金标准测序法进行测序验证，本发明试剂盒检测结果和测序结果及对比见表3和表4。 

表3 

表4 

表3，表4的测序结果中阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性，阴性是指本发明试剂盒检测范围之外的其他基因型样本阳性或者阴性。 

本发明试剂盒检测200例临床样本和金标准测序结果对比，漏检0例，准确性为100%；对非本试剂盒检测范围的其他基因型阳性和阴性样本，本试剂盒检测结果均为阴性，灵敏度为100%，特异性为100%。 

本发明试剂盒检测200例临床样本结果和金标准测序结果对比分析统计，见表5，表5为200例临床样本中各基因型测序结果和本试剂盒检测结果符合情况统计。 

表5 

3、本发明试剂盒的性能指标： 

3.1最低检出限：本品能稳定检出的线粒体突变所需的基因组DNA下限为2ng。 

3.2灵敏度：本品检测线粒体突变的灵敏度达98％以上（100例阳性样本，检测结果灵敏度100%）； 

3.3特异性：本品检测线粒体A1555G、C1494T的特异性达98％以上（30 例正常基因型样本重复检测结果均为阴性）； 

3.4重复性：本品检测线粒体A1555G、C1494T的重复性为98％以上（30例阳性样本，实验内、实验间、日间、人员间各重复3次结果全部一致； 

3.5稳定性：本品在有效期内使用完全可满足以上各指标。 

实施例3本发明试剂盒的一具体实施方式 

1、本发明试剂盒主要组成成份如表6所示 

表6 

2、适用仪器 

包括ABI Prism 7300/7500/7700/5700/7000/7900，Roche LightCycler 480等荧光PCR扩增检测仪。 

3、储存条件及有效期 

储存条件：试剂盒避光储存于-20℃。 

有效期：6个月。 

4、样本要求 

(1)样本种类 

干血片、抗凝处理外周血、口腔拭子。 

(1)样本保存 

-20℃保存不超过一年。 

(2)标本运输 

干血片和口腔拭子可常温运输，血液样本加冰密封运输。 

(3)样品量 

检测上限为100ng基因组DNA，下限为2ng基因组DNA，低于2ng会造成扩增极弱。推荐加入样品量为20-30ng DNA，可以达到最佳效果。 

5、样本提取 

针对抗凝全血，推荐使用天根血液基因组DNA提取试剂盒，货号DP319；针对干血片、口腔拭子，推荐使用天根微量样品基因组提取试剂盒，货号DP316。 

6、检验方法 

(1)扩增试剂准备 

从试剂盒中取出PCR反应液置于室温融化并振荡混匀，2000rpm离心10sec。 

设所需要的PCR反应管管数为n，n=待检样本数+1管阴性质控品+2管阳性质控品；将PCR反应液以23μL/管分装n管。 

(2)加样 

向各PCR反应管中分别加入待检样本DNA、阴性质控品DNA和阳性质控品DNA、各定量参考品DNA各2μL，盖紧管盖。短暂离心后置于荧光PCR检测仪中并记录样本摆放顺序。PCR扩增程序如表7所示。 

表7 

7、结果分析条件设定 

选用荧光PCR仪熔解曲线分析模式，仪器可以自动检测产物峰值，或利用手动调节，选取纵轴荧光值（-dF/dT）位置最高点相对应的横轴坐标为Tm值，然后根据此Tm值进行结果判读。 

8、质控标准如表8所示 

表8 

9、检验结果的解释 

Tm值相对应的基因型如表9所示。 

表9 

如出现除特征Tm值之外的峰值，纵轴荧光值（-dF/dT）值低于5（Roche LightCycler 480），则为非特异产物，不影响对结果的判读。 

由于A1555G和C1494T突变同时发生几率极小，在这里没有显示相应的结果。 

请参阅图1、图2、图3，利用实施例3反应条件，图1为荧光PCR熔解曲线检测线粒体C1494T突变阳性样本的溶解曲线；图2为荧光PCR熔解曲线检测线粒体A1555G突变阳性样本的溶解曲线；图3为荧光PCR熔解曲线检测线粒体突变阴性样本的溶解曲线。其中Y坐标轴的荧光值变化为：荧光信号改变的负的一次导数。 

10、检验方法的局限性 

(1)、本品为定性试剂盒，不进行定量测定。 

(2)、本品仅对检测范围内的2种线粒体基因型进行判断，无法对检测范围外的其它基因型进行检测。 

(3)、样本的交叉污染可能导致假阳性结果的产生。 

(4)、提取核酸中含有PCR抑制物（如肝素），可能会导致扩增失败，或假阴性结果产生。 

(5)、核酸浓度不宜低于2ng/uL，不宜高于100ng/uL。 

11、本发明有益效果 

（1）最低检出限：能稳定检出的线粒体突变所需的基因组DNA下限为2ng; 

（2）灵敏度：检测线粒体突变的灵敏度达98％以上（100例阳性样本，检测结果灵敏度100%）； 

（3）特异性：检测线粒体A1555G、C1494T的特异性达98％以上（30例正常基因型样本重复检测结果均为阴性）； 

（4）重复性：检测线粒体A1555G、C1494T的重复性为98％以上（30例阳性样本，实验内、实验间、日间、人员间各重复3次结果全部一致； 

（5）稳定性：在有效期内使用完全可满足以上各指标。 

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。 

序列表 

SEQUENCE LISTING 

<110>亚能生物技术（深圳）有限公司 

<120>氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒及方法 

<160>5 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

tacacaccgc ccgtgact                                       18 

<210>2 

<211>23 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

cctacgcatt tatatagagg tcg                       23 

<210>3 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

gtccaagtgc actttccagt a                         21 

<210>4 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

gtggacatcc gcaaagac                             18 

<210>5 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

gaaagggtgt aacgcaact                            19