非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治疗剂

摘要

本发明提供一种能用于非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治疗的化合物。一种非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治疗剂，其有效成分为2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐或它们的溶剂合物。

说明书

技术领域

本发明涉及非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治疗剂。

背景技术

作为2型糖尿病等所谓的生活习惯病的概念，代谢综合症（内脏脂 肪综合症）受到关注。代谢综合症定义为除了内脏脂肪型肥胖以外，还 兼具高血糖、高血压、脂肪异常中的任意2种以上的状态，代谢综合症 会促进动脉硬化、增加心肌梗塞和脑梗塞的发病危险性。

非醇性脂肪性肝疾病（nonalcoholic fatty liver disease，以下记为 NAFLD）是并非由于饮酒或明确的原因（病毒或自身免疫等）引起的脂 肪性肝病，近年被确认为是代谢综合症在肝中的表现形式，除此之外， 还报道了妨害脂肪代谢或线粒体代谢的各种病因。NAFLD进一步被分类 为仅由于肝细胞的脂肪沉积而引起的、相对来说预后良好的单纯性脂肪 肝（simple steatosis）和有时会引起肝组织的纤维化、肝应变、肝细胞癌 的非醇性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，以下记载为NASH） （非专利文献1）。

作为NASH的产生机理，众所周知的有Day等的“two hit theory” （非专利文献2）。即，在脂肪肝的形成过程（1st hit）中，卡路里的摄 取及消耗平衡的不均衡、基于胰岛素抵抗性的代谢异常导致脂肪在肝细 胞中积存参与了脂肪肝的形成。在脂肪肝发展成NASH的过程中，还会 进行2nd hit，基于能量代谢负荷的氧化压力的增大及伴随与此的自然免 疫系统的刺激作用扮演了重要的作用。此外，作为使NASH病情恶化的 因素，已知的有作为代表性的炎症性细胞因子的TNF－α。根据肝组织 中TNF-α表达的研究报告，与NASH以外的肥胖患者（包括单纯性脂 肪肝）相比，获得了NASH患者的TNF－α表达明显上升的结果。此外， 在NASH患者中，伴随有脂肪纤维化的情况，与没有伴随脂肪纤维化的 情况相比，TNF－α表达明显上升。这样，报道了在NASH患者中，主 要浸润在肝组织中的巨噬细胞和活性化T淋巴球分泌的TNF－α与坏死 性的炎症活性（necroinflammatory activity）及纤维化有很强的相关（非 专利文献3）。

此外，报道了在NASH模型鼠的肝脏中，发现巨噬细胞异常增加（非 专利文献4）。

NASH的治疗基本上是针对肥胖、糖尿病、脂肪异常症、高血压这 些生活习惯病，以饮食、运动疗法为主体对生活习惯进行改善。然而， 实际上很难改善生活习惯，以被认为是NASH发展的重要因素的胰岛素 抵抗性、氧化压力、脂肪代谢异常、高血压等为标的，开始进行药物治 疗。作为改善胰岛素抵抗性的药物，可以将作为与胰岛素敏感性增强作 用有关的核受体PPARγ的配体的噻唑烷类衍生物（吡格列酮或罗格列酮 等）、或胰岛素抵抗性改善药的双胍类药物（二甲双胍等）用作治疗药物， 在该治疗药物中作为抗氧化剂，可以单独使用维生素E或将维生素E与 维生素C联用。此外，作为脂肪代谢异常的治疗剂，期待将作为PPAR α激动剂的贝特类药物（非诺贝特或苯扎贝特等）、抑制素类制剂、普罗 布考等分别作为治疗药物。作为高血压治疗剂，期待将血管紧张素II型 1受体拮抗剂（ARB）作为治疗药物。尤其是在贝特类药剂和抑制素类 药剂中，从这些药剂也具有抗炎作用方面来看，也期待这些药剂作为治 疗药物。然而，证据水平高的报告很少，推荐度高的治疗方法也没有确 立。在世界上，代谢综合症的患病者持续增加，因此NASH的患者数量 预计今后也会增加，期望确定治疗方法（非专利文献1、5）。

另一方面，在专利文献1中记载了由下述化学式（1）表示的化合物、

[化学式1]

它们的盐或它们的溶剂合物，具有酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶 （ACAT）抑制作用，可以用作ACAT抑制剂、细胞内胆固醇输送抑制剂、 血中胆固醇降低剂、巨噬细胞泡沫化抑制剂，可以用作高血脂症、动脉 硬化症、颈部和脑动脉硬化症、脑血管障碍、缺血性心脏病、冠状动脉 硬化症、肾硬化症、动脉硬化性肾硬化症、细动脉硬化性肾硬化症、恶 性肾硬化症、缺血性肠病、急性肠管膜血管闭塞症、慢性肠绞痛、缺血 性大肠炎、大动脉瘤和闭塞性动脉硬化症（ASO）等疾病的治疗剂。此 外，在专利文献（2）中记载了由下述化学式（2）表示的

[化学式2]

2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－二 （甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺其盐或它们的溶剂合物，并 且记载了该化合物能够使作为粥状动脉硬化病灶的、不稳定且容易破裂 的富含脂质的斑块稳定，能用于防止伴随富含脂质的斑块的破裂而形成 血栓、急性冠状动脉综合症（ACS）的预防和/或治疗、急性心肌梗塞的 预防和/或治疗、不稳定心绞痛的预防和/或治疗、末梢动脉闭塞症的预防 和/或治疗。然而，在所有的专利文献中，均没有记载和启示所述的化合 物对NASH能产生什么作用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：PCT公开WO1998/054153号小册子

专利文献2：PCT公开WO2005/020996号小册子

非专利文献

非专利文献1：Nugent C et al.,Nat.Clin.Pract.Gastroenterol.Hepatol., 8,432-41(2007)

非专利文献2：Day CP,et al,Gastroenterology,114,842-845(1998)

非专利文献3：Crespo J,et al.,Hepatology,34,1158-63(2001)

非专利文献4：Kudo H,et al.,Liver Int.,29,988-996(2009)

非专利文献5：宇都浩文及其他，最新医学,97,1683-87(2008)

发明内容

本发明要解决的技术问题

在全世界范围内，代谢综合症的患病者正在持续增加，NASH的患 者数量今后预计也会增加，对于NASH的治疗，现状是证据水平高的报 告少，推荐度高的治疗方法也尚未确立。

本发明的目的是提供一种对非醇性脂肪性肝炎（NASH）的预防和/ 或治疗有用的新的非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治疗药剂。

解决技术问题的技术方案

本发明人为了发现对非醇性脂肪性肝炎（NASH）的预防、治疗有 用的化合物，使用作为NASH模型动物的LDL受体基因剔除小鼠，对非 醇性脂肪性肝炎的预防、治疗有用的化合物进行了搜寻，完全出人意料 地发现2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－ [2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其盐对血浆脂质 没有影响，能直接作用于肝脏，特定地降低肝脏中的胆固醇和甘油三酯， 能够抑制作为NASH的特征病态的脂肪肝和肝的炎症，从而完成了本发 明。

即，本发明提供一种非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治疗剂，其有效 成分为2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－ [2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐或它 们的溶剂合物。

此外，本发明还提供一种肝脏中的胆固醇降低剂，其有效成分为2 －[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－二（甲 基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐或它们的溶剂合 物。

此外，本发明还提供一种肝脏中的甘油三酯降低剂，其有效成分为 2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－二 （甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐或它们的溶剂 合物。

此外，本发明还提供一种肝脏中的TNF－α表达抑制剂，其有效成 分为2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4 －二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐或它们的 溶剂合物。

此外，本发明还提供一种肝脏中的巨噬细胞降低剂，其有效成分为 2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－二 （甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐或它们的溶剂 合物。

此外，本发明还提供一种非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治疗方法， 其特征在于，向需要的患者给予有效量的2－[4－[2－（苯并咪唑－2－ 基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－ 吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐或它们的溶剂合物。

此外，本发明还提供一种用于制造非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治 疗剂的、2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－ [2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐或它 们的溶剂合物的用途。

发明效果

本发明提供了一种非醇性脂肪性肝炎（NASH）的新的预防和/或治 疗剂。

非醇性脂肪性肝炎（NASH）的证据水平高的治疗剂的报告少，推 荐度高的治疗方法也尚未确立，预计在全世界，患者的数量今后会增加， 因此期望确立非醇性脂肪性肝炎的治疗方法。本发明提供了一种新的非 醇性脂肪性肝炎（NASH）的预防和/或治疗剂，其对血浆脂质没有影响， 能直接作用于肝脏，能够特定地降低肝脏中的胆固醇和甘油三酯，还能 显著抑制肝脏中的TNF－α表达，并能使肝脏中的巨噬细胞显著减少。

附图说明

图1是分别表示在实施例1中，给予本发明的化合物A（3mg/kg） 时的血浆中的总胆固醇（TC）（图1的A）、和血浆中的甘油三酯（TG） （图1的B）的图。

图2是分别表示在实施例1中，给予本发明的化合物A（3mg/kg） 时的肝脏中的总胆固醇（TC）（图2的A）、和肝脏中的甘油三酯（TG） （图2的B）的图。

图3是分别表示在实施例1中，给予本发明的化合物A（3mg/kg） 时的肝脏中的炎症性M1巨噬细胞标记（CD11c）的基因表达量（图3 的A）、和肝脏中的炎症性细胞因子（TNF－α）的基因表达量（图3的 B）的图。

图4表示正常小鼠组、C57BL/6N-NASH小鼠（对照组）、和向 C57BL/6N-NASH小鼠给予化合物A后的组的血浆ALT值。

图5表示正常小鼠组、C57BL/6N-NASH小鼠（对照组）、和向 C57BL/6N-NASH小鼠给予化合物A后的组的肝脏中的TC含量。

图6表示正常小鼠组、C57BL/6N-NASH小鼠（对照组）、和向 C57BL/6N-NASH小鼠给予化合物A后的组的肝脏中的TG含量。

图7表示对正常小鼠组、C57BL/6N-NASH小鼠（对照组）、和向 C57BL/6N-NASH小鼠给予化合物A后的组的各自肝脏组织（HE染色） 分别进行拍照的结果。原图是彩色照片。图7中的→表示脂肪滴。

图8表示喂食MCD的KKA^y小鼠的对照组和向喂食MCD的KKA^y小鼠给予化合物A后的组的血浆ALT值。

图9表示喂食MCD的KKA^y小鼠的对照组和向喂食MCD的KKA^y小鼠给予化合物A后的组的肝TC含量。

图10表示喂食MCD的KKA^y小鼠的对照组和向喂食MCD的KKA^y小鼠给予化合物A后的组的肝TG含量。

图11表示对喂食MCD的KKA^y小鼠的对照组和喂食MCD的KKA^y小鼠给予化合物A后的组的肝脏组织（HE染色）进行拍照的结果。原 图为彩色照片。

图12表示喂食MCD的KKA^y小鼠的对照组和向喂食MCD的KKA^y小鼠给予化合物A后的组的肝脏组织（Azan染色）进行拍照的结果。原 图为彩色照片。

具体实施方式

本发明中使用的2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－ 1－基]－N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸 加成盐、或它们的溶剂合物可以根据例如PCT公开WO1998/054153号小 册子、PCT公开WO2005/020996号小册子、PCT公开WO2004/076441 号小册子中记载的方法制造。此外，还可以按照这些文献中记载的方法 进行制剂化。

作为本发明的形成酸加成盐的酸，只要是药学上可接受的物质，就 没有特别的限定，可以列举例如硫酸、盐酸、硝酸、磷酸、氢溴酸等无 机酸；乙酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、富马 酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等有机酸等。作为优选的酸，可以列举无机酸， 作为更优选的酸，可以列举盐酸。

作为本发明的溶剂合物，可以列举水合物、醇合物（例如乙醇合物） 等。优选可以列举水合物。

作为本发明的2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1 －基]－N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸 加成盐、或它们的溶剂合物，优选可以例举2－[4－[2－（苯并咪唑－2 －基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3 －吡啶基]乙酰胺单盐酸盐。

在非醇性脂肪性肝炎（NASH）中，已知不仅肝脏中的TC和TG会 增加，肝脏中的炎症性细胞因子TNF－α表达量也会增加（参见非专利 文献3）、此外肝脏中的巨噬细胞也会增加（参见非专利文献4）。

如后述实施例所示，本发明的2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基） 乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基] 乙酰胺或其酸加成盐、或它们的溶剂合物，在作为NASH模型动物的雄 性LDL受体基因剔除小鼠中，在不会对血浆中的TC和TG产生显著影 响的用量下，能显著降低肝脏中的TC和TG，能显著减少肝脏中的炎症 性细胞因子TNF－α表达，并能显著减少肝脏中的巨噬细胞CD11c。尤 其是在不会对血浆中的TC和TG产生显著影响的用量下，能够显著降低 肝脏中的TC和TG（参见图1和图2），该结果显示出本发明的有效成分 通过与以往所报告的作用不同的作用，直接作用于肝脏，是基于通过本 发明首先发现的作用而产生的结果。

因此，2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N －[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐、 或它们的溶剂合物能用作包括人类的哺乳类的非醇性脂肪性肝炎的预防 和/或治疗剂。

本发明以2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基] －N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其酸加成盐、 或它们的溶剂合物作为有效成分，如后述实施例所示，本发明的有效成 分不仅能用作包括人类的哺乳类的非醇性脂肪性肝炎的预防和/或治疗 剂，还能用作包括人类的哺乳类的非醇性脂肪性肝疾病（NAFLD）的预 防和/或治疗剂。

此外，如后述实施例所示，本发明的有效成分可以用作包括人类的 哺乳类的肝脏中的胆固醇降低剂、肝脏中的甘油三酯降低剂、肝脏中的 TNF－α表达抑制剂、以及肝脏中的巨噬细胞降低剂。

本发明的药物可以单独使用，也可以使用其他药学上可接受的溶解 剂、赋形剂、粘合剂、稀释剂等载体，形成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉 末剂、洗剂、软膏剂、注射剂、栓剂等剂型。这些制剂可以通过公知的 方法制造。例如，在制造经口给药用制剂的情况下，可以通过适当组合 黄芪胶、阿拉伯树胶、蔗糖酯、卵磷脂、橄榄油、大豆油、PEG400等溶 解剂；淀粉、甘露醇、乳糖等赋形剂；羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素 等粘合剂；结晶纤维素、羧甲基纤维素钙等崩解剂；滑石、硬脂酸镁等 润滑剂；轻质硅酸酐等流动性提高剂；玉米淀粉等稀释剂等形成配方来 制造。

本发明的药物可以通过经口给药或非经口给药进行给药。本发明的 药物给药量根据患者的体重、年龄、性别、症状等有所不同，在普通成 人的情况下，作为2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1 －基]－N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺，一日 分1至3次给药0.01～1000mg，优选一日分1至3次给药0.1～200mg。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不受实 施例的任何限定。

实施例1 对LDL受体基因剔除小鼠NASH模型的作用

对本发明对已知产生作为NASH特征病态的脂肪肝和肝的炎症的、 喂食Western diet的LDL受体基因剔除小鼠（Yoshimatsu M.et al.Int J Exp  Pathol.,85(6),335-43(2004)）的效果进行了研究。另外，在本试验中，使 用2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫基）乙基]哌嗪－1－基]－N－[2,4－ 二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺单盐酸盐（以下称为化合 物A）。

1）使用的动物：

在实验中使用了雄性LDL受体基因剔除小鼠（B6. 129S7-Ldlr<tm1Her>/J、Jackson Laboratories）。从8周左右开始连续12 周，作为Western diet，让实验中使用的上述小鼠自由摄取Teklad Custom  Research Diet（Harlan Teklad公司，TD.88137），从而使实验中使用的上 述小鼠患上了NASH。

2）组构成：

在组之间，以使体重没有差别的方式将组分为对照组（盐酸加纯净 水）和给予了化合物A 3mg/kg（作为游离体的形式）的给药组。

3）药物给药：

给药容量为10mL/kg体重，对于对照组，以6个小时以上的间隔， 在午前、午后各1次经口给予盐酸加纯净水。对于化合物A给药组，以 6个小时以上的间隔，在午前、午后各1次经口给予各自的药液。在从8 周前后开始喂食Western diet的同时开始给药，给药时间为12周。

4）观察和检查方法

在给药结束后，让小鼠绝食1晚，在用戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉 下，从腹部大静脉采血，分离出血浆。在采血后取出肝脏，冷冻保存。 将一部分在用于基因表达分析的ISOGEN（ニッポンジ－ン（株））中冷 冻保存。

血浆中的总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）分别使用コレステロー ルＥ－テストワコー和トリグリセライドＥテストワコー（均为和光纯 药工业（株））进行了测定。如下所述地实施了肝脂质的测定。在冷冻保 存的肝脏中加入氯仿：甲醇（2：1），进行均质处理（homogenize），在4℃ 下静置1晚以上，然后进行过滤。分离出一部分滤液，使滤液蒸发干燥 后，用异丙醇溶解，分别用コレステロールＥ－テストワコー和トリグ リセライドＥテストワコー测定了TC和TG的浓度。

肝基因的表达分析通过如下所述的方式进行：从肝脏提取RNA，通 过实时RT－PCR分别测定了TNF－α的基因、及属于巨噬细胞的整合素 家族的粘附分子中的CD11c的基因的各自的表达。RNA提取是将肝脏在 ISOGEN中均质化后，按照说明书进行的。RNA的浓度使用分光光度计 （ND－1000、NanoDrop Technologies）进行了测定。使用High Capacity  cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems），从总RNA逆转印 mRNA，合成了cDNA。基因表达分析通过采用了SYBR green I的嵌入 法或使用了Taqman Probe的方法进行，使用7900HT Fast实时PCR系统 （Applied Biosystems），进行了实时RT－PCR。作为内部标准，使用β －肌动蛋白，利用β－肌动蛋白进行修正，比较了各基因的表达量。使 用的引物和探针的序列如下所示。

β－肌动蛋白：

forward（5’－AGCCATGTACGTAGCCATCCA－3’）、

reverse（5’－TCACCGGAGTCCATCACAATG－3’）、

probe（VIC5’－TGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCAC－3’ TAMRA）、

CD11c：

forward（5’－CTGGATAGCCTTTCTTCTGCTG－3’）、

reverse（5’－GCACACTGTGTCCGAACTC－3’）、

TNF－α：

forward（5’－CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA－3’）、

reverse（5’－TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC－3’）、

统计处理使用Windows（注册商标）版SAS前临床包（SAS Institute  Japan）进行。

5）结果

如图1所示，化合物A的3mg/kg给药组没有对血浆中的TC和TG 产生显著的影响，但显示出肝脏中TC和TG显著降低（图2）、肝脏中 的炎症性细胞因子TNF－α的表达和巨噬细胞CD11c显著减少（图3）。 即，本发明的化合物A即使在对血浆脂质没有影响的用量下，也能直接 作用于肝脏，降低肝脏中的胆固醇和甘油三酯，此外，可以抑制作为 NASH特征病态的脂肪肝和肝的炎症。由此，确定了本发明的化合物A 能用作NASH的预防和/或治疗药物。

实施例2 对NASH－肝癌模型小鼠的作用

NASH－肝癌模型小鼠（商品名称C57BL/6N－NASH小鼠）是由株 式会社ステリック再生医科学研究所开发（参照日本专利公开公报特开 2009－178143号）、由日本チャ－ルスリバ－株式会社销售的小鼠。该模 型小鼠会由于被喂食引起胰岛素抵抗性和高脂肪的食物，而患上NASH。 此外，该模型小鼠在组织学上显示出反应人类NASH病态的变化，从脂 肪肝（6周以前）、发展至NASH（7周）、肝硬化（10周以后），进而发 展至肝癌（16周以后），因此被认为是对NASH治疗药物的研发有用的 小鼠（参见STAM Mice C57BL/6N－NASH模型小鼠资料 （http://www.crj.co.jp/topics/pdf/69/6375030/B6N_NASH_leaflet_091019.p df））。

因此，与实施例1中使用的基因剔除小鼠相比，使用病症更严重的 该NASH－肝癌模型小鼠，对化合物A的作用进行了研究。

1）使用的动物

在实验中使用雄性C57BL/6N－NASH小鼠（日本チャ－ルスリバ －）。该小鼠在出生后1－2天被给予链脲佐菌素（ストレプトゾトシン）， 从4周开始喂食高脂肪食物（D12492，Research Diet公司），在该小鼠6 周时购入该小鼠，接着继续喂食同样的高脂肪食物（以下将该小鼠称为 C57BL/6N－NASH小鼠）。此外，作为正常对照组，同时购入正常小鼠 （C57BL/6N、6周、日本チャ－ルスリバ－），用普通食物（CE－2、日 本クレア）喂养（以下，将该小鼠称为正常小鼠）。

2）组构成：

将C57BL/6N－NASH小鼠作为对照组和给予化合物A的组 (100mg/kg)。各组均为6只。此外，作为小鼠的正常对照组，使用6只正 常小鼠（C57BL/6N小鼠）。

3）药物给药：

将化合物A与食物混合进行给药。给药从已患上NASH的C57BL/6N －NASH的7周小鼠开始，给药期为5周。

4）观察和检查方法：

在给药结束后，让小鼠绝食4小时，在麻醉下，从腹部大静脉取血， 分离出血浆。在取血后，取出肝脏。一部分冷冻保存，一部分如常规方 法那样，用石蜡包埋。使用自动分析装置（Labospect003、日立）测定了 血浆脂质、血浆ALT。肝脂质的测定如下所述地进行，。即：在冷冻保存 的部分肝脏中加入氯仿：甲醇（2：1），进行均质化，在4℃下静置1晚 以上，然后过滤。分离出部分滤液，使滤液蒸发干燥后，用异丙醇溶解， 分别用コレステロールＥテストワコー和トリグリセライドＥテストワ コー，测定了总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的浓度。另外，为了观 察肝组织，制作了石蜡切片，并制备了HE染色标本。

5）结果

所述的结果在图4～图7中示出。

化合物A对血浆脂质没有影响。作为肝病指标的血浆ALT，与正常 小鼠相比，NASH－肝癌模型小鼠对照组显示出高值，但化合物A的 100mg/kg使血浆ALT降低了（图4）。肝中TC和TG与正常小鼠相比， NASH－肝癌模型小鼠对照组也显示出高值，但化合物A使肝中TC和 TG降低了（图5和图6）。此外，化合物A抑制了在NASH－肝癌模型 小鼠的对照组中确认到的、作为NASH特征病态的肝脂肪滴沉积（图7 中的箭头所示）（图7）。即，即使在患上NASH后开始给予本发明的化 合物A，也能在不对血浆脂质产生影响的用量下，直接作用于肝脏，降 低肝脏中的胆固醇和甘油三酯。此外，不仅能降低作为肝病指标的血浆 ALT，还能抑制作为NASH特征病态的脂肪肝。由此，确定了本发明的 化合物能用作NASH的治疗药。

实施例3 对喂食MCD的KK－A^y小鼠的作用

在啮齿类中，喂食蛋氨酸－胆碱缺乏食物（MCD食物）的小鼠，作 为NASH的模型得到通用（参见Hebbard L,George J.:Animal models of  nonalcoholic fatty liver disease Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2011 Jan; 8(1):35-44.Epub 2010 Nov 30.）。其中，使用了KK－A^y小鼠的模型，已 知会产生显著的脂肪肝炎和纤维化（参见Okumura K.,Ikejima K.,Kon K., Abe W.,Yamashina S.,Enomoto N.,Takei Y.and Sato N.(2006) Exacerbation of dietary steatohepatitis and fibrosis in obese,diabetic KK－ Ay mice Hepatology Research 200636:3(217-228)）、认为使用了KK－A^y小鼠的模型是研究药物对NASH作用的优异的模型。

因此，研究了化合物A对该模型的作用。

1）使用的动物

在实验中使用了雄性KK－A^y小鼠（KK－A^y/TaJcl，12周，从日本 クレア购入）。喂食7周MCD食物，使实验中使用的小鼠患上NASH。

2）组构成

分为对照组、化合物A的30mg/kg给药组、和化合物A的200mg/kg 给药组。将药物与食物混合进行了给药。给药时间为7周。

3）药物给药：

将化合物A与食物混合进行给药。给药与喂食MCD同时开始。

4）观察和检查方法：

与实施例2中记载的NASH－肝癌模型小鼠同样进行了观察和检查， 除了肝组织观察HE染色标本以外，还制备了Azan染色标本。

5）结果

所述的结果在图8～图12中示出。

化合物A对血浆脂质没有影响。化合物A 200mg/kg使作为肝病指标 的血浆ALT显著降低（参见图8）。化合物A使肝中的TC和TG显著降 低（参见图9和图10）。此外，化合物A抑制了作为NASH特征病态的 肝的脂肪滴沉积和纤维化（参见图11和图12）。即，本发明的化合物A 在不影响血浆脂质的用量下，能直接作用于肝脏，降低肝脏中的胆固醇 和甘油三酯。此外，不仅能降低作为肝病指标的血浆ALT，而且能抑制 作为NASH特征病态的脂肪肝、肝的纤维化。由此，确定了本发明的化 合物A能用作NASH的预防和/或治疗药物。

工业实用性

本发明首次发现了2－[4－[2－（苯并咪唑－2－基硫代）乙基]哌嗪 －1－基]－N－[2,4－二（甲基硫基）－6－甲基－3－吡啶基]乙酰胺或其 酸加成盐、或它们的溶剂合物具有选择性地使肝脏的总胆固醇和甘油三 酯降低的作用，具有抑制肝脏中的炎症性细胞因子的表达和减少炎症性 巨噬细胞的作用，提供了一种低分子性的非醇性脂肪性肝炎的预防和/或 治疗剂。本发明由于能用作医药原料，因此在制药工业中是有用的，具 有工业上的可利用性。