芝麻栽培种与Sesamum radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法

摘要

本发明公开了一种芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法，属生物技术领域。通过提取栽培种（Sesame indicum L.,2n=26）、野生种（Sesame radiatum,2n=64）及杂交后代F1的基因组DNA，进行PCR扩增和凝胶电泳检测，根据是否能够同时扩增出亲本的特异性条带判定远缘杂交F1代的真假。本发明建立的芝麻远缘杂交后代的分子鉴定方法，解决了芝麻远缘杂交育种研究过程中的远缘杂种鉴定周期长、准确率低等难题，填补了我国芝麻远缘杂交育种技术的空白。利用该方法可以高效快速地鉴定芝麻远缘杂交后代F1，为芝麻抗病新品种育种奠定了材料和技术基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物杂交后代的分子鉴定方法，特别是涉及一种芝麻栽培种（2n=26）与野生种（Sesame radiatum，2n=64）远缘杂交后代的分子鉴定方法，属于生物技术领域。 

背景技术

芝麻（Sesame indicumL.，2n=26）属胡麻科胡麻属，是世界上最古老的特色油料作物之一。芝麻在我国已有三千多年的栽培历史，因品质优良，在国际生产和贸易中占有重要地位。然而，由于芝麻抗病耐渍性较差，易受环境条件的影响，产量的稳产性不佳。近二十年来，开展高产稳产抗病抗逆新品种选育一直是我国芝麻遗传育种的一项重点任务。 

芝麻野生种（Sesame radiatum，2n=64）具有较好的抗病抗逆特性，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，是提高芝麻品种抗性特征的重要技术途径。但是由于芝麻远缘杂交不具有亲和性，后代几乎不能自交结实，目前只能采用幼胚拯救培养、组培苗移栽方式获得远缘杂交后代。在远缘杂交后代鉴定方面，受研究技术限制，目前仅采用外观形态、生物学等鉴定方法判断芝麻远缘杂交F1代的真伪。研究发现，与实生苗不同的是，芝麻远缘杂交后代组培苗之间在外观形态方面差异不明显，但与亲本的差异都很显著。因此选用外观形态、生物学等方法对远缘杂交后代进行鉴定，结果可靠性较差，且鉴定周期较长。因此，目前急需建立一种快速稳定高效的芝麻远缘杂交后代的鉴定方法，为完善芝麻远缘杂交育种技术、加快芝麻远缘杂交育种步伐提供技术支撑。 

DNA是生物的遗传物质，DNA的多态性是生物多样性的本质内容。目前，随着分子标记技术的不断发展和广泛应用，国内外在植物杂交育种的后代鉴定中越来越多的应用各种分子标记技术，如RAPD、ISSR、AFLP、SSR等分子标记。与常规育种相比，分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，也不存在表达与否等问题。其中，SSR标记由于其多态性高、共显性和稳定性好、染色体位置清楚而得到了广泛应用，紧密连锁的SSR标记可用于标记辅助选择和联合育种，在应用分子标记进行杂交后代真实性的鉴定过程中特异性的引物是关键所在。 

发明内容

本发明的目的是提供一种芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法。 

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是： 

检测芝麻远缘杂交后代的SSR引物，包括： 

引物对HS209 

正向引物序列：5’-GCAAGAAGCCGACATGTTTA-3’（Tm=53.35℃） 

反向引物序列：5’-ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3’（Tm=55.4℃）。 

上述引物用于芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法，具体步骤如下： 

（1）挑选饱满健康的芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种种子，6月播种后于7月下旬植株进入花期，进行人工授粉杂交，采用组织培养方法对杂交后代幼胚进行培养，获得远缘杂交F1后代； 

（2）提取步骤（1）中芝麻栽培种（Sesame indicum L.,2n=26）、野生种（Sesame radiatum,2n=64）及杂交后代F₁基因组DNA，作为模板备用； 

（3）将步骤（2）提取的DNA模板应用于PCR反应体系，运行PCR扩增程序，在引物对HS209的引导下，得到PCR反应产物； 

（4）将步骤（3）的PCR反应产物进行凝胶电泳检测，检测结果有栽培种特异性条带210bp和野生种特异性条带200bp、230bp的为真杂种；其余则为假杂种。 

所述的芝麻亲本及杂交后代基因组DNA的提取方法：采取CTAB提取法，取植株叶片，加入预冷的提取缓冲液，研磨，4℃离心，弃上清，于沉淀中加入预热的裂解缓冲液，65℃水浴，加入氯仿/异戊醇混合液，混匀，15℃离心，取上清，加预冷的异丙醇，混匀，静置，离心，弃上清，于沉淀中加入乙醇洗涤，离心，倒掉上清后干燥，加TE缓冲液，4℃溶解DNA30min以上，于20℃保存备用。 

所述的提取缓冲液包括：0.35M Glucose，0.1M Tris-HCl，5mM Na-EDTA，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量为无菌超纯水，4℃保存。 

所述的裂解缓冲液包括：1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na-EDTA，2%CTAB，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量为无菌超纯水，室温保存。 

所述的TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)，余量为无菌超纯水。 

所述的PCR反应体系为：DNA模版50ng，10×Buffer 1μL，10mmol·L-1dNTPs 0.2μL，10μg·L-1引物对HS2091μL，2.5U·μL-1Taq DNA polymerase 0.5μL，加入无菌超纯水至 终体积10μL。 

所述的PCR扩增程序为：94℃变性3min，94℃变性l min，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，72℃总延伸10min；4℃保存。 

所述的凝胶电泳检测为：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度10%，电泳缓冲液为1×TBE，150V恒压电泳2小时，电泳结束后，凝固定先胶，再银染，漂洗，显色，漂洗凝胶后记录读取数据。 

本发明的有益效果： 

（1）HS209SSR标记为自主开发的种间特异性标记（GenBank,JP643611），结果稳定可靠。 

（2）试验开展不受芝麻生产季节限制，可以以芝麻幼苗叶片为材料，用材少、周期短，材料的预处理及试验操作步骤简便易行。 

（3）采用SSR标记技术对野生种与栽培种芝麻的远缘杂交后代进行鉴定，填补了芝麻远缘杂交后代分子生物学鉴定技术的空白。与流式细胞仪细胞学检测方法相比，该方法不需要基因组参照材料，数据更加稳定可靠；此外，本发明技术要点均属常规生物学技术方法，成本低，在短时间内可完成大批试验材料的鉴定。可广泛用于今后的芝麻种质创新、远缘杂交育种等研究。 

附图说明

图1远缘杂交后代组培苗F₁田间长势； 

图2亲本与芝麻远缘杂交后代的SSR标记鉴定电泳图； 

注：1：Marker DL2000；2：豫芝11；3：野芝1号；4：真杂种F1No.IH 07；5：真杂种F1No.IH25；6：假杂种F1No.IH 01；7：假杂种F1No.IH 13。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细说明，但不构成对本发明的任何限制。 

实施例 

本实施例用于芝麻豫芝11号（Sesame indicum L.,2n=26）和野芝1号（Sesame radiatum,2n=64）杂交F₁代的鉴定，具体操作步骤如下： 

（1）远缘杂交亲本及后代培养：挑选饱满健康的芝麻豫芝11号（Sesame indicum L.,2n=26）和野芝1号（Sesame radiatum,2n=64）种子，6月播种后于7月下旬植株进入花期，进行人工授粉杂交。采用组织培养方法对杂交后代幼胚进行培养，获得远缘杂交后代F₁共4株（图1）； 

（2）提取芝麻豫芝11号、野芝1号及杂交后代F₁基因组DNA，作为模板备用； 

基因组DNA的提取采取CTAB小量提取法： 

a.取亲本、远缘杂种F1后代各2-3片嫩叶，加入600μl预冷的新鲜配制的提取缓冲液，电转研磨，再于5000rpm 4℃离心20min，弃上清； 

b.于沉淀中加入600μl 65℃预热的裂解缓冲液，65℃水浴30min，期间翻转混匀2-3次； 

c.加入800μl氯仿/异戊醇（氯仿:异戊醇为24:1）混合液，翻转50次以上，9000rpm15℃离心20min，将上清转入1.5ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，9000rpm离心10min（RT），弃上清，于沉淀中加入1ml 70%的乙醇洗涤，1000rpm离心2min，倒掉上清液，通风干燥20min； 

d.加30μl TE缓冲液，4℃溶解DNA30min以上，-20℃保存备用。 

提取缓冲液包括：0.35M Glucose，0.1M Tris-HCl，5mM Na-EDTA，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量为无菌超纯水，4℃保存。 

裂解缓冲液包括：1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na-EDTA，2%CTAB，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量为无菌超纯水，室温保存。 

TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)，余量为无菌超纯水。 

（3）将步骤（2）提取的DNA模板应用于PCR反应体系，运行PCR扩增程序，在引物对HS209的引导下，得到PCR反应产物； 

PCR反应体系为：DNA模版50ng，10×Buffer 1μL，10mmol·L^-1dNTPs 0.2μL，10μg·L^-1引物对HS2091μL，2.5U·μL^-1Taq DNA polymerase 0.5μL，加入无菌超纯水至终体积10μL）。 

PCR扩增程序为：94℃变性3min，94℃变性l min，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，72℃总延伸10min；4℃保存。 

（4）将步骤（3）的PCR反应产物进行凝胶电泳检测。 

凝胶电泳检测为：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度10%，凝胶大小180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液为1×TBE，150V恒压电泳2小时。电泳结束后，将凝胶先固定（10%乙醇、0.5%冰乙酸）6分钟；之后0.2%的硝酸银水溶液渗透银染12分钟；蒸馏水漂洗2分钟两次后，于1.5%氢氧化钠和0.4%甲醛混合溶液中适度显色；最后清水漂洗凝胶并记录读取数据。 

鉴定结果 

利用HS209引物在父本豫芝11亲本扩增出了1条特异带（210bp），在母本野芝1号 亲本上扩增出2条特异带（分别为200bp和230bpp）。根据基因重组原理，真正的远缘杂交后代F1应同时具有两亲本特异条带。分析上述PCR结果可知，No.IH 07、25同时具有豫芝11号与野芝1号的特异性条带。因此，判定No.IH 07、25为豫芝11号与野芝1号真正的远缘杂交后代。No.IH 01、13与母本相同，为假的后代（图2）。 

为验证上述技术鉴定结果的可靠性，同时对远缘杂交后代F1进行生物学方法和流式细胞DNA含量测定的鉴定。 

1.生物学方法 

远缘杂交后代F₁组培移栽植株间的生物学性状较为相似，苗期不易区分，但F₁几乎全为不育，与亲本间的生物学性状差异明显。因此，通过判定植株F₁的育性特征进行鉴定，可育为假杂种，不可育为真杂种。 

2.流式细胞DNA含量测定 

在流式细胞DNA含量检测中，选用大豆（Williams 82，基因组大小950Mb）作为DNA含量标准对照。豫芝11和野芝1号的基因组大小分别为383.60Mb、636.50Mb，差异显著，因此可依据材料的基因组大小初步判定是否为真的远缘杂交后代。使用BDFACSCaibur^Tm流式细胞仪进行测试材料的细胞DNA含量检测。利用DNA-ACQ软件获取数据散点图和直方图，使用ModFit LT软件分析确定样品G₀/G₁峰变异系数（CV%），然后依据Seker等（2003）方法计算样品核DNA的2C值（pg），结果如表1。 

表1芝麻远缘杂交后代的育性特征和细胞DNA含量检测 

根据表1植株育性和流式细胞DNA含量鉴定结果，认为No.IH 07、25杂种F₁为豫芝11号与野芝1号的真正远缘杂交后代，No.IH 01、13杂种F₁为假杂种。两种方法均与分子鉴定结果完全一致，因此，可以认为利用已开发的SSR标记建立的分子鉴定方法适用于芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种的远缘杂交后代鉴定。 

序列表 

SEQUENCE LISTING 

<110>河南省农业科学院 

<120>芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法 

<170>PatentIn version 3.5 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<221>正向引物 

<222>(1)..(20) 

<400>1 

GCAAGAAGCCGACATGTTTA     20 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<221>反向引物 

<222>(1)..(20) 

<400>2 

ACTCCA ATTCCTCCACCA AG    20