一种新型脂肪酶基因和脂肪酶生产菌株及应用

摘要

本发明公开了一种新型脂肪酶基因和脂肪酶生产菌株及应用，属于酶法脱墨领域。新型脂肪酶基因经过密码子优化得到，该脂肪酶基因在毕赤酵母中可实现高表达。将该基因连接到毕赤酵母表达质粒pPICZα中得到质粒pPICZαA-ARL，再将质粒pPICZαA-ARL转化毕赤酵母宿主菌Pichia Pastoris X33得到脂肪酶生产菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL。该菌株能高效表达脂肪酶，所表达的脂肪酶活力为2500U/mL，具有耐中高温、耐碱性质，可有效应用于废旧报纸脱墨。

说明书

技术领域

本发明涉及酶法脱墨领域，具体涉及一种新型脂肪酶基因和生产该酶的毕赤酵母菌株及该基因和毕赤酵母菌株在废旧新闻纸脱墨中的应用。 

背景技术

制浆造纸行业是国民经济的支柱产业，近年来为了缓解资源、能源及环保方面的压力，纷纷将目光转向二次纤维的再利用，而随着在纸循环中最终消费者的更多参与，提供了更多的旧报纸（ONP）。ONP回收再利用的关键是脱墨。传统的化学脱墨由于采用大量强碱性化学药品，使脱墨废水COD值高，污染负荷大；另外化学脱墨效率低，纤维强度损失大、脱墨浆品质差等弊端随着废纸使用量的大幅提高及废纸种类的复杂化日趋明显。生物酶法脱墨是利用纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶的一种或多种酶制剂替代化学药品处理废纸，实践证明此法可有效提高油墨脱除效率，提高脱墨浆的白度和得率，改善脱墨浆的物理性能，更为重要的是可有效降低废水的污染负荷，属当前制浆造纸行业急需的绿色环保型项目。 

目前，国内仅有少数专利提出了酶法脱墨，大部分提出的生物脱墨剂主要成分均为纤维素酶、木聚糖酶。这两种酶用于脱墨，由于本身直接作用纤维素本身，引起纸浆纤维分解，所以存在降低纸浆难度和得率的不足。 

1998年，Ming Chuan Hong等学者从抗辐射不动杆菌CMC-1（Achetobacter radioresistens CMC-1 lipase）中发现了一种碱性脂肪酶，它的分子量45kDa（SDS-PAGE测定），等电点约5.2，最适反应条件为中温碱性环境，以三油酰甘油酯为底物时表现出1,3位特异性。在碱性环境中，这种脂肪酶表现出很高的pH适性和稳定性，并且不受Fe²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺等金属离子的影响，在以及EDTA、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等有机溶剂中显示出高稳定性。1998年，TA-JUNG WANG等以抗辐射不动杆菌作为生产菌株进行批次发酵生产ARL，产量为30U/mL。2001年，Chen-You Li等以吐温80为碳源进行抗辐射不动杆菌补料批次发酵实验，ARL产量也仅达到120U/mL。但此后并没 有看到关于更多该酶应用于生产的报道，其原因可能在于在原始菌株的表达量低因而限制了其作为工业用酶制剂的进一步开发。 

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新型脂肪酶基因，该新型脂肪酶基因能够在毕赤酵母中高效表达。 

本发明的另一目的在于提供一种含上述新型脂肪酶基因的质粒。 

本发明的再一目的在于提供一种携带上述新型脂肪酶基因的菌株。 

本发明的又一目的在于提供一种脂肪酶生产菌株。 

本发明的目的还在于提供上述新型脂肪酶基因的应用。 

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种新型脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述的新型脂肪酶基因的核苷酸序列是以美国国立生物技术信息中心（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上公布的Achetobacter radioresistens CMC-1lipase（GenBank:AF073953.1）基因序列为基础，对该序列进行优化，替换成毕赤酵母偏好的密码子，再通过全基因合成得到。该新型脂肪酶基因能够在毕赤酵母中高效表达。 

一种含新型脂肪酶基因的质粒pPICZαA-ARL，通过将新型脂肪酶基因连入到毕赤酵母表达质粒pPICZα中得到。 

一种携带新型脂肪酶基因的菌株大肠杆菌TOP10/pPICZαA-ARL Escherichiacoli TOP10/pPICZαA-ARL，该菌株于2012年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 2012309，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学（430072）。 

所述的菌株Escherichia coli TOP10/pPICZαA-ARL携带质粒pPICZαA-ARL。 

一种脂肪酶生产菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL，通过将质粒pPICZαA-ARL转化毕赤酵母宿主菌Pichia Pastoris X33得到。 

上述新型脂肪酶基因、质粒pPICZαA-ARL、菌株Escherichia coli TOP10/pPICZαA-ARL或菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL在废旧新闻纸脱墨中的应用。 

毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类酵母菌，可以利用甲醇作为唯一碳源和能源。作为真核表达系统，具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点：具有强有力的乙醇氧化酶（AOX1）基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；酵母生长繁殖速度快、营养要求低、培养基廉价；外源基因能通过质粒整合到毕赤酵母 基因组上，外源基因不会发生随生长繁殖而丢失；表达量高，许多蛋白可达到每升克级以上；同时，毕赤酵母自身分泌的蛋白（背景蛋白）非常少，有利于纯化。 

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 

（1）本发明提供的新型脂肪酶基因经密码子优化后在毕赤酵母中可实现高表达，活力为2500U/mL，表达的脂肪酶具有耐中高温、耐碱性质。 

（2）本发明提供的菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL生产的脂肪酶用于废旧新闻纸（ONP）脱墨，试验证明，所得纸浆白度为51.49%ISO，残余油墨值472.06mg/kg，撕裂度14.32mN.m²/g，耐破度2.41KPa.m²/g，抗张强度30.52N.m/g。同时，使用该脂肪酶脱墨，大大减少废水中的化学需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD）等污染物的排放，脱墨废水中，固体悬浮物SS（suspend solid）为187.69mg/L，COD为269.50mg/L，总有机碳TOC（Total organic carbon）3.24g/L，废水负荷指标低于化学法脱墨50％以上。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 

实施例1新型脂肪酶基因的合成 

以美国国立生物技术信息中心（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上公布的Achetobacter radioresistens CMC-1lipase（GenBank:AF073953.1）基因序列为基础，对该序列进行优化，替换成毕赤酵母偏好的密码子得到新型脂肪酶基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，再通过生物技术公司（金斯瑞生物科技有限公司）全基因合成将新型脂肪酶基因克隆到pUC57质粒上得到质粒pUC57-ARL。 

实施例2含新型脂肪酶基因的质粒pPICZαA-ARL及携带新型脂肪酶基因的菌株Escherichia coli TOP10/pPICZαA-ARL的构建 

（1）根据新型脂肪酶基因的序列设计扩增该基因的引物： 

上游引物F1：5’-CGGAATTCTGTAATGACGACCACGACGA-3’，含EcoRI酶切位点（以下划线示出）以及保护碱基； 

下游引物R1：5’-ATTAAATAGCGGCCGCCTGAATTGGCATAAGACT-3’，含NotI酶切位点（以下划线示出）以及保护碱基。 

（2）以实施例1中的质粒pUC57-ARL为模板、F1和R1为引物进行PCR扩增；PCR扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃ 延伸90s，共30个循环；第30个循环68℃延伸7min。 

（3）将PCR产物和质粒pPICZαA（购自Invitrogen）用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，16℃下用T4连接酶连接过夜。 

（4）连接产物转化大肠杆菌宿主菌TOP10，经Zecoin（博莱霉素）抗性平板筛选阳性转化子，转化子提取质粒经双酶切（EcoRⅠ和NotⅠ双酶切）鉴定正确后得到重组质粒pPICZαA-ARL。 

鉴定正确的阳性转化子即为携带新型脂肪酶基因的菌株大肠杆菌TOP10/pPICZαA-ARL Escherichia coli TOP10/pPICZαA-ARL，该菌株于2012年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 2012309，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学（430072）。 

实施例3脂肪酶生产菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL的构建 

采用氯化锂（LiCl）法将线性化的实施例2的pPICZαA-ARL（使用SacⅠ酶酶切）质粒转化Pichia pastoris X33(购自Invitrogen），在0.1～2mg/mL的Zeocin（博莱霉素）抗性YPD平板进行筛选。以筛选得到的转化子的基因组DNA作为模板，上游引物F1和下游引物R1为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子为脂肪酶生产菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL。 

实施例4Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL发酵生产脂肪酶 

挑取Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL单菌落接种到YPD摇瓶中，30℃、250rpm培养约20h进行菌种活化；将活化的菌液按6％（体积百分比）比例再接种到YPD摇瓶中30℃、250rpm培养约20h；接着采用火焰接种法按8％（体积百分比）的比例接种到10L装有BSM培养基的发酵罐中（初始发酵体积5L），并加入4.35mL/L PTM1补充盐溶液，开始发酵。甘油批式发酵阶段，用质量百分浓度25%氨水控制pH为5.5，通气约10L/min，培养温度为30℃。培养约19h时开始流加50%（w/v）甘油（含PTM1 12mL/L），甘油补料速率约11.1gL^-1h^-1，培养至菌体达一定浓度（OD₆₀₀为120～200左右）。甘油补料完后用质量百分浓度25%氨水调节pH至6.0，温度降至25℃，饥饿约30min至发酵液中残余甘油耗尽（以溶氧数值稳定为指标），开始进行甲醇诱导。诱导初期先用较慢流速（10～15g/h）流加甲醇，待发酵液中细胞适应甲醇后，约每2h适当增加甲醇流加速率，最终甲醇补料约为30±2g/h。发酵液中脂肪酶酶酶活为2500U/mL。该发酵液上清可直接作为脂肪酶酶液应用于后续的ONP脱墨处理。 

脂肪酶酶活的测定原理：脂肪酶在一定条件下水解底物对硝基苯酚酯，生成对硝基苯酚和脂肪酸，在一定范围内对硝基苯酚的量和反应液颜色深浅成正比，在405nm下测其吸光度，从而计算出脂肪酶酶活。 

脂肪酶酶活的测定方法：酶液加蒸馏水稀释至适当的稀释倍数，取50μL于900μLTris-HCl缓冲液（pH9.0），加入50μL50mM的对硝基苯酚辛酸酯，50℃下准确反应5min，立即拿出流水冷却后，离心后在405nm下测定其吸光度，根据被测液的吸光度，由对硝基苯酚标准曲线计算样品中的对硝基苯酚的浓度，计算脂肪酶酶活。 

脂肪酶酶活力的定义为：在50℃、pH9.0的条件下，每分钟从50mM的对硝基苯酚辛酸酯溶液中降解释放1mol对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活力单位。 

实施例5脂肪酶的酶学性质测定 

本实施例采用的脂肪酶为实施例4发酵后的发酵液上清。 

（1）脂肪酶的最适pH值 

使用不同pH缓冲液（6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）（pH≤9.0用Tris-HCl缓冲液，pH>9.0用甘氨酸氢氧化钠溶液）分别配制50mM的对硝基苯酚辛酸酯底物溶液和稀释脂肪酶酶液，测定脂肪酶在各种不同pH值下的相对酶活。脂肪酶在碱性条件有很好的活性，最适作用pH值为9.0，在pH8.0酶活均为最大的85%左右。 

（2）脂肪酶的最适温度 

在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，pH9.0的条件下测定脂肪酶的相对酶活。在pH9.0下，最适作用温度为55℃。在45℃～60℃范围内，酶活均能维持在85%以上。 

实施例6脂肪酶在废旧新闻纸脱墨中的应用 

本实施例采用的脂肪酶为实施例4发酵后的发酵液上清。 

首先对二次纤维原料进行预处理：旧新闻纸（ONP）发刊在3个月以上，在60℃烘箱陈化两周、撕碎成20mm×20mm小片。原料在水中浸泡过夜后（浆浓为质量百分比10％），接着移入碎浆机进行酶处理，浆浓仍控制在10%（质量百分比），脂肪酶用量为1.5U/g绝干浆，控制pH值为9.0，温度50℃，处理时间25min后，转入12L卧式浮选仪中采用浮选法脱墨。浮选法是运用不同颗粒 具有不同的表面性能的机理进行脱墨，酶脱墨时要加入表面活性剂（此处选吐温80，添加浓度体积百分比1％）。浮选时，稀释浆浓度为质量百分比1％、温度提高至60℃（不超过65℃），浮选仪空气流量为4～6m³/h，浮选7min后收集浆料，疏解10000转，然后在抄纸机上抄成片，烘干，放于封口袋，检测成纸的脱墨效果和纸张性能。 

经上述脂肪酶处理后，浆白度为51.49%ISO，残余油墨值472.06mg/kg，撕裂度14.32mN.m²/g，耐破度2.41KPa.m2/g，抗张强度30.52N.m/g。同时，使用上述脂肪酶脱墨，大大减少废水中的化学需氧量（COD）等污染物的排放，脱墨废水中，固体悬浮物SS（suspend solid）为187.69mg/L，COD为269.50mg/L，总有机碳TOC（Total organic carbon）3.24g/L，废水负荷指标低于化学法脱墨50％以上。这是因为化学法脱墨添加了烧碱、硅酸钠、双氧水等化学药品，导致废水负荷指标升高较大。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。