一类具有改善阿尔兹海默病作用的β1-肾上腺素受体激动剂

摘要

本发明涉及一类具有β1-肾上腺素受体激动活性的化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，有很强的体外激动β1-肾上腺素受体的活性，EC

说明书

技术领域

本发明涉及一类具有β1-肾上腺素受体激动剂活性的化合物，该类化合物作为β1肾上腺素 受体激动剂具有很好的治疗阿尔茨海默病的活性。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease，AD)亦称老年性痴呆症或早老性痴呆症，是老年期常 见的一类慢性、进行性神经细胞退行性病变。随着人口的老龄化，AD已成为仅次于心血管 病、肿瘤和中风而居第四位的死因。有关AD的病因以及发病机理至今尚不明确，目前尚无 特效治疗药物。AD的病理标志是β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)在胞外沉积形成老年斑以 及NFT-tau磷酸化，同时，神经炎症已经成为引发AD的第三个关键病理标志，在AD进程 中，神经炎症反应参与AD早期的发病机制。脑内的神经炎症进程主要由小胶质细胞所介导， 激活后的小胶质细胞可释放大量的前体炎症因子，造成脑内邻近细胞炎症及死亡，加剧β-淀粉 样蛋白的沉积，从而引发神经元功能障碍，导致神经变性的发生。

β1-肾上腺素受体(β-adrenoceptor，β1-AR)是经典的G蛋白偶联受体家族的成员，其生物 学效应主要由经典的Gs-cAMP-PKA信号通路介导。β1-AR激活后通过Gs蛋白调节能够激活 腺苷酸环化酶(AC)活性，增加细胞内cAMP的水平，激活蛋白激酶A(PKA)及其调控的 蛋白质磷酸化，在调控交感神经和中枢神经系统去甲肾上腺素神经元的神经递质释放方面起 关键性作用。β1-AR与中枢神经系统(CNS)的突出可塑性(synaptic plasticity)有关，β1-AR 的激活可引起海马体和杏仁核的长时程增强效应(long-term potentiation，LTP)，增强动物的 记忆组织。国外研究表明，内源性去甲肾上腺素(NA)可使促炎症因子IL-1β、IL-6和肿瘤 坏死因子TNF-α等水平下降，还可对抗体外神经胶质细胞谷氨酸引起的兴奋性毒性，产生神 经保护作用；同时，β1-AR激动剂还可剂量依赖性的增加皮质纹状体富集的酪氨酸磷酸酶 (STEP)翻译水平，这种酶可以增强认知、改善学习记忆。这些研究提示脑内了β1-AR的代 谢和调节可能与AD发病、预防和治疗有一定关系，但目前临床上尚无此类药物出现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗阿尔茨海默病的化合物，该化合物是β1-肾上腺素受体 激动剂，对阿尔茨海默病有预防或者治疗作用。本发明所述的化合物包括含治疗有效量的化 学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。本发明采用高通量筛选技术，建立了β1-肾上腺 素受体激动剂高通量筛选模型并应用于化合物大规模筛选，通过筛选一批从CHEMDIV公司 购买的化合物并进行功能性验证寻找到了具有化学式(I)的β1-肾上腺素受体激动剂，同时 对其进行相关的AD药效学和机制研究。

本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染β1肾上腺素受体， 建立β1肾上腺素受体激动剂高通量筛选模型，进行初筛，复筛，构效关系分析，得到一类具 有抗阿尔兹海默病的候选药物。具体步骤如下：

步骤一：建立及培养稳定转染β1肾上腺素受体的CHO细胞株。

步骤二：标准曲线的测定及最佳细胞数确定。

步骤三：阳性药验证。

步骤四：采用稳转细胞株和摸索的最佳检测条件对化合物进行β1肾上腺素受体激动剂的 高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。

附图说明：

图1：标准曲线及最佳细胞数曲线

图2：阳性药扎莫特罗(Xamoterol)量效关系曲线

图3：化合物1-6的EC₅₀

图4：化合物7-12的EC₅₀

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式

1.建立及培养稳定转染β1肾上腺素受体的CHO-β1细胞株。

应用重组酶介导的盒交换技术(Recombinase-Mediated Cassette Exchange，RMCE)批量 构建G蛋白偶联受体细胞株，并使其稳定转染β1肾上腺素受体，培养CHO-β1细胞使其达到 稳定生长状态。

2.标准曲线的测定及最佳细胞数确定。

为验证实验体系的正确性以及能筛选出可靠的β1肾上腺素受体激动剂，在建立模型时需 要测定标准曲线并确定最佳细胞数。待CHO-β1细胞生长到80％的时用0.5mM EDTA的PBS 消化细胞，离心去除上层液体，最后将细胞用刺激缓冲液重悬用于确定最佳细胞数。使用 PerkinElmer公司的LANCE^TM cAMP 384Kit试剂盒，配制标准环磷酸腺苷(cAMP)梯度稀 释液及腺苷酸环化酶激活剂(forskolin)梯度稀释液。标准曲线测定方法：将cAMP的标准 溶液50μmol/L(cAMP检测试剂盒自带)，用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工 作浓度，cAMP与抗体溶液各5μl加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液，孵育 一个小时后检测；最佳细胞数检测方法：将50mM的forskolin母液用刺激缓冲液逐级稀释为 终浓度4倍的工作浓度，forskolin与含有细胞的抗体溶液各5μl加入384孔板中共同孵育45 分钟，加入10μl终止液，孵育一个小时后在EnVision微孔板测读仪上检测。根据forskolin 量效曲线窗口(性噪比S/B)及曲线与cAMP标准曲线斜率相近的细胞浓度作为最佳细胞数。 标准曲线及最佳细胞数确定见图1。

3.选用β1肾上腺素受体激动剂的阳性药Xamoterol对所建立的β1肾上腺素活性筛选模型进 行验证并且根据量效曲线计算其的EC₅₀。

阳性药测定方法：将100mM的Xamoterol母液，用刺激缓冲逐级稀释为终浓度2倍的工 作浓度，阳性药Xamoterol 5μl与含有最佳细胞数的抗体溶液5μl加入384孔板中共同孵育45 分钟，加入10μl终止液再孵育一个小时后用EnVision微孔板测读仪检测，阳性药量效曲线见 图2。

4.在上述的最佳检测条件下进行β1肾上腺素受体激动剂的的初筛和复筛。

初筛与复筛过程相同，初筛只选用一个浓度对8万个化合物进行初步筛选，再选择初筛 有效的化合物梯度稀释8个浓度进行复筛，过程如下：用Janus全自动加样工作站稀释化合 物并吸取5μl转移到384孔板中，再用Multidrop自动加样仪将含有最佳细胞数的抗体溶液5μl 加入384孔板中，两者共同孵育45分钟后，Multidrop自动加样仪将10μl终止液加入384孔 板中，再次孵育一个小时，用EnVision微孔板测读仪检测。复筛得到一系列具有D1受体激 动作用的化合物。处理数据，计算化合物EC₅₀，各个化合物的EC₅₀见图3，图4。

复筛实验结果

筛选得到的化合物可以根据母核的结构总结为一类，结构式与EC₅₀如下：

2-phenyl-5H-chromeno[2，3-d]pyrimidine-4-thiol

表1复筛得到的对β1受体有激动作用的一类化合物结构

表2复筛得到的对β1受体有激动作用的一类化合物EC₅₀