有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体的制备方法

摘要

本发明涉及一种有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体的制备方法，先将具有一定脱乙酰度的壳聚糖或壳聚糖衍生物溶于水中，然后在室温搅拌条件下向壳聚糖或壳聚糖衍生物水溶液中加入有机荧光分子溶液，有机荧光分子与壳聚糖或壳聚糖衍生物通过静电自组装相结合，得到有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物；该纳米复合物与一氧化氮在室温加压条件下反应一定的时间后，与氯化铜在缓冲溶液反应制得有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。与现有技术相比，本发明产品在生理环境下能够稳定地释放一氧化氮，并且可以对一氧化氮的释放进行原位实时探测，生物相容性好，无生理毒性，有着广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于化学、生物与材料的交叉领域，尤其是涉及一种具有释放一氧化氮并原位实时探测其释放功能的有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体及其制备方法。 

背景技术

一氧化氮(NO)是一种能够被人体内皮细胞合成的生理调节剂，广泛的分布于全身的多种器官，是重要的生物信使分子。NO能够有效的防止血小板的凝结和活化，抗血栓的形成，减少细菌的粘附，并有杀死癌细胞的功能。一氧化氮的缺乏会导致器官功能失调，引发高血压、心脏病、呼吸系统疾病等。为了治疗一氧化氮缺乏引发的各种疾病，人们设计并合成了很多种一氧化氮供体，其中偶氮二烯醇类亲核一氧化氮供体(diazeniumdiolates)是近几年发展起来的一种性能优良的一氧化氮供体。这类亲核一氧化氮供体一般是将含有仲胺基团的亲核化合物与一氧化氮气体在一定的压力条件下反应制得，能够在生理环境中以一定的速率自发释放一氧化氮。在亲核一氧化氮供体材料中，壳聚糖及其衍生物由于其良好的生物相容性和生物可降解性以及低细胞毒性等特性而备受关注。有研究表明，壳聚糖作为一氧化氮的载体材料在生理环境下可以稳定地释放一氧化氮。壳聚糖结构上的特殊性使之与许多有机物、离子、生物分子等具有络合、吸附和离子交换等作用。因此，可以利用不同的物质对壳聚糖及其衍生物进行改性，使其具备一些新的功能。 

现有的一氧化氮供体可以满足释放一氧化氮的需求，但是绝大多数无法同时实现对一氧化氮释放的探测。要实现对所释放一氧化氮的探测，必须同时使用荧光探针或其它检测手段，这样就增加了操作的难度，且不利于成本的降低。中国发明专利CN102516606报道了一种一氧化氮供体-量子点的纳米复合物，可同时实现一氧化氮的释放以及对一氧化氮释放的荧光探测。但是，量子点对一氧化氮的探测基于一氧化氮对量子点的荧光淬灭作用，其对一氧化氮的选择性不强，容易受到其它对 量子点有荧光淬灭作用的物质的干扰。因此，如何制备既能稳定释放一氧化氮，又能实现对一氧化氮释放的原位、实时、高选择性探测的一氧化氮供体是一项很有意义的课题，也是亟待解决的关键技术问题。 

目前尚未见将有机荧光分子与壳聚糖或壳聚糖衍生物相结合制备具有上述功能的纳米复合物一氧化氮供体的相关专利报道。 

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单，成本较低，产物在生理环境下可以稳定地释放一氧化氮，并且可以原位实时探测一氧化氮的释放，对一氧化氮的选择性高，生物相容性好，在高血压、心脏病、呼吸系统疾病、性功能障碍等的诊断和治疗方面有着良好的应用前景的有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体的制备方法。 

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 

(1)在室温下将一定量的壳聚糖或其衍生物溶于去离子水中，制得浓度为1-15mg/mL的壳聚糖或壳聚糖衍生物水溶液； 

(2)在室温搅拌条件下向步骤(1)制得的壳聚糖或壳聚糖衍生物水溶液中加入有机荧光分子溶液，有机荧光分子与壳聚糖或其衍生物的质量比为5∶1～1∶1，搅拌1-2小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真空干燥后得到有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物； 

(3)在25-45℃的高压反应釜中，将步骤(2)制得的有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，壳聚糖或壳聚糖衍生物与甲醇钠的质量比控制在1∶1-1∶3，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一氧化氮气体，维持压力50-120psi，搅拌反应3-8天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥； 

(4)将步骤(3)制得的产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在-5-5℃的温度下搅拌并通氮气保护，然后加入一定量的溴代烷烃，反应1.5-5小时后升至室温继续搅拌24-60小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时； 

(5)在室温下将上述产物与氯化铜在中性缓冲溶液中反应，得到有机荧光分 子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。 

所述的壳聚糖或其衍生物为脱乙酰度为40％-60％的水溶性壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐中的一种或多种，粘均分子量为2-40万。 

所述的有机荧光分子为含有喹啉基团的罗丹明衍生物。 

所述的有机荧光分子优选以下物质，分子式分别为： 

所述的有机荧光分子溶液的溶剂为乙酸乙酯、环己烷或两者的混合物。 

步骤(4)所述的溴代烷烃为溴乙烷或二溴乙烷，溴代烷烃与所述的步骤(3)制得的产物的质量比为2∶1～1∶1。 

步骤(5)所述的中性缓冲溶液为哌嗪二乙醇磺酸水溶液与氯化钾水溶液的混合溶液，其中哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2。 

步骤(5)所述的氯化铜与有机荧光分子的摩尔比为1.5∶1～1∶1.5。 

本发明通过静电自组装将壳聚糖或其衍生物与有机荧光分子相结合形成纳米复合物，将该纳米复合物在一定压力条件下与一氧化氮气体反应，利用壳聚糖或其衍生物中的仲氨基团与一氧化氮发生亲核反应生成可释放一氧化氮的功能基团，然后使用溴代烷烃对该功能基团进行保护。最后使用氧化铜与所得的纳米复合物一氧化氮供体进行反应，得到一种有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体，其在不释放一氧化氮的情况下没有荧光效应，一旦释放一氧化氮，体系就会发出荧光。本发明的制备方法操作简单，成本较低，产物在生理环境下可以稳定地释放一氧化氮，并且可以原位、实时、高效地探测一氧化氮的释放，生物相容性好，在高血压、 心脏病、呼吸系统疾病、性功能障碍等的诊断和治疗方面有着良好的应用前景。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果： 

1.所使用的原料易于获取； 

2.制备的有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体的一氧化氮释放效果好，稳定性高，具有原位、实时荧光探测一氧化氮释放的功能； 

3.荧光效率高，对一氧化氮的选择性强，探测效果好； 

4.制备方法简单，成本较低。 

附图说明

图1为本发明有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体的透射电子显微镜照片。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 

实施例1 

在室温下将分子量为12万、脱乙酰度为50％的壳聚糖溶于去离子水中，制得浓度为4mg/ml的壳聚糖水溶液；在室温搅拌条件下向该壳聚糖水溶液中加入有机荧光分子溶液，搅拌1.5小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真空干燥后得到有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物；其中有机荧光分子的结构式如下： 

有机荧光分子与壳聚糖的质量比为5∶1； 

在30℃的高压反应釜中，将上述纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，壳聚糖与甲醇钠的质量比为1∶1.5，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一氧化氮气体，维持压力70psi，搅拌反应4天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥；将上述产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在-1℃的温度下搅拌并通氮气保护，然 后加入一定量的二溴乙烷，该二溴乙烷与所述产物的质量比为1.5∶1，反应3小时后升至室温继续搅拌40小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时；在室温下将上述产物与氯化铜在哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的混合水溶液(哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2)中反应，氯化铜与有机荧光分子的摩尔比为1∶1，得到有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。该复合物的透射电子显微镜照片如图1所示。得到的有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体释放和探测一氧化氮的反应式如下： 

实施例2 

在室温下将分子量为20万、脱乙酰度为53％的壳聚糖溶于去离子水中，制得浓度为3mg/ml的壳聚糖水溶液；在室温搅拌条件下向该壳聚糖水溶液中加入有机荧光分子溶液，搅拌2小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真空干燥后得到有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物；其中有机荧光分子的结构式如下： 

有机荧光分子与壳聚糖的质量比为1∶1； 

在35℃的高压反应釜中，将上述纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，壳聚糖与甲醇钠的质量比为1∶1.5，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一氧化氮气体，维持压力80psi，搅拌反应4天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥；将上述产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在0℃的温度下搅拌并通氮气保护，然 后加入一定量的二溴乙烷，该二溴乙烷与所述产物的质量比为1.5∶1，反应4小时后升至室温继续搅拌48小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时；在室温下将上述产物与氯化铜在哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的混合水溶液(哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2)中反应，氯化铜与有机荧光分子的摩尔比为1.1∶1，得到有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。 

实施例3 

在室温下将分子量为8万、脱乙酰度为46％的壳聚糖溶于去离子水中，制得浓度为4mg/ml的壳聚糖水溶液；在室温搅拌条件下向该壳聚糖水溶液中加入有机荧光分子溶液，搅拌1.5小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真空干燥后得到有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物；其中有机荧光分子的结构式如下： 

有机荧光分子与壳聚糖的质量比为3∶1； 

在25℃的高压反应釜中，将上述纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，壳聚糖与甲醇钠的质量比为1∶2，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一氧化氮气体，维持压力70psi，搅拌反应5天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥；将上述产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在0℃的温度下搅拌并通氮气保护，然后加入一定量的溴乙烷，该二溴乙烷与所述产物的质量比为2∶1，反应4小时后升至室温继续搅拌30小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时；在室温下将上述产物与氯化铜在哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的混合水溶液(哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2)中反应，氯化铜与有机荧光分子的摩尔比为1∶1.2，得到有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。 

实施例4 

在室温下将分子量为25万、脱乙酰度为40％的羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，制得浓度为6mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液；在室温搅拌条件下向该羧甲基壳聚糖水溶液中加入有机荧光分子溶液，搅拌2小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真 空干燥后得到有机荧光分子与羧甲基壳聚糖的纳米复合物；其中有机荧光分子的结构式如下： 

有机荧光分子与壳聚糖的质量比为2∶1； 

在35℃的高压反应釜中，将上述纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，羧甲基壳聚糖与甲醇钠的质量比为1∶2，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一氧化氮气体，维持压力90psi，搅拌反应3天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥；将上述产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在1℃的温度下搅拌并通氮气保护，然后加入一定量的二溴乙烷，该二溴乙烷与所述产物的质量比为1∶1，反应3小时后升至室温继续搅拌48小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时；在室温下将上述产物与氯化铜在哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的混合水溶液(哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2)中反应，得到有机荧光分子-羧甲基壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。 

实施例5 

在室温下将分子量为15万、脱乙酰度为50％的壳聚糖溶于去离子水中，制得浓度为9mg/ml的壳聚糖水溶液；在室温搅拌条件下向该壳聚糖水溶液中加入有机荧光分子溶液，搅拌1.5小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真空干燥后得到有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物；其中有机荧光分子的结构式如下： 

有机荧光分子与壳聚糖的质量比为4∶1； 

在35℃的高压反应釜中，将上述纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，壳聚糖与甲醇钠的质量比为1∶1.2，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一 氧化氮气体，维持压力80psi，搅拌反应6天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥；将上述产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在0℃的温度下搅拌并通氮气保护，然后加入一定量的溴乙烷，该溴乙烷与所述产物的质量比为1.5∶1，反应3.5小时后升至室温继续搅拌36小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时；在室温下将上述产物与氯化铜在哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的混合水溶液(哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2)中反应，氯化铜与有机荧光分子的摩尔比为1.2∶1，得到有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。 

实施例6 

在室温下将分子量为3万、脱乙酰度为45％的壳聚糖溶于去离子水中，制得浓度为13mg/ml的壳聚糖水溶液；在室温搅拌条件下向该壳聚糖水溶液中加入有机荧光分子溶液，搅拌1小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真空干燥后得到有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物；其中有机荧光分子的结构式如下： 

有机荧光分子与壳聚糖的质量比为4∶1； 

在25℃的高压反应釜中，将上述纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，壳聚糖与甲醇钠的质量比为1∶1，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一氧化氮气体，维持压力70psi，搅拌反应3天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥；将上述产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在0℃的温度下搅拌并通氮气保护，然后加入一定量的二溴乙烷，该二溴乙烷与所述产物的质量比为1.5∶1，，反应3小时后升至室温继续搅拌48小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时；在室温下将上述产物与氯化铜在哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的混合水溶液(哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2)中反应，氯化铜与有机荧光分子的摩尔比为1∶1，得到有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。 

实施例7 

有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体及其制备方法，包括以下步骤： 

(1)在室温下将分子量为7万、脱乙酰度为45％的壳聚糖溶于去离子水中，制得浓度为5mg/mL的壳聚糖水溶液； 

(2)在室温搅拌条件下向步骤(1)制得的壳聚糖水溶液中加入有机荧光分子溶液，搅拌2小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真空干燥后得到有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物；其中有机荧光分子的分子式为： 

(3)在25℃的高压反应釜中，将步骤(2)制得的有机荧光分子与壳聚糖的纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，壳聚糖与甲醇钠的质量比为1∶2.5，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一氧化氮气体，维持压力100psi，搅拌反应6天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥； 

(4)将步骤(3)制得的产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在2℃的温度下搅拌并通氮气保护，然后加入一定量的溴乙烷，该溴乙烷与步骤(3)制得的产物的质量比为1∶1，反应4小时后升至室温继续搅拌48小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时； 

(5)在室温下将上述产物与氯化铜在哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的混合水溶液(其中哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2)中反应，氯化铜与有机荧光分子的摩尔比为1∶1.5，得到有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。 

实施例8 

有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体及其制备方法，包括以下步骤： 

(1)在室温下将分子量为18万、脱乙酰度为50％的壳聚糖溶于去离子水中，制得浓度为7mg/mL的壳聚糖水溶液； 

（2）在室温搅拌条件下向步骤（1）制得的壳聚糖季铵盐水溶液中加入有机荧光分子溶液，搅拌2小时，然后在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，真空干燥后得到有机荧光分子与壳聚糖季铵盐的纳米复合物；其中有机荧光分子的分子式为： 

(3)在25℃的高压反应釜中，将步骤(2)制得的有机荧光分子与壳聚糖季铵盐的纳米复合物加到甲醇钠的无水甲醇溶液中，壳聚糖季铵盐与甲醇钠的质量比为1∶2，将高压反应釜先通氮气再抽真空，然后通入一氧化氮气体，维持压力90psi，搅拌反应5天后，用氮气吹走未反应的一氧化氮气体，将产物过滤，相继用无水甲醇和乙醚洗涤，在室温下真空干燥； 

(4)将步骤(3)制得的产物加入盛有二甲基甲酰胺的密闭玻璃容器中，在-1℃的温度下搅拌并通氮气保护，然后加入一定量的溴乙烷，该溴乙烷与步骤(3)制得的产物的质量比为2∶1，反应4小时后升至室温继续搅拌48小时，过滤得到的固体用乙醚洗涤，在真空烘箱中室温干燥24小时； 

(5)在室温下将上述产物与氯化铜在哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的混合水溶液(其中哌嗪二乙醇磺酸与氯化钾的质量比为1∶2)中反应，氯化铜与有机荧光分子的摩尔比为1.5∶1，得到有机荧光分子-壳聚糖季铵盐纳米复合物一氧化氮供体。