一种基因及其编码蛋白促进细胞胞质分裂、细胞增殖和在药物研发中应用

摘要

本发明公开了ALKBH4基因及其编码的蛋白ALKBH4在胞质分裂和细胞增殖中的功能及针对ALKBH4抗癌药物研发中的潜在应用价值。ALKBH4蛋白与肌动蛋白actin和二型非肌肉肌球蛋白NM II相互作用，并能够将actin K84me1去甲基化，这个去甲基化修饰反应对NM II在actin上结合和沿着actin纤维滑动是至关重要的，影响到胞质分裂的效率。ALKBH4基因沉默会导致中心体过度复制、细胞分裂期阻滞和胞质分裂失败，最终引起细胞凋亡及多核细胞生成，ALKBH4蛋白的缺失或抑制会导致细胞增殖迁移缺陷最终走向死亡。ALKBH4可以用于研发抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

本发明涉及ALKBH4基因及其编码蛋白ALKBH4在胞质分裂和细胞增殖中的功能及针对ALKBH4抗癌药物研发中的潜在应用价值。 

背景技术

胞质分裂通常经历四个主要的阶段：分裂板确立（cleavage plane specification）、分裂沟收缩（cleavage furrow ingression）、中体形成（midbody formation）和断裂（abscission）。胞质分裂失败通常会导致中心体过度复制基因组不稳定，这些都会导致恶性增值和迁移。为了在空间和时间上保证胞质分裂正确发生，胞质分裂的许多组分和其它细胞通路过程都参与这个紧密的调控过程。胞质分裂通常被认为是通过肌动蛋白纤维（F-actin）和二型非肌肉肌球蛋白（non-muscle myosin II or NM II）形成的收缩环（contractile ring）收缩完成的，肌动蛋白纤维在分裂沟形成和收缩过程中起到关键性作用。收缩环随着肌动蛋白纤维和二型非肌肉肌球蛋白之间的快速转变而高度动态变化，肌动蛋白纤维在分裂沟处聚集是通过分裂沟处肌动蛋白纤维的成核效应或其他位置已经存在的成核的肌动蛋白纤维传递到分裂沟处的。二型非肌肉肌球蛋白聚集在分裂沟处不依赖其自身的ATP酶活性，而是依赖于轻链的磷酸化修饰。二型非肌肉肌球蛋白是胞质分裂过程中主要的动力蛋白，它沿着肌动蛋白纤维滑动和促进肌动蛋白纤维解聚都是分裂沟收缩所必需的。肌动蛋白和肌球蛋白在分裂沟处的高度变化是受到蛋白质翻译后修饰所（post-translational modifications or PTMs）调控的，有研究表表明在有丝分裂的早后期肌球蛋白招募到分裂沟处是通过磷酸化修饰完成，促进磷酸化的激酶降解会导致肌球蛋白定位及肌动蛋白在分裂沟处解聚，肌动蛋白的解聚和聚合也受到多种翻译后修饰的信号通路调控，例如氧化、精氨酰化、SUMO化和S-亚硝基化，这些对肌动蛋白结构、分布和功能有重要影响，然而在收缩环和中体上的肌动蛋白是否具有类似的修饰、这些修饰是怎样影响收缩环中体的结构和功能现在还不清楚。 

现在已发现铁离子和α-酮戊二酸依赖的加双氧酶能够氧化多种底物，包括蛋白质、核酸和代谢物，一个候选加双氧酶——大肠杆菌加双氧酶AlkB蛋白催化甲基化试剂导致的各种甲基化修饰的DNA去甲基化，通过生物信息学分析发现在人体内有九种AlkB的同源类似物：ALKBH1-8和FTO。像大肠杆菌AlkB蛋白一样，一些人源ALKBH蛋白也具有加双氧酶，它们的底物是多种修饰类型的核酸，这些蛋白参与不同的生物过程。人源ALKBH4具有302个氨基酸，虽然它已被证明具有加双氧酶活性，但是它的底物和生物学功能现在还不清楚 

胞质分裂是一个令人吃惊的复杂调控过程，需要非常多的相互作用组分和调控通路，胞质分裂的失败可产生于这四个阶段的任何一阶段中某个组分失活或过度激活的结果。虽然许多胞质分裂的蛋白已被鉴定，但是我们只是知道这些蛋白是如何相互作用的如何被调控的。理解胞质分裂失败是很重要的，因为它可能是产生不稳定的四倍体细胞和肿瘤的原因。然而，胞质分裂失败也会生理调节性的发生在一些组织中，甚至那些不会有肿瘤倾向的组织，如心脏。了解如何在应答不同信号或在细胞受到压力和损伤的情况下生理性的调控胞质分裂，仍是未来重点研究的领域。虽然胞质分裂失败伴随着一些病理现象，如癌症，但是药物诱导胞质分裂失败可以作为新药研发的重要方向。Rho激酶抑制剂已被研发成心血管药物，Aurora激酶抑制剂作为抗癌药物正在研发当中。因为这些抑制剂也可诱导正常组织胞质分裂失败，所以确定不同组织对胞质分裂敏感性和不同组织产生四倍体细胞的后果是非常重要的。 

发明内容

本发明公开了一种ALKBH4基因及其编码的蛋白ALKBH4在胞质分裂和细胞增殖中的功能及针对ALKBH4抗癌药物研发中的潜在应用价值。所述人ALKBH4 cDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述人ALKBH4H169A-D171A-H254A突变体cDNA序列如序列表SEQ ID NO.2，所示所述小鼠ALKBH4基因组DNA序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述人β-actin cDNA序列如序列表SEQ ID NO.4所示，所述人β-actin K84A突变体cDNA序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述人ALKBH4蛋白序列如序列表SEQ ID NO.6所示，所述人ALKBH4 H169A-D171A-H254A突变体蛋白序列如序列表SEQ ID NO.7所示，所述小鼠ALKBH4蛋白序列如序列表SEQ ID NO.8所示，所述人β-actin蛋白序列如序列表SEQ ID NO.9所示，所述人β-actin K84A突变体蛋白序列如序列表SEQ ID NO.10所示。所述ALKBH4 siRNA序列SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29作用是将ALKBH4基因沉默，降解ALKBH4 cDNA和降低内源ALKBH4蛋白表达，这三条序列的靶点位于ALKBH4 mRNA的3’端非编码区，所以不能沉默外源表达ALKBH4基因。所述NM II siRNA序列SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32作用是将NM II基因沉默，降解NM II cDNA和降低NM II蛋白表达。 

首先，本发明通过免疫荧光与免疫印迹实验检测到ALKBH4蛋白定位在收缩环（contractile ring）、中体（midbody）和中心体（centrosome）上。发现ALKBH4蛋白的细胞定位具有特异性，主要存在于与细胞有丝分裂及胞质分裂相关的重要细胞器。所以本发明解决技术问题一提供ALKBH4蛋白一种新的细胞器特异性定位表型，这个表型可以应用于病理检测的指标。 

其次，本发明通过基因沉默、免疫共沉淀及免疫印迹实验发现ALKBH4蛋白与肌动蛋白（actin）和二型非肌肉肌球蛋白（NM II）相互作用，并能够将actin K84me1去甲基化，这个去甲基化修饰反应对NM II在actin上结合和沿着actin纤维滑动是至关重要的，影响到胞质分裂的效率。因此本发明解决技术问题二提供ALKBH4蛋白两种新的相互结合蛋白、actin K84me1的去甲基化功能和促进收缩环收缩。 

最后，本发明通过基因沉默、免疫荧光和流式细胞技术发现ALKBH4基因沉默会导致中心体过度复制、细胞分裂期阻滞和胞质分裂失败，最终引起细胞凋亡及多核细胞生成，ALKBH4蛋白的缺失或抑制会导致细胞增殖迁移缺陷最终走向死亡。所以本发明解决技术问题三为抑制恶性增殖迁移的肿瘤细胞诱导其死亡提供基础研究证据，这就为我们研究针对ALKBH4蛋白的抗肿瘤药物研发提供强有力的理论基础。众所周知，恶性肿瘤细胞是能够无线增殖和迁移的细胞，它的恶性扩增侵占了正常细胞的生存空间，引起众多器官衰竭夺走病人生命。而我们发现ALKBH4基因在细胞分裂尤其是胞质分裂过程起到关键调控作用，那如果将肿瘤细胞的ALKBH4基因抑制掉，那么肿瘤细胞将无法增殖和迁移最终导致其死亡，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。综上所述，说明ALKBH4可以用于研发抗肿瘤药物。 

附图说明

图1人加双氧酶AlkB蛋白家族组成及酶活性关键结构域 

图2加双氧酶AlkB蛋白家族与组蛋白去甲基化酶JHDM蛋白家族具有相同的去甲基化机制 

图3亲和层析纯化6×His-ALKBH4野生型和HDH突变体融合蛋白 

图4浓缩6×His-ALKBH4野生型和HDH突变体融合蛋白及验证这两个蛋白的纯度 

图5验证GST-ALKBH4融合蛋白可溶性表达，亲和层析和离子交换层析分离纯化GST-ALKBH4融合蛋白 

图6亲和层析纯化用于免疫荧光实验的兔源ALKBH4抗体 

图7免疫荧光实验验证兔源ALKBH4抗体的特异性 

图8制备用于免疫印迹实验的抗体及免疫印迹实验验证抗体的特异性 

图9免疫荧光实验证明内源ALKBH4蛋白定位在中心体（centrosome）和中体（midbody）上 

图10免疫荧光实验证明外源3×Flag-ALKBH4定位在中心体上，中心体分离实验证明内源ALKBH4定位在中心体上 

图11免疫荧光实验及收缩环中体分离实验证明ALKBH4定位在收缩环（contractile ring）和中体上 

图12ALKBH4免疫共沉淀质谱分析结果，actin K84me1和NM II存在于ALKBH4免疫共沉淀样品中 

图13免疫共沉淀实验证明内源和外源的ALKBH4都与actin相互作用 

图14免疫共沉淀实验证明HA-β-actin K84A突变体干扰ALKBH4结合，Flag-GFP-ALKBH4 HDH突变体与actin的结合能力增强 

图15免疫共沉淀实验证明ALKBH4与NM II相互作用，HA-β-actin K84A突变体干扰其与NM II间的结合 

图16免疫共沉淀实验证明ALKBH4基因沉默不影响actin与NM II间的相互作用 

图17免疫共沉淀实验证明NM II基因沉默不影响ALKBH4与actin间相互作用 

图18免疫共沉淀实验证明NM II抑制剂Blebbistatin不影响ALKBH4与actin间相互作用 

图19免疫共沉淀实验证明actin聚合抑制剂Cytochalasin D破坏了ALKBH4与actin、NM II间的相互作用 

图20兔源actin K84me1抗体可以特异性识别含有K84me1的多肽和HA-β-actin，不能识别非甲基化的多肽和HA-β-actin K84A突变体 

图21在体内ALKBH4可以使actin K84me1去甲基化，ALKBH4与actin K84me1结合而NM II与没有甲基化修饰的actin结合 

图22免疫荧光实验证明ALKBH4基因沉默导致收缩环位置异常、中体结构异常和中心体过度复制 

图23流式细胞技术证明ALKBH4基因沉默导致G2/M期和M期细胞增多 

图24过表达3×Flag-ALKBH4 HDH和HA-β-actin K84A突变体导致M期细胞增多 

图25免疫荧光、流式细胞技术和活细胞成像实验证明ALKBH4基因沉默导致胞质分裂失败最终产生多核细胞、细胞凋亡 

图26Flag-GFP-ALKBH4野生型可以修复ALKBH4基因沉默导致的胞质分裂现象，包括收缩环定位异常，多核细胞产生和M期细胞增多，而Flag-GFP-ALKBH4 HDH突变体却不能 

图27ALKBH4在细胞内的功能模型 

图28流式细胞技术证明U2OS细胞中ALKBH4基因沉默导致G2/M期、M期细胞增多和细胞凋亡 

图29流式细胞技术证明OSC20和TOC2细胞中ALKBH4基因沉默导致细胞凋亡 

图30ALKBH4基因敲除小鼠敲除的蛋白位置及传统型ALKBH4基因敲除小鼠死于胚胎期 

图31条件型ALKBH4基因敲除小鼠设计方案及southern blotting和RT-PCR验证 

图32诱导ALKBH4基因敲除小鼠成纤维细胞ALKBH4基因敲除引起actin K84me1表达量增加 

图33诱导ALKBH4基因敲除小鼠成纤维细胞ALKBH4基因敲除导致多核细胞产生及中心体过度复制 

图34ALKBH4基因敲除小鼠成纤维细胞的增殖和迁移能力缺失 

具体实施例

实施例一：本发明实施例中应用到的实验方法和材料 

实验材料： 

1、所用细胞系的信息 

2、所用抗体信息 

3、所用质粒信息 

4、所用化学试剂 

Nocodazole(Sigma,M1404),Cytochalasin D(Sigma,C8273)and Blebbistatin(Sigma,B0560)，taxol(Invitrogen P3456)and phalloidin(Invitrogen P3457)，Lipofectamine2000(Invitrogen)，Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)，PI-stained kit(Becton-Dickinson)，Annexin V-FITC & PI Detection Kit(Jiamay Biotech,Beijing,China)，DAPI(Vector Laboratories,Burlingame,CA)，anti-flag M2 affinity gel(sigma,A2220)，anti-HA affinity gel(sigma)，GFP-Trap-A beads(ChromoTek,gta-20)，anti-Rabbit Ig IP Beads(eBioscience)，anti-Mouse Ig IP Beads(eBioscience)，ECL Western Blotting Detection Kit(GE) 

实验方法： 

1、表达质粒的构建 

我们用常规亚克隆方法构建表达所需蛋白的表达质粒，大致步骤如下：设计引物用PCR的方法将目的基因从质粒或cDNA中扩增处理，PCR产物经特定的核酸内切酶切割回收后与经同样酶切回收处理的目标载体连接，连接产物转入DH5α感受态细胞中扩增，挑取若干单克隆，初步酶切鉴定连接是否成功，经测序鉴定无误之后，扩增并用于后续实验。本论文中构建质粒所用到的引物见实验材料3。 

2、感受态细胞转化 

1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，用手指轻轻揉搓EP管的底部，使菌液快速融化，并立即把EP管转移至冰中，静置10分钟。 

2)将要转化的质粒加入到100μl感受态细胞中（2-3μl质粒/100μl感受态细胞，质粒体积不超过感受态细胞的5%），用手指轻弹EP管底部使内容物混匀；同时设只有感受态细胞而不加质粒的阴性对照，冰浴30分钟。期间可将LB培养液置于37℃水浴中加热，打开42℃金属浴。 

3)将EP管放置在42℃的金属浴中，静置90秒(不要摇动)。 

4)快速将EP管转移到冰浴中，冷却2分钟。 

5)每管加入37℃预热的800μl LB液体培养基，将EP管转移到37℃转速200rpm的摇床上，温育45分钟。 

6)从EP管中取出200μl已转化好的感受态细胞，转移到含相应抗生素的LB平板上，用涂菌棒涂匀。若转化DNA是连接产物，需要离心浓缩细胞（室温转速4000rpm离心10分钟），弃去700μl上清液，利用剩余的200μl上清液重悬细胞,并转移均匀涂布到LB固体培养平板上(含相应抗生素). 

7)将平板正置于37℃的培养箱，过夜培养。 

3、蛋白质体外表达和纯化 

含有表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37度培养摇床中扩增。当波长600nm吸光值达到0.5-0.65之间时，加入终浓度0.1mM IPTG 25℃诱导培养4小时。室温转速4000rpm离心收集菌体。将细胞悬液悬浮在适量裂解液中，超声破碎，超声条件随裂解条件不同而不同，超声后，4℃转速16000rpm离心20分钟，上清即为可溶蛋白。在纯化之前，通常要进行可溶性鉴定。如果目的蛋白可溶性很低，通过改变培养条件增加可溶性后再进行纯化。 

利用Bio-Rad的蛋白层析系统对可溶蛋白进行两步纯化，对于6×His标签偶联的蛋白，第一步，利用Bio-Scale IMAC cartridge（BIO-RAD 732-4610）进行亲和纯化。对于GST标签偶联的蛋白，利用Bio-Scale Profinity GST cartridge(BIO-RAD，732-4620)进行亲和纯化，若纯度不够，进行第二步纯化：根据蛋白等电点确定利用阴离子交换柱（column UNO-Q1，BIO-RAD）还是阳离子交换柱（Column UNO-S1，BIO-RAD）进行进一步的纯化。第二步纯化前和第一步纯化后应该进行透析。通常透析两次，每次两小时，在2L烧杯中进行，根据样品多少，选用不同长度的透析袋（KF134419,Thermo）。纯化好的蛋白最后进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测纯度是否符合抗体制备或其他实验要求。 

4、SDS-PAGE电泳 

SDS-PAGE采用垂直式电泳槽装置 

聚丙烯酰胺凝胶的配制 

1)、凝胶板的准备 

A.洗板： 

用洗洁精清洗二块玻璃板，然后用自来水洗净，再用75%酒精将板擦干。 

B.配板： 

将二块玻璃板叠放整齐，用夹子两边夹好，将这二块玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下缘划线，用防水记号笔标记灌胶位置。拔去梳子。 

2)、灌胶： 

A.配分离胶(10%)溶液10ml： 

B.灌胶:将上述溶液混匀后利用移液管将分离胶（避免气泡产生）滴入二块玻璃板之间，至液面达到梳子 下缘1cm处。用移液管缓慢加入ddH₂O封胶，注意不要冲乱胶面。静置，待分离胶聚合后，倒去或用滤纸吸去水层。可将其裹上保鲜膜放入37°恒温培养箱中30min。 

C.配浓缩胶（5%）溶液6ml： 

将上述溶液混匀后即刻用移液管加浓缩胶（避免气泡产生）覆于二块玻璃板之间的分离胶之上至满，轻轻插入梳子。将其裹上保鲜膜放入37°恒温培养箱中30min。待其凝结后，即制成凝胶板。用笔在分离胶和浓缩胶的交界处作好记号，以后都可依此灌胶。制2块凝胶板。 

3)、样品处理： 

A.将-20℃冻存的cell pellet，每管等体积加50μl 1×SDS loading buffer，放在37℃水浴中温育5min。 

B.95℃恒温金属浴加热15min。 

C.以13,300rpm高速离心5min。转移上清至新的EP管中，做好标记。 

D.取三个EP管，其中一管加入10μl marker和10μl 1×SDS loading buffer，混匀备用；一管加入2μl marker和8μl 1×SDS loading buffer，混匀；另一管加入10μl 1×SDS loading buffer。 

4)、上样; 

A.将二块玻璃板制成的凝胶板上的夹子卸去。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。 

B.将凝胶板垂直靠在电泳槽里的电源架上，使凝胶板的凹沿面靠向电源架。通常两块凝胶板共用一个电源架。 

C.将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内。按要求分别往两块凝胶板中间电源架内和电泳槽中加入适当体积的1×Tris-Glycine电泳缓冲液，至液面没过凝胶。 

D.取处理后的样品液，用移液枪吸取10μl样品液，将样品液缓缓加入凝胶板内地凹口部位（样品点入处）。注意不要冲散样品。 

5)、电泳： 

用二根导线连接电泳槽与电泳仪，注意红色与黑色电极的插头和插口相配。接通电源。控制电压在浓缩胶中为70V，大约30min，走过浓缩胶后电压调为120V，大约1h。电泳时观察凝胶板上的样品溴酚蓝的条带走出分离胶时，停止电泳。关闭电源。然后从电泳槽内小心取出凝胶板。 

6)、染色 

A.用刀片或薄板将凝胶板外的两块玻璃板轻轻撬开，使凝胶倾伏在其中一块玻璃板上。 

B.用刀片在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交接处，先将浓缩胶切下丢弃，再将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序。 

C.然后将分离胶小心移入染色器皿中。 

D.在染色器皿中加入50ml染色液（大约5倍体积），保鲜膜密封，摇床染色3h。 

7)、脱色 

将染色液倒去。染色的凝胶用水漂洗数遍，沥干水后置于染色皿中，再加入100ml脱色液，加盖，摇床脱色至染色的凝胶经脱色后能清晰显示出蛋白条带为止。 

5、Western杂交技术 

通常我们将样品变性好后在10%SDS-PAGE胶上电泳，蛋白通过半干转膜仪转移到PVDF膜上。经过一抗和二抗标记，利用GE公司ECL化学发光底物显色，最终用X-ray底片显色。 

1）按照上述SDS-PAGE的方法进行电泳，但是只是用一块凝胶。 

2）转膜 

A.剪一块与PAGE胶大小相当的Immobilon-P Transfer Membrane以及4片3mm Whatman Chromatography paper。先将Immobilon-P Transfer Membrane浸于甲醇中大约30min，再在Transfer buffer中浸泡一下。在此期间可将海绵和Whatman Chromatography paper也浸于Transfer buffer。 

B.制作电转三明治，顺序如下: 

正级（白色或其他浅色）  海绵 

                        2张Whatman Chromatography paper 

                        Immobilon-P Transfer Membrane 

                        PAGE胶 

                        2张Whatman Chromatography paper 

负级（黑色）            海绵 

当把膜覆于胶上之后，用铲子赶走气泡。 

3）把三明治夹子放入预装有冰上预冷的Transfer Buffer的电泳槽中，在负极一侧放入冰盒，加盖，接通电源。恒压100V，1h。 

4）转膜完成后，先将Immobilon-P Transfer Membrane在1×TBST wash buffer中摇床浸泡5min。 

5）将Immobilon-P Transfer Membrane浸泡在含5%脱脂牛奶的1×TBSTwash buffer中，存放于4℃冰箱中过夜。 

6）将Immobilon-P Transfer Membrane放在三面封口的塑料袋中，加入5ml含5%脱脂牛奶的1×TBST wash buffer和2.5μl 6×His tag antibody的混合液，用移液管轻轻转动赶走气泡。置于摇床上孵育1h。 

7）剪开塑料袋将Immobilon-PTransfer Membrane取出，用1×TBST wash buffer清洗3×10min。 

8）将一块保鲜膜展平铺于实验台上，用镊子将膜的边缘轻轻接触一块手巾纸将水沥干，平铺于保鲜膜上。 

9）取一只15ml离心管，各取1ml Detection reagent1和Detection reagent2，混匀。 

10）用移液管吸取上述混合液滴于Immobilon-P Transfer Membrane上，计时1~5min。 

11）用保鲜膜将Immobilon-P Transfer Membrane包裹起来，放在一个film cassette中。 

12）在暗室中（将灯关掉），取出一片胶片，在左上方剪掉一角，将其置于film cassette中的胶上，注意要使胶片仅靠film cassette的边缘，盖好盖子，曝光1min。 

13）取出胶片，放于洗片机上冲洗胶片。 

14）再取出第二张新的未曝光的胶片，根据第一张胶片冲洗的效果来估计这次曝光的时间，进行第二次曝光。 

15）在胶片上做好记录，与标准的marker图像做对比，估计表达的蛋白的分子量大小。 

6、用于质谱分析的蛋白样品制备 

大约5×10⁷稳定表达Flag-GFP和Flag-GFP-ALKBH4的293T细胞约10mg总蛋白裂解液用于蛋白样品的制备。应用免疫沉淀的方法，细胞裂解液与100ul偶联FLAG抗体的珠子（anti-FLAG M2 agarose，sigma）4℃孵育5个小时，再用含有250mM NaCl的TBS缓冲液清洗三次，结合在珠子上带有FLAG标签的蛋白用pH 3.5的终浓度为100mM的甘氨酸（glycine）洗脱。洗脱下来的蛋白经SDS-PAGE分离，银染。切下特异性条带蛋白，送公司做LC-MS/MS质谱分析。 

7、细胞培养 

冻存细胞复苏：提前将水浴锅调制37℃，从液氮罐中取出冻存的细胞迅速放入37℃水浴锅中，然后在水浴锅中不断地摇动冻存管，直到细胞冻存液刚刚融化为止。用无菌吸管将细胞从冻存管中吸出，放入预先加入培养基的离心管中，室温转速1000rpm离心3分钟去上清，最后用完全培养基把细胞重悬，放入37℃培养箱中培养。 

细胞培养：MRC5细胞、293T细胞、OSC-20细胞和TOC2细胞的培养基为含有10%小牛血清，100U/ml双抗（青链霉素），非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基（Invitrogen，31800022）。U2OS细胞使用DMEM高糖培养基培养，其他成分相同。所有细胞均在37℃，含5% CO2培养箱中培养。细胞传代：先吸去培养皿中培养液，PBS洗一次，加入胰酶在37℃消化细胞，显微镜下见细胞变圆或细胞脱落后，用完全培养基终止消化，消化过程大约3-10分钟，具体时间根据细胞类型而定，轻轻吹打几次将 细胞吹散，取出一定量细胞到新的培养皿中用于其它实验，将多余细胞吸出弃到废液缸中，培养皿中加入新鲜的培养基继续培养。 

细胞冻存：配制含有10%DMSO和20%小牛血清的RPMI1640或DMEM冻存液，放入4℃冰箱预冷，将贴壁细胞消化离心收集后，用事先4℃预冷的冻存液重悬细胞，按每一个直径10cm培养皿细胞分装一个冻存管，将冻存管放入到装有异丙醇的程序冻存盒中，置于-80℃冰箱中过夜，次日保存到液氮罐中。 

8、稳定细胞系的建立 

本发明中分别以293T，MRC5细胞为受体细胞，分别构建了稳定表达GFP蛋白、GFP-ALKBH4蛋白、3×Flag蛋白、3×Flag-ALKBH4蛋白、HA蛋白、HA-β-actin蛋白的稳定表达细胞系。建立过程如下：先将重组质粒用限制性内切酶线性化，线性化所选酶切位点原则：质粒线性化后不影响其在真核细胞中目的蛋白及抗性基因的表达，将线性化质粒纯化定量。在转染前24小时接种适当数量细胞到六孔板中使其在转染时达到60%-70%，并用不含抗生素的培养基培养。将4μl Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668-027)和2μg目的质粒分别于250μl无血清的培养基OPTI-MEM（31985,Gibco）混合，静止5分钟后，将两者混合摇匀，并静止15分钟。期间吸去原培养基，用PBS洗一次再加入500μl无血清抗生素的OPTI-MEM培养基到六孔板中，静止时间到后将质粒和Lipofectamine 2000混合物加到六孔板中，4小时后换成不含抗生素的培养基继续培养。约24小时后加入新霉素G418筛选阳性细胞，约十天左右含GFP荧光蛋白的稳定细胞系用流式细胞仪筛选阳性细胞，将一定数量的阳性细胞继续培养，经免疫印迹实验验证蛋白表达之后，一部分冻存，一部分用于后续实验。其它标签蛋白的稳定细胞系用G418筛选到大量扩增为止，下一步冻存或者用于后续试验。 

9、免疫荧光技术 

1)在六孔板中接种约30-40%的细胞，次日加入药物或转染DNA、RNA，48小时后收细胞。 

2)用PBS洗两次。 

3)固定：每个孔加入1ml在-30℃冰箱预冷的甲醇，在冰上固定约10分钟。 

4)渗透打孔：PBS洗三遍，加入1ml 0.1%TritonX-100和0.5%NP-40给细胞进行渗透处理，冰上孵育10分钟。 

5)封闭：PBS洗三遍后，用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭30分钟。 

6)把盖玻片取出放在铺有封口膜的六孔板中，加入100μl用含5%脱脂奶粉TBST稀释的一抗，37℃孵育一小时。 

7)把盖玻片取出放在没有封口膜的六孔板中，用TBST清洗三次，每次5分钟。 

8)把盖玻片取出放在铺有封口膜的六孔板中，加入100μl用含5%脱脂奶粉TBST稀释的荧光二抗，将其放在暗盒中37℃孵育半小时。 

9)把盖玻片取出放在没有封口膜的六孔板中，用TBST清洗三次，每次5分钟，再用PBS洗一次。 

10)最后用含有DAPI(Vector H-1200)的封片剂染细胞核，用透明指甲油封片子。用Leica TCS SP5共聚焦荧光显微镜对细胞定位进行观察。 

10、免疫共沉淀技术 

1)在10cm培养皿中接种约30-40%的细胞，次日转染质粒，48小时候后收集细胞，离心，PBS清洗两次。 

2)加入细胞沉淀五倍体积的0.1%NET细胞裂解液，冰上放置30分钟。 

3)超声裂解细胞，将EP管放在冰上并用浮漂固定，超声条件：10%输出功率，超声时间1分钟，每次超声10秒，停20秒。 

4)超声后在4℃离心机中离心，转速14800rpm离心10分钟。取出上清溶液，用Bradford定量蛋白，取出200μg作为总蛋白，加入5×的蛋白上样缓冲液，95℃变性10分钟。 

5)取35μl抗Flag、HA或GFP珠子加到1.5ml EP管中，用含150mM NaCl的TBS缓冲液清洗三次。 

6)取1.5mg总蛋白加到清洗完的珠子中，再加入0.1%NET裂解缓冲液补齐到1ml，将EP管放到旋转培养器上4℃孵育5小时。 

7)用4℃离心机转速5000g离心1分钟，弃去上清，加入1ml含150mM NaCl的TBS缓冲液放到旋转培养器清洗5分钟，4℃转速5000g离心1分钟，弃去上清，重复洗三次。 

8)离心弃去上清后，再离心一次，用注射器将液体吸干净，加入30μl 2×蛋白上样缓冲液和70μl 1×蛋白上样缓冲液，混匀，95℃变性10分钟。用于SDS-PAGE、后续银染、Western实验。 

11、质粒转染 

1)转染前一天在10cm培养皿中接种30%细胞到10ml无抗生素培养基中。 

2)对于每个转染孔，稀释5μg质粒到500μl无血清和抗生素的OPTI-MEM培养基中，混匀，取30μl 1mg/ml的PEI加到里面，混匀，室温静止15分钟。 

3)将培养皿中培养基吸除，用PBS清洗一次，再加入4.5ml无血清和抗生素的OPTI-MEM培养基，时间到后将前面的质粒混合物加到细胞中，放到37℃培养箱继续培养，4-6小时候吸除含转染试剂培养基，换上新鲜的完全培养基继续培养，48小时后检测。 

12、siRNA转染 

1)针对人ALKBH4的mRNA序列，我们委托上海吉玛公司设计并合成三条条针对不同靶点的siRNA。 

2)转染前一天在六孔板中接种30%细胞到2ml无抗生素培养基中。 

3)对于每个转染孔，稀释60pmol siRNA到250μl无血清和抗生素的OPTI-MET培养基中，混匀。再加入6μl Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，13778150)，混匀，室温静止15分钟。 

4)在静止期间，将六孔板中培养基吸除，用PBS清洗一次，在转染孔中加入750μl无血清和抗生素的OPTI-MEM培养基。 

5)静止时间到后，将混合物加到转染孔中。37℃培养箱中培养4-6小时换成不含抗生素的完全培养基。48小时后实验检测。 

13、流式细胞技术检测细胞周期 

1)转染前一天在10cm培养皿中接种30%细胞到10ml无抗生素培养基中。24小时后，转染siRNA，4-6小时换液，放37℃培养箱培养。 

2)48小时后消化收集细胞，室温1000rpm离心5分钟，用PBS洗一次，再用细胞周期试剂盒（CycleTest Plus DNA regent kit，BD，Cat：340242）中buffer solution清洗一次，离心，弃上清。 

3)每个样品加入100μl buffer A，37℃孵育10分钟。 

4)加入100μl buffer B，37℃孵育10分钟。 

5)加入100μl buffer C，避光室温孵育10分钟。 

6)流式细胞仪检测。 

14、流式细胞技术检测M期细胞 

1)转染前一天在10cm培养皿中接种30%细胞到10ml无抗生素培养基中。24小时后，转染siRNA，4-6小时换液，放37℃培养箱培养。 

2)48小时后消化收集细胞，室温转速1000rpm离心5分钟，用PBS洗一次，再用加1ml4%多聚甲醛固定细胞，冰上固定10分钟。 

3)加10ml含1%FBS的PBS洗一次，室温转速1000rpm离心5分钟，弃上清。 

4)慢慢加入1ml-30℃预冷的90%甲醇，使细胞渗透穿孔，放在冰上静止30分钟。 

5)加10ml含1%FBS的PBS洗一次，室温转速1000rpm离心5分钟，弃上清。 

6)加100μl 1%BSA封闭，37℃封闭30分钟。 

7)室温室温1000rpm离心5分钟，弃上清，加100μl用1%BSA稀释好的抗Histone H3-S10P的一抗，在37℃孵育1小时。 

8)室温1000rpm离心5分钟，弃上清，加10ml PBST清洗，离心弃上清。 

9)加100μl用1%BSA稀释好的二抗，在37℃孵育30分钟。 

10)室温1000rpm离心5分钟，弃上清，加10ml PBST清洗，离心弃上清。 

11)用200μl PBS重悬细胞，再加入10μl浓度为10mg/ml的RNase A，混匀，在37℃孵育30分钟。 

12)加20μl浓度为1mg/ml的碘化丙啶（PI）溶液，避光孵育10分钟。 

13)流式细胞仪检测。 

15、流式细胞技术检测细胞凋亡 

1)转染前一天在10cm培养皿中接种30%细胞到10ml无抗生素培养基中。24小时后，转染siRNA，4-6小时换液，放37℃培养箱培养。 

2)48小时后消化收集细胞，室温转速1000rpm离心5分钟，用PBS洗一次， 

3)接下来使用北京佳美公司细胞凋亡试剂盒Annexin V-FITC & PI Detection Kit标记凋亡细胞，后面按试剂盒方法操作。 

4)流式细胞仪检测。 

16、分离收缩环和中体蛋白。 

1)在MRC5细胞生长到50%左右时，加入终浓度为2mM的胸腺嘧啶核苷（thymidine）培养16小时，再用PBS洗一次，加入新鲜培养基继续培养4-5小时，再加终浓度为0.1μg/ml的nocodazole继续培养5小时。 

2)药物处理时间达到后开始收集分裂期细胞，处于分裂期的细胞会收缩变圆贴壁不牢固，所以我们采用摇晃培养瓶将分裂期的细胞摇晃下来，将收集到的分裂期细胞有新鲜的37℃培养基洗两次，再加入新鲜的37℃培养基继续培养0.5-1小时，目的是为了使细胞处于胞质分裂期。 

3)将得到的细胞分成两部分，一部分用蛋白裂解缓冲液裂解提取总蛋白，另一部分加入终浓度为5μg/ml的taxol和phalloidin稳定纺锤体微丝微管结构，孵育0.5-1分钟，室温转速1000rpm离心1分钟，弃去上清，沿着管壁慢慢加入灭菌水清洗细胞，吸去水份。 

4)加入十倍细胞沉淀体积的低渗裂解缓冲液（2mM Pipes at pH6.9,0.25% Triton X-100,20ug/ml taxol)，重悬细胞，室温孵育20分钟， 

5)室温转速2000rpm离心20分钟，弃去上清，放在冰上冷却。 

6)加1ml 50mM pH6.3MES将裂解缓冲液清洗干净，再用100μl 50mM pH6.3MES重悬沉淀，将重悬的沉淀铺在40%的甘油上，室温转速2000g离心20分钟，得到沉淀蛋白。加50μl蛋白上样缓冲液，95℃变性蛋白。 

实施例二：纯化ALKBH4融合蛋白制备抗ALKBH4蛋白兔源抗体 

1、ALKBH4蛋白结构域和可能的活性机制 

大肠杆菌AlkB蛋白为单核非血红素Fe²⁺和α-酮戊二酸依赖的双加氧酶超家族成员，其以金属离子为辅基以氧气分子为共底物，激活双氧分子催化氧化与稳定杂环上氮原子相接触的甲基团，使之构象发生变化，从而通过释放甲醛的形式移除甲基团。ALKBH蛋白是人加双氧酶AlkB蛋白家族一员，这个家族蛋白的共性是具有大肠杆菌AlkB蛋白功能结构域：二价铁离子结合结构域即HxDx_nH结构域，α-酮戊二酸和底物结合结构域即RxxxxxR结构域。而ALKBH4蛋白也具有这样的结构域：铁离子结合结构域H169-D171-H254，α-酮戊二酸和底物结合结构域R265-R271，如图1所示。组蛋白去甲基化酶JHDM家族蛋白也属于铁离子和α-酮戊二酸依赖的加双氧酶蛋白，它们是特异性的蛋白质去甲基化酶，而加双氧酶AlkB家族蛋白与JHDM家族蛋白具有相同的去甲基化机制，如图2所示，这说明AlkB家族蛋白的作用底物也可能是蛋白质，即ALKBH4蛋白是潜在的蛋白质去甲基化酶。 

2、纯化6×His-ALKBH4野生型和突变体融合蛋白。 

根据ALKBH4的结构域和与组蛋白去甲基化酶相似的去甲基化机制，我们预测ALKBH4蛋白具有蛋白质去甲基化的活性，因此要研究ALKBH4的活性，首先要分析ALKBH4蛋白在体外的生化活性，我们构建了大肠杆菌表达的重组质粒pDEST17-ALKBH4，他可以表达6×His-ALKBH4融合蛋白，表达得到的人ALKBH4cDNA序列见序列表SEQ ID NO.1，翻译得到的人ALKBH4蛋白序列见序列表SEQ ID NO.6。我们使用Stratagene公司的定点突变试剂盒构建pDEST17-ALKBH4 H169A-D171A-H254A突变体质粒，所用的点突变引物有：H169A-D171A突变引物SEQ ID NO.18和H254A突变引物SEQ ID NO.19两个点突变引物，表达得到的人ALKBH4 HDH突变体cDNA序列见序列表SEQ ID NO.2，翻译得到的人ALKBH4HDH突变体蛋白序列见序列表SEQ ID NO.7。 

纯化6×His-ALKBH4野生型蛋白和HDH突变体融合蛋白蛋白：野生型和突变体重组质粒转化到蛋白酶缺陷型BL21感受态细胞中，涂平板，挑取单克隆，接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37度摇床中培养扩增。当波长600nm处吸光值达到0.5-0.6之间时，加入终浓度0.1mM IPTG 25℃诱导培养4小时。在4℃转速4000rpm离心收集菌体，将细菌沉淀重悬在十倍体积裂解液中，超声破碎，超声条件随裂解条件不同而不同，超声后，在4℃转速16000rpm离心20分钟，上清即为可溶蛋白。 

利用Bio-Rad的快速蛋白纯化系统对可溶蛋白进行纯化，对于6×His标签的蛋白，第一步，利用Bio-Scale IMAC cartridge（BIO-RAD 732-4610）进行亲和纯化，再用SDS-PAGE电泳及考马斯亮兰染色来鉴定所得蛋白的纯度，纯化结果如图3所示。图中，M代表蛋白分子量标准品，S代表可溶性蛋白，F代表可溶性蛋白上完柱子流出的成分，数字代表收集管编号。 

从结果可看出，前面的收集管纯度不高，后边的纯度高，因此我们将野生型蛋白的12-20号管收集在一起， 将突变体的8-12号管收集在一起，用Bradford试剂定量蛋白发现浓度较低。下一步使用蛋白浓缩管浓缩蛋白，我们使用的蛋白浓缩管是赛多利斯公司的VIVASPIN 20浓缩管，可以截留10KD以上蛋白分子，这样既可以浓缩蛋白又可以去除小分子杂质。浓缩后的蛋白定量并用SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色、免疫印迹实验检测纯度，结果如图4所示，图4a是考马斯亮蓝染色结果，图4b，c是免疫印迹实验结果。结果显示我们所得到的蛋白纯度超过95%，已达到生化分析的纯度。 

3、纯化GST-ALKBH4融合蛋白及制备用于免疫荧光实验的抗体 

研究一个蛋白的功能抗体是非常关键的实验材料，由于没有商业化的ALKBH4抗体，所以我们要自己制备抗体，首先我们要研究ALKBH4在细胞内定位及需找ALKBH4作用底物及其相互作用因子，这样就需要制备一个可以识别ALKBH4分子立体表位的抗体，我们就需要纯化一个具有自然构象的ALKBH4分子作为免疫原，由于之前纯化的6×His-ALKBH4融合蛋白的纯度不够做抗体的标准，因此我们选用GST标签质粒作为表达系统。首先我们构建pGEX-5X-2-ALKBH4重组质粒，选择酶切位点，设计引物，正向引物为SEQ ID NO.11，反向引物为SEQ IDNO.12，从293T细胞中提取mRNA，逆转录PCR扩增ALKBH4基因，扩增到的ALKBH4 cDNA序列为SEQ ID NO.1，酶切连接，挑单克隆提质粒测序，验证无误后，扩增质粒。质粒表达得到的ALKBH4蛋白序列为SEQ ID NO.6。 

纯化GST-ALKBH4野生型融合蛋白：首先要进行可溶性鉴定，重组质粒转化到蛋白酶缺陷型的BL21感受态细菌中，涂平板，挑取单克隆，接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃摇床中扩增培养。当波长600nm吸光值达到0.5-0.6之间时，加入0.1mM IPTG 25℃诱导培养4小时。室温转速4000rpm离心收集菌体。将细菌沉淀重悬在十倍体积的裂解液中，超声破碎，超声后取出五分之一作为总蛋白，在4℃转速16000rpm离心20分钟，上清即为可溶蛋白，再将总蛋白（T）、上清（S）和沉淀（P）加蛋白上样缓冲液，95℃变性10分钟。用不转质粒的BL21作为对照，处理方法如上。将处理过的样品按相同的比例上两组样，一组做SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色，另一组做免疫印迹实验验证可溶性及表达。结果如图5a所示，GST-ALKBH4融合蛋白表达量高而且可溶性很好。 

下一步利用Bio-Rad的快速蛋白纯化系统对可溶蛋白进行纯化，对于GST标签的蛋白，第一步，利用Bio-Scale Profinity GST cartridge(BIO-RAD，732-4620)进行亲和纯化，结果纯化蛋白量很大但纯度不高，如图5b所示。此时蛋白纯度不够用于制备抗体，因此下步将采取离子交换层析进一步纯化，软件分析得到GST-ALKBH4融合蛋白的等离子点pI值是6.86，接近中性离子交换效果很难确定，我们选择使用阳离子交换柱（Column UNO-S1，BIO-RAD）进行进一步的纯化。结果纯化效果很好，所有收集管的蛋白纯度都达到了制作抗体的标准，纯度达到98%以上，纯化结果如图5c所示。图中，M代表蛋白标准品，S代表可溶性蛋白，F代表可溶性蛋白上完柱子流出的成分，数字代表收集管编号。将所得蛋白收集混合后用赛多利斯公司的VIVASPIN 20浓缩管浓缩，送到北京京天成生物技术有限公司制备抗体。纯化抗体：公司将免疫完成的兔子杀死放血，离心取血清，使用sigma公司的ProteinA Sepharose亲和层析纯化兔源抗体。我们将得到的ALKBH4抗体加入1.5M的叠氮化钠使终浓度达到15mM，加叠氮化钠目的是为了防止抗体被细菌分解。 

抗体验证：在MRC5细胞中使用siRNA沉默ALKBH4基因，具体RNA沉默方法见实施例一，所用ALKBH4siRNA序列见序列表SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29，我们将这三个siRNA序列混合转染细胞来降低ALKBH4蛋白表达。再采用免疫荧光方法检测ALKBH4抗体的特异性，发现这个抗体特异性的定位在胞质分裂的中体结构及中心体，如图7所示，后续还有免疫荧光实验验证ALKBH4在细胞内的定位。 

4、制备用于免疫印迹实验的兔源ALKBH4抗体 

要制备能够用于免疫印迹实验的抗体，为了提高抗体的特异性，多肽作为免疫原的抗体是最佳选择。我们与康维世纪公司合作，公司合成ALKBH4上免疫原性高的多肽101-QSGRKKQDYGPK-112，如图8a所示。三次免疫兔子，具体试验流程及使用试剂公司保密。免疫好的杀兔子取血离心获得血清，用Sigma公司的Protein A纯化抗体。将纯化好的抗体，用免疫印迹实验验证ALKBH4抗体的特异性。将前面纯化的GST-ALKBH4蛋白和GST蛋白变性处理，上两组样SDS-PAGE电泳，转膜，分别使用ALKBH4抗体和GST抗体杂交验证，结果发现ALKBH4抗体可以识别GST-ALKBH4蛋白，虽然下面有几条杂带，但是GST抗体杂交后发现是降解的蛋白，所以这个抗体可以用于免疫印迹实验，如图8b所示。我们还在真核 细胞中检测ALKBH4抗体特异性及蛋白表达水平，使用ALKBH4 siRNA在MRC5细胞中沉默ALKBH4基因，所用ALKBH4 siRNA序列见序列表SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29，裂解细胞提取蛋白做免疫印迹实验检测，结果发现转染siALKBH4的细胞中ALKBH4表达量明显低于对照组，如图8c所示，这说明ALKBH4可以特意的识别真核细胞表达的ALKBH4蛋白。 

总结，我们纯化了用于生化活性分析的6×His-ALKBH4野生型和HDH突变体融合蛋白，为下一步分析ALKBH4蛋白活性做好准备。同时还制备了可以用于免疫荧光实验和免疫印迹实验的两种抗体，并通过基因沉默实验验证了这两个抗体的特异性，为后面的功能研究打下基础。 

实施例三：验证ALKBH4基因在细胞内的定位及表达 

1、ALKBH4蛋白定位在中心体（centrosome）上。 

本实验通过免疫荧光技术来验证ALKBH4在细胞内定位，将MRC5细胞接种到铺有盖玻片的六孔板中，接种密度30-40%，次日晚上加入终浓度0.04μg/ml的Nocodazole处理16小时，加Nocodazole目的是使细胞阻滞于有丝分裂期。16小时后用PBS洗一次，换成新鲜的完全培养基继续培养1小时，PBS洗两次，固定渗透打孔，具体方法同实施例一。一抗使用中心体标记物γ-tubulin和纺锤体标记物α-tubulin与ALKBH4抗体共同杂交，二抗使用FITC偶联抗鼠二抗和Cy3偶联的抗兔二抗杂交。使用共聚焦显微镜，拍摄细胞周期每个时期的ALKBH4细胞定位，从细胞间期到有丝分裂末期，结果中看到ALKBH4每个时期都与中心体标记物γ-tubulin共定位，如图9a所示，这说明ALKBH4蛋白定位在中心体。同时我们还发现在分裂后期和末期，ALKBH4蛋白在收缩环（contractile ring）和中体（midbody）上定位，如图9b所示，下面将详细说明。但没有发现ALKBH4与纺锤体标记物α-tubulin共定位，只是在有丝分裂末期在中体上共定位，说明ALKBH4不定位在纺锤体上，如图9b所示。 

为了进一步验证ALKBH4蛋白在中心体上定位，我们构建MRC5/3×Flag和MRC5/3×Flag-ALKBH4稳定细胞系，目的鉴定外源表达的ALKBH4在细胞内的定位，首先构建3×Flag标签的ALKBH4质粒，所用引物见序列表正向引物SEQ ID NO.14和反向引物SEQ ID NO.15，扩增得到人ALKBH4 cDNA见序列表SEQ ID NO.1，表达人ALKBH4野生型蛋白见序列表SEQ ID NO.6。同时还构建3×Flag标签的ALKBH4H169A-D171A-H254A突变体质粒，所用的点突变引物有：H169A-D171A突变引物SEQ ID NO.18和H254A突变引物SEQ ID NO.19两个点突变引物，表达人ALKBH4HDH突变体蛋白见序列表SEQ ID NO.7。再将构建好的质粒转染MRC5细胞构建稳定细胞系。我们用Flag和γ-tubulin抗体共同杂交，并用相应的荧光二抗杂交。结果发现外源的ALKBH4蛋白也与γ-tubulin共定位，而表达3×Flag空载体的细胞没有共定位，如图10a这就进一步证明ALKBH4定位在中心体上。我们还采用了蔗糖浓度梯度离心的方法分离中心体，并用免疫印迹实验方法检测ALKBH4在中心体中的表达情况，以中心体固有蛋白γ-tubulin和CEN1作为阳性对照，发现ALKBH4表达趋势与CEN1相同于γ-tubulin相同，如图10a所示，这个结果让我们确信ALKBH4蛋白定位在中心提示并是中心体的固有成分。 

2、ALKBH4定位在收缩环（contractile ring）和中体（midbody）上。 

前面的免疫荧光实验初步发现ALKBH4在有丝分裂后期及胞质分裂时与α-tubulin共定位，如图9b所示，我们猜测ALKBH4定位在中体上。为了验证猜测，使用F-actin的化学标记物phallotoxins-Texas Red与ALKBH4抗体共杂交细胞，F-actin可以明显标记出收缩环和中体结构，结果发现在MRC5细胞中ALKBH4蛋白与F-actin在收缩环和中体上有明显的共定位，如图11a所示，同时外源3×Flag-ALKBH4也于F-actin在收缩环和中体上有明显的共定位，如图11b所示。又将ALKBH4抗体与收缩环和中体的另一个分子标记物anillin共同做免疫荧光染色，结果显示ALKBH4与anillin在收缩环和中体上完全共定位，如图11c所示。这些结果证明ALKBH4定位在收缩环和中体上。 

为验证ALKBH4分子是收缩环和中体组分，我们用化学方法从MRC5细胞中分离收缩环和中体蛋白，用taxol和phalloidin稳定纺锤体微丝微管，低渗处理裂解细胞，获得收缩环和中体蛋白，免疫印迹方法验证ALKBH4是否在上面表达，我们用收缩环和中体标记蛋白NM II，Plk1，actin和α-tubulin作为阳性对照蛋白，p53作为阴性对照蛋白，结果如图11d所示，ALKBH4与阳性对照分子都在我们分离到的收缩环中体组分中表达，而阴性对照分子p53在上面没有表达，这说明我们的分离方法成功，并证明ALKBH4是收缩环和中体蛋白。 

总结，免疫荧光实验证明ALKBH4定位在中心体、收缩环和中体上，中心体及收缩环和中体分离实验证明ALKBH4是这些细胞器的组分。 

实施例四：验证ALKBH4相互作用蛋白及作用底物 

1、研究ALKBH4潜在作用底物或相互作用因子 

从前面对结果得知ALKBH4定位在中心体、收缩环和中体上，所以我们预测ALKBH4与细胞分裂相关的，可能参与细胞分裂过程中某些蛋白的去甲基化。虽然已有文章表明ALKBH4蛋白在体外实验中具有生化活性，但是它的具体作用底物及相互作用蛋白还不清楚。我们采用免疫沉淀的方法来探寻ALKBH4蛋白的相互作用因子或去甲基化底物，首先构建pEGFP-C1b-ALKBH4质粒，所用引物如序列表：正向引物SEQ ID NO.13和反向引物SEQ ID NO.12，扩增得到ALKBH4 cDNA序列如序列表SEQ ID NO.1，将其连入质粒测序扩增，表达人ALKBH4蛋白见序列表SEQ ID NO.6。同时还构建pEGFP-C1b-ALKBH4 H169A-D171A-H254A突变体质粒，所用的点突变引物有：H169A-D171A突变引物SEQ ID NO.18和H254A突变引物SEQ ID NO.19两个点突变引物，这个质粒表达人ALKBH4HDH突变体cDNA见序列表SEQ ID NO.2，翻译人ALKBH4 HDH突变体蛋白见序列表SEQ ID NO.7。在转染到293T细胞构建稳定细胞系。将培养的293T/Flag-GFP和293T/Flag-GFP-ALKBH4稳定细胞系用0.04μg/ml nocodazole处理细胞16小时，将其同步化到有丝分裂期，再将细胞裂解用免疫沉淀的方法收集到Flag-GFP、Flag-GFP-ALKBH4蛋白及与它们相互的蛋白样品。将两组样品变性处理，SDS-PAGE电泳，用银染试剂盒将胶染色，同时还用免疫印迹实验验证免疫共沉淀方法的效率，结果如图12a，b所示，我们的样品组与对照组相比具有多条特异性的条带，将这些条带切下送到北京集思佳扬生物科技公司做质谱分析，使用的检测方法是色谱质谱联机LC-MS/MS二级质谱分析，同时还检测蛋白质的甲基化状态。得到分析结果后，我们从中筛选可信度高而且是与细胞分裂相关的蛋白，从结果中找到肌动蛋白（actin）、非肌肉二型肌球蛋白（NM II）等蛋白，其中actin的可信度最高，且具有一个单甲基化位点即第84为赖氨酸单甲基化（K84me1）修饰。检测到actin具有甲基化的肽段是69-YPIEHGIVTNWDDME_mKIWHHTFYNELR-95，质核比m/z=1153.22，电荷数3，分子量为MH+(Da)=3457.661106，它比正常没有修饰的肽段分子量大14.02Da，这个分子量大小正好是一个甲基基团的大小，把质谱数据用软件分析，搜索蛋白质数据库得知这个甲基化修饰正位于actin K84的位置，结果如图12c，d所示。 

2、验证ALKBH4是否与actin相互作用 

为验证ALKBH4与actin是否有相互作用，我们构建了HA标签的β-actin重组质粒，所用引物序列见序列表：正向引物SEQ ID NO.16和反向引物SEQ ID NO.17，扩增得到β-actin cDNA见序列表SEQ ID NO.4，将其连接到pcDNA3-HA质粒中表达β-actin野生型蛋白见序列表SEQ ID NO.9。首先研究外源的ALKBH4是否与外源的β-actin相互作用，用抗Flag标签的琼脂糖凝胶珠子做免疫共沉淀实验检测Flag-GFP-ALKBH4是否与HA-β-actin相互作用，结果表明Flag-GFP-ALKBH4可以与HA-β-actin相互作用，如图13a所示。下一步我们又验证内源的ALKBH4与β-actin间的相互作用，分别使用β-actin和ALKBH4抗体做免疫共沉淀实验，结果内源ALKBH4蛋白与β-actin可以相互pull down下来，结果如图13b，c所示，这说明ALKBH4与actin之间具有相互作用。 

实施例五：actin K84是ALKBH4和NM II结合的关键位点。 

1、acitn的第84位赖氨酸对ALKBH4的结合起到关键作用 

前面的结果表明ALKBH4蛋白与actin相互作用，并在质谱结果中得到相互作用的actin蛋白上具有一个甲基化位点K84me1，所以我们猜测这个甲基化位点很有可能就是ALKBH4的结合位点。为了证明我们的猜测，我们用Sratagene公司的定点突变试剂盒将HA-β-actin质粒的β-actin第84位赖氨酸突变成丙氨酸即K84A，所用点突变引物见序列表SEQ ID NO.20，表达β-actin K84A突变体cDNA见序列表SEQ ID NO.5，翻译β-actin K84A突变体蛋白见序列表SEQ ID NO.10。用同样的免疫共沉淀的方法检测actin K84A突变是否与ALKBH4相互作用。将Flag-GFP-ALKBH4和HA-β-actin共同转染293T细胞，Flag标签免疫共沉淀结果发现Flag-GFP-ALKBH4可以将外源野生型的HA-β-actin pull down下来，但不能将HA-β-actin K84A突变体pull down下来，用actin抗体检测内源actin是否能够结合，我们发现在两组样品中内源的actin都可以被Flag-GFP-ALKBH4 pull down下来，如图14a所示，这说明actin K84对ALKBH4的结合起到关键作用。为了充分证明这个结论，我们有做了反向的免疫共沉淀，即用HA-β-actin拉3×Flag-ALKBH4，结果发现HA-β-actin可以将3×Flag-ALKBH4拉下来，但是HA-β-actin K84A突变体却不可以，如图14b所示，这两个实验证据说明actin K84是ALKBH4的结合关键位点。 

Actin K84是ALKBH4的结合位点，而且我们的质谱结果发现actin K84me1修饰，ALKBH4还是潜在的蛋白质去甲基化酶，所以我们猜测ALKBH4可能是actin K84me1的去甲基化酶，ALKBH4的铁离子结合位点已被证明是决定其生化活性的关键位点，所以如果ALKBH4是actin K84me1的去甲基化酶，那么将ALKBH4的酶活性关键位点突变会使它与底物的结合能力增强。根据这个设想我们设计实验将ALKBH4的HDH结构域突变掉，看这个突变是否像我们设想的那样影响ALKBH4与actin之间的相互作用能力，所用的点突变引物有：H169A-D171A突变引物SEQ ID NO.18和H254A突变引物SEQ ID NO.19两个点突变引物，这个质粒表达人ALKBH4 HDH突变体cDNA见序列表SEQ ID NO.2，翻译人ALKBH4 HDH突变体蛋白见序列表SEQ ID NO.7。将这个突变体和野生型共同转染293T细胞做免疫共沉淀实验，结果发现Flag-GFP-ALKBH4 HDH突变体与HA-β-actin之间的结合能力比野生型增强了很多，即Flag-GFP-ALKBH4 HDH拉下来更多的HA-β-actin，如图14c所示，这个结果说明ALKBH4很有可能是actinK84me1的去甲基化酶。 

2、ALKBH4与非肌肉二型肌球蛋白（NM II）相互作用 

从质谱数据结果得到ALKBH4蛋白可能与非肌肉二型肌球蛋白（NM II）之间有结合作用，所以我们要用免疫印迹实验验证下它们之间是否有相互作用，于是我们就将Flag-GFP-ALKBH4转染293T细胞做的免疫共沉淀实验，结果显示ALKBH4可以将NM II拉下来，如图15a所示，这说明NM II也可能是ALKBH4的相互作用因子或底物。 

Actin与NM II之间的相互作用已经发现很久，若ALKBH4能够将actin K84me1去甲基化，那么这个去甲基化反应在细胞内肯定是有功能的，那actin K84是否会影响NM II间的相互作用呢？通过查找文献发现已有科学家做过晶体结构分析，结果表明actin K84位点位于NM II的结合区域内，因此我们猜测actin K84的修饰或改变可能会影响NM II结合。我们采用抗HA免疫共沉淀方法在293T细胞中检测HA-β-actin野生型和K84A突变体与NM II的结合能力，实验结果表明HA-β-actin K84A与NM II的结合能力要比野生型的弱很多，如图15b所示，这说明actin K84是NM II的结合位点。我们还用反向的免疫共沉淀方法检测是否GFP-NM II是否能够结合HA-β-actin K84A突变体，结果显示GFP-NM II不能结合HA-β-actin K84A突变体，但能结合野生型HA-β-actin和内源的actin，如图15c所示，这说明actin K84是NM II的关键结 合位点。 

实施例六：ALKBH4和NM II之间的相互作用通过actin介导的。 

根据以上结果，我们已经知道ALKBH4与actin和NM II相互作用，actin与NM II之间的相互作用已经发表，现在我们想弄清楚这三个蛋白分子是如何相互结合的，是三个蛋白相互结合还是某个蛋白作为中间体连接另外两个蛋白？首先验证ALKBH4是否会影响actin与NM II的结合，在293T细胞中将ALKBH4基因沉默掉，所用三条ALKBH4 siRNA序列见序列表：SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29，抑制ALKBH4蛋白表达见序列表SEQ ID NO.6，结果显示ALKBH4的缺失不会影响到actin与NM II之间的相互作用，如图16所示，这说明ALKBH4没有介导actin与NM II的结合。第二，验证NM II基因是否会影响到ALKBH4间的相互作用，我们将293T细胞中NM II基因沉默掉，所用三条NM II siRNA序列见序列表：SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32，结果显示NM II缺失不会影响到ALKBH4和actin间的相互作用，结果如图17所示，这说明NM II也没有介导ALKBH4和actin间的相互作用。这个结果也通过加入NM II抑制剂Blebbistatin得到验证，在培养293T细胞时加入终浓度为5μM的Blebbistatin处理细胞3小时，药物处理后收细胞做免疫共沉淀实验，结果显示NM II抑制剂对ALKBH4和actin间的相互作用没有影响，只是破坏了NM II与actin间的结合，如图18所示，这两个实验结果验证NM II不会影响ALKBH4和actin间的相互作用。第三，验证actin是否会影响到ALKBH4和NM II间的相互作用，由于actin种类多且基因沉默效率低所以选用actin聚合抑制剂细胞松弛素D（Cytochalasin D，CCD），这个药物可以抑制actin聚合成纤维状actin（F-actin）。将终浓度为1μg/ml CCD加到293T细胞培养基中，培养1.5小时后收细胞裂解，在裂解缓冲液中也要加入1μg/ml的CCD，后面与正常的免疫共沉淀方法相同。结果显示actin抑制剂的加入导致ALKBH4与NM II和actin间的相互作用破坏，如图19所示，这说明actin是ALKBH4和NM II之间的相互作用的中间分子。根据以上结果我们推论ALKBH4和NM II同时结合在actin纤维上，actin纤维介导了ALKBH4和NM II间的相互作用。 

实施例七：ALKBH4是actin K84me1的去甲基化酶。 

现有结果我们知道ALKBH4与actin相互结合，actin K84是ALKBH4的结合关键位点，ALKBH4酶活性结构域失活导致与actin的结合作用增强，并且质谱结果中actin K84me1具有一个单甲基化位点，所有这些证据表明ALKBH4很有可能是actin K84me1的去甲基化酶。为了验证这一猜测首先制备了针对actin K84me1的抗体，找美国New England Peptide公司制备针对actin K84me1的抗体，他们是以actin上77-TNWDDMEmKIWHHTFY-91甲基化修饰的肽段免疫兔子得到抗血清，用Protein A纯化抗体，再用偶联甲基化多肽的层析柱纯化特异性的针对actin K84me1的抗体。 

验证抗体：我们将甲基化修饰的含K84me1多肽和没有甲基化修饰的K84多肽点到硝酸纤维素膜上，并用这个抗体杂交，结果显示actin K84me1抗体特异性识别甲基化修饰的多肽，不识别没有甲基化修饰的多肽，用丽春红S染色证明上样量相同，结果如图20a所示，同时我们还用外源表达HA-β-actin野生型和K84A突变体转染293T细胞来验证抗体的特异性，结果证明这个抗体不能识别HA-β-actin K84A但可以识别野生型，如图20b所示，这两个结果证明anti-actin K84me1的抗体具有非常特异的识别能力，可以用来验证actin K84me1的表达变化。 

验证ALKBH4是actin K84me1去甲基化酶：我们先在体内验证ALKBH4是否是actin K84me1的去甲基化酶，首先，将ALKBH4基因在U2OS细胞中沉默，所用三条ALKBH4 siRNA序列见序列表：SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29，抑制内源ALKBH4蛋白SEQ ID NO.6表达，检测到ALKBH4基因沉默引起actin K84me1表达量大幅度增加，如图21a所示，同时过表达外源3×Flag-ALKBH4导致actin K84me1表达量大量减少，而在U2OS细胞中过表达3×Flag-ALKBH4 HDH点突变则导致actin K84me1表达量增加，如图21b所示，这两个结果说明ALKBH4野生型蛋白在体内能够将actin K84me1去甲基化，而HDH突变体不具有这种活性。同时在U2OS细胞中过表达ALKBH4 siRNA不敏感的3×Flag-ALKBH4能够使actin K84me1回到正常水平，而酶活性结构域突变的3×Flag-ALKBH4 HDH却不能，如图21c所示，这说明3×Flag-ALKBH4野生型具有去甲基化活性，而HDH突变体没有活性。另外免疫共沉淀实验发现，ALKBH4和NM II都能将actin拉下来，但是ALKBH4拉下的actin多数是甲基化的，而NM II拉下来的actin都是没有甲基化修饰的，如图21d所示，这说明actin K84me1干扰NM II的结合，只有ALKBH4将actin K84me1去甲基化后NM II才能够结合在上面，ALKBH4的去甲基化活性是NM II沿着actin纤维滑动的关键因素。 以上结果说明在体内ALKBH4蛋白是actin K84me1的去甲基化酶，ALKBH4将actin K84me1去甲基化为NM II结合在actin上提供结合位点，也为NM II在actin纤维上滑动提供条件，而ALKBH4定位在收缩环上，收缩环收缩的主要动力来源就是NM II在actin纤维上的滑动作用产生的，因此ALKBH4事NM II在actin上滑动的决定性分子，它决定着收缩环能否收缩完成胞质分裂。 

实施例八：ALKBH4调控胞质分裂，ALKBH4缺失导致胞质分裂失败。 

现有结果已知ALKBH4的相互作用蛋白及去甲基化底物，但我们还不知道它的这些机制会导致什么样的细胞生物学变化，为了验证上一个实施例中关于ALKBH4控制着收缩环收缩决定胞质分裂的猜想，我们采用免疫荧光、流式细胞技术去验证。在前面的研究发现ALKBH4定位在收缩环、中体和中心体上，所以我们把研究的重点集中在细胞分裂的现象上。首先我们将MRC5细胞中ALKBH4基因沉默，所用三条ALKBH4 siRNA序列见序列表：SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29，抑制内源ALKBH4蛋白SEQ ID NO.6表达，用中体的标记物AuroraB和Plk1检测中体结构变化，发现MRC5细胞中ALKBH4沉默后Aurora B和Plk1的细胞定位都发生了明显的改变，如图22a，b所示，这说明ALKBH4基因沉默后中体结构发生异常。用中心体标记物γ-tubulin检测到ALKBH4基因沉默后中心体过度复制，与对照组相比ALKBH4基因沉默后中心体过度复制超过五倍以上，如图22c所示。我们用收缩环的标记物NM II和anillin检测到ALKBH4基因沉默后收缩环结构也出现异常，主要表现是anillin定位异常无法形成收缩环和在细胞多个位置形成缩环，如图22d，e所示。这说明ALKBH4基因沉默后，细胞分裂尤其是胞质分裂发生异常。 

收缩环和中体在胞质分裂中起到关键作用，若是它们出现异常可能会导致胞质分裂时间延长或是胞质分裂失败，首先验证细胞的分裂时间是否延长，若细胞分裂时间延长最明显的特征是分裂期细胞数量增多，因此用碘化丙啶（PI）染DNA，再用流式细胞仪检测MRC5细胞中ALKBH4基因沉默后G2/M期细胞是否增多。实验结果显示ALKBH4基因沉默后G2/M细胞明显增加，从统计结果看ALKBH4基因沉默导致G2/M期细胞增加了一倍，如图23a所示。为了进一步确定M期细胞是否增加，我们用抗M期细胞的特异性标记物组蛋白H3-S10p的抗体来标记M期细胞，结果显示MRC5细胞中ALKBH4基因沉默后M期细胞增加一倍以上，如图23a所示。同时还发现过表达3×Flag-ALKBH4HDH和HA-β-actin K84A突变体也引起MRC5细胞M期大幅增加，如图24所示，表明3×Flag-ALKBH4 HDH和HA-β-actin K84A突变体与野生型相比功能缺失，过量表达突变体导致内源野生型活性抑制。这说明ALKBH4基因沉默会引起细胞周期的阻滞，尤其在分裂期，前面结果发现ALKBH4基因沉默影响收缩环形成和中体结构，这些结果说明ALKBH4基因缺失导致细胞分裂阻滞在胞质分裂期，因此ALKBH4在调控胞质分裂中起到关键作用。既然ALKBH4基因沉默会引起细胞阻滞在胞质分裂期，那么后面的结果会是怎样呢？根据文献报道胞质分裂过程受到干扰会导致胞质分裂失败，最终会引起细胞凋亡或者形成多核细胞。因此我们设想ALKBH4基因沉默是否会有同样的后果，用免疫荧光的方法检测，用α-tubulin作为细胞骨架的标记物。实验结果表明MRC5细胞中ALKBH4基因沉默后产生大量的多核细胞，多核细胞产生的数量是对照组的五倍以上，如图25a所示。我们还用细胞凋亡试剂盒标记并使用流式细胞仪检测ALKBH4基因沉默后的细胞凋亡情况，结果表明MRC5细胞中ALKBH4基因沉默后细胞发生了大量凋亡，从统计结果看ALKBH4基因沉默组是对照组的三倍，如图25b所示。以上ALKBH4基因沉默导致的胞质分裂失败的现象在活细胞成像实验中得到验证，我们使用徕卡公司的共聚焦显微镜观测MRC5细胞中ALKBH4基因沉默后细胞胞质分裂的过程，结果发现ALKBH4基因沉默后胞质分裂出现了两个结局：一是胞质分裂没有完成两个子细胞又融合在一起这与多核细胞现象相对应，另一个现象是胞质分裂持续不能完成最后细胞凋亡，如图25c所示。ALKBH4基因沉默所产生的收缩环定位异常、M期细胞增多和多核细胞可以被外源表达siRNAture不敏感的Flag-GFP-ALKBH4修复，但Flag-GFP-ALKBH4 HDH突变体却不能，如图26所示。这使我们推论出ALKBH4蛋白在胞质分裂过程中的作用模型，在胞质分裂阶段，ALKBH4和NM II同时结合在actin纤维上，ALKBH4结合在NM II滑动方向的前方第84位赖氨酸甲基化的actin上，而NM II结合的actin是没有甲基化修饰的，ALKBH4蛋白在NM II前方不断地将actin K84me1去甲基化，这为NM II沿着actin纤维向前滑动提供条件，使得以actin纤维和NM II为基础的收缩环能够产生收缩力，促使胞质分裂完成，如图27所示。 

既然在人正常的MRC5细胞中ALKBH4基因沉默可以导致胞质分裂失败，那么在肿瘤或癌症细胞中是什 么样的反应会是怎样？为了鉴定ALKBH4基因沉默在肿瘤细胞中的反应，我们选了几种肿瘤细胞，如人骨肉瘤细胞U2OS、口腔鳞状细胞癌细胞OSC20和卵巢癌细胞TOC2。首先，在U2OS细胞中沉默ALKBH4基因，用碘化丙啶（PI）染DNA，再用流式细胞仪检测ALKBH4基因沉默后G2/M期细胞是否增多，结果表明U2OS细胞中ALKBH4基因沉默后G2/M细胞明显增加，从统计结果看ALKBH4基因沉默导致G2/M期细胞增加了一倍，如图28a所示。为了进一步确定M期细胞是否增加，用抗M期细胞的特异性标记物组蛋白H3-S10p的抗体来标记M期细胞，结果显示U2OS细胞中ALKBH4基因沉默后M期细胞增加一倍，如图28b所示。我们还用细胞凋亡试剂盒标记并使用流式细胞仪检测ALKBH4基因沉默后的细胞凋亡情况，结果表明U2OS细胞中ALKBH4基因沉默后细胞发生了大量凋亡，如图28c所示。同样在口腔鳞状细胞癌细胞OSC20和卵巢癌细胞TOC2细胞中ALKBH4基因沉默后也产生大量的细胞凋亡，如图29所示。这些结果说明ALKBH4基因沉默会导致肿瘤和癌症细胞胞质分裂失败最终引起大量的细胞凋亡。综上所述，人ALKBH4 siRNA序列、人ALKBH4的所有反义RNA序列、人ALKBH4抗体均能够预防或治疗癌症，所述癌症包括人骨肉瘤、口腔鳞状细胞癌和卵巢癌等。 

实施例九：ALKBH4基因敲除小鼠胚胎期致死，ALKBH4基因敲除小鼠细胞胞质分裂失败产生多核细胞并伴随细胞凋亡 

为了研究ALKBH4基因在动物体内的功能，我们构建基因敲除小鼠，小鼠ALKBH4基因有三个外显子，其中2,3外显子包含了ALKBH4基因的酶活性关键结构域，如图30a所示，所以将这两个关键结构域敲除小鼠ALKBH4蛋白将不能表达即产生ALKBH4基因敲除小鼠。传统型ALKBH4基因敲除小鼠在胚胎期是致死的，我们将ALKBH4^+/-杂交出生的小鼠中没有ALKBH4^-/-基因型小鼠，出生小鼠比例符合孟德尔定律即1(+/+):2(+/-):0(1,-/-)，如图30b所示，这说明ALKBH4基因在胚胎发育阶段非常重要。这个结果与actin基因敲除结果相同，现已有文献报道将actin基因敲除的小鼠在胚胎期是致死的。 

为了获得存活的ALKBH4基因敲除小鼠，我们构建可诱导型的ALKBH4基因敲除小鼠，同样将2,3外显子敲除，构建基因敲除载体时在2,3外显子两侧加两个重组酶Cre识别的LoxP位点，如图31a所示，所用PCR引物见序列表正向引物SEQ ID NO.21和反向引物SEQ ID NO.22扩增前段同源重组外显子1序列，正向引物SEQ ID NO.23和反向引物SEQ ID NO.24扩增基因敲除的外显子2,3序列，正向引物SEQ ID NO.25和反向引物SEQ ID NO.26扩增外显子3后面同源重组序列，这样分段扩增小鼠ALKBH4基因组DNA序列，见序列表SEQ ID NO.3，这段基因组序列经过转录翻译后得到小鼠ALKBH4蛋白，见序列表SEQ ID NO.8，基因敲除小鼠不能表达这段蛋白序列。将构建好的ALKBH4基因敲除载体电转到胚胎干细胞中，southern blotting实验检测基因敲除载体整合到胚胎干细胞中，如图31b所示。将胚胎干细胞显微注射到C57BL/6N小鼠子囊胚育出ALKBH4^+/L基因型小鼠，再将这种基因型小鼠杂交得到ALKBH4^L/L基因型小鼠。将这种基因型小鼠与含有Cre酶载体的纯合小鼠交配的到基因型为ALKBH4^+/L/Cre的小鼠，用TAM喂养小鼠即可产生ALKBH4^+/-/Cre基因型的小鼠，再用RT-PCR验证这种杂合体基因敲除小鼠，如图31c所示。ALKBH4^+/-/Cre基因型的小鼠交配得到ALKBH4^-/-/Cre，用RT-PCR方法验证，如图31d所示。取ALKBH4^-/-/Cre基因型小鼠3.5天胚胎分离MEF成纤维细胞，加4-OHT诱导ALKBH4基因敲除，并用免疫荧光和免疫印迹实验检测ALKBH4和actin K84me1的表达量，结果显示ALKBH4基因敲除效率很高，在ALKBH4基因敲除的MEF细胞中actin K84me1的表达量明显升高，与ALKBH4基因沉默结果一致，如图32所示。免疫荧光实验还发现ALKBH4基因敲除后的MEF细胞产生大量的多核细胞，中心体已出现过度复制的现象，如图33所示。我们还发现ALKBH4基因敲除后MEF细胞增殖和迁移能力变弱，将ALKBH4基因敲除细胞和对照组细胞划出一条空白区域，20个小时后对照组细胞将这片空白区域填满，而ALKBH4基因敲除组的空白区域大小没有变化，这说明ALKBH4在细胞增殖和迁移过程中也起到很重要的作用，如图34所示。 

序列表 

<110>中国科学院北京基因组研究所 

<120>一种基因及其编码蛋白促进细胞胞质分裂、细胞增殖和在药物研发中应用 

<160>32 

<170> 

<210>1 

<211>909 

<212>DNA 

<213>人（Homo Sapiens） 

<220>Homo sapiens ALKBH4 cDNA sequence 

<400>1 

atggcggcgg ctgccgccga gacccccgaa gtccttcggg aatgcggttg caagggcatc   60 

cggacctgtc tgatctgcga gcggcagcgc ggcagtgacc cgccctggga gctgccccca  120 

gcgaaaacat accgtttcat ttactgctcc gacaccggct gggccgtggg cacagaggag  180 

tctgactttg agggctgggc cttccccttc ccaggagtga tgctgatcga ggactttgtg  240 

acccgggagg aagaagccga gttggtgcgg ctcatggacc gtgacccctg gaagctctcc  300 

cagtctggac ggaggaagca ggactatggc cccaaagtca actttcggaa acagaagcta  360 

aagaccgagg gcttctgcgg cctccccagc ttcagccggg aggtggtgcg gaggatgggc  420 

ctctacccgg ggctggaggg cttccggccc gtcgagcagt gcaacctgga ctactgcccc  480 

gagcggggct ctgccattga cccccacctg gacgacgcct ggctgtgggg ggagcggctg  540 

gtcagcctca acctcctgtc ccccaccgtg ctgtccatgt gtcgggaggc gcccgggagc  600 

ctgctcctct gctcggcccc gtcggctgcc ccggaggcct tggtggacag cgtgatagca  660 

cccagccggt cggtgctatg ccaggaggtg gaggtggcca tccccttacc cgcccgctcc  720 

ctgctggtcc tcaccggggc ggcacggcac cagtggaagc atgccatcca ccgcagacac  780 

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gggaggcagc aagagctggg ccaggaactg ctgcggatcg ccctctcctt ccagggaaga  900 

cccgtgtga  909 

<210>2 

<211>909 

<212>DNA 

<213>人（Homo Sapiens） 

<220>Homo sapiens ALKBH4 H169A-D171A-H254A mutation cDNA sequence 

<400>2 

atggcggcgg ctgccgccga gacccccgaa gtccttcggg aatgcggttg caagggcatc   60 

cggacctgtc tgatctgcga gcggcagcgc ggcagtgacc cgccctggga gctgccccca  120 

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ctctacccgg ggctggaggg cttccggccc gtcgagcagt gcaacctgga ctactgcccc  480 

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gtcagcctca acctcctgtc ccccaccgtg ctgtccatgt gtcgggaggc gcccgggagc  600 

ctgctcctct gctcggcccc gtcggctgcc ccggaggcct tggtggacag cgtgatagca  660 

cccagccggt cggtgctatg ccaggaggtg gaggtggcca tccccttacc cgcccgctcc  720 

ctgctggtcc tcaccggggc ggcacggcac cagtggaagg ctgccatcca ccgcagacac  780 

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gggaggcagc aagagctggg ccaggaactg ctgcggatcg ccctctcctt ccagggaaga  900 

cccgtgtga  909 

<210>3 

<211>6635 

<212>DNA 

<213>鼠（Mus Sapiens） 

<220>Mouse mALKBH4 genome DNA sequence 

<400>3 

cccgttccgt gctacacagg atccctcaac atcccttagt atctcatcag tctttccact   60 

ccgcgcaagg ctaagggcgt tcgctccaag tttatctgac gccgggcgtt ggctgccaat  120 

ctcccacatc tccgtttggc gcgagattcg actggggctc gaatcccgga taacagaata  180 

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gagaacggac ctcagccgcc cagcaggttt taggagttac cttggcagta gggaagcggc 1020 

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ataacttgga ctgaacgggt ctggttttga gtgagcttcc ggagcacaag ggagactgca 1140 

tggaaatggt agggagtgct gaacactagg ccgcctgtat tagacaggga atgagcgact 1200 

taagacagca caggcagccg ggcagtggtg gcgcatgcct ttaatcccag cactcgggag 1260 

acaagaggca ggtggaattc cgagttcgag gccagcctgg tctacagagt gagttccagg 1320 

acagccagga ctacactaca gagaaacctg tctccaaaac aggctttgat ttgggggaaa 1380 

tttttttggg aaaacaaacc tgtatgaatc agctttacag ccgggcagtg gtggtgcatg 1440 

ccattagact tagcacttgg gatgcagagg caggcagatc tctgtgagtc ccaggctagc 1500 

ctgatctaca tagggagttc caggaaagcc catcttgaaa aacaaaaaca aatctgtctt 1560 

acaagatact aataggatca ggagtcaggt aggccaggaa gaatgttaaa atgtttccct 1620 

tctagctctc tgttgaccag gctaacacct tccatcaaaa tgggcaatgg atggatgaat 1680 

gaatgaatga atgaatgaaa aataacttca gagcatttgt atggccctgg cagtgctgta 1740 

gcaagttgct gggatgcata gccaggggaa tgcttgagta gaggcctgag ataggagctg 1800 

tgggtggctg aggcgacaga cacttaaaga gatcaaaggg gcctgagcca agttttttgt 1860 

tttagttatt ttctttagtt agaggcccca gggcgccccc tccataagct aagattgcaa 1920 

gcatatgtca ctatgtctgg atcatggcag cattcagagt gaccaaacac ccaagtgttt 1980 

attatatcaa ctggtgaact gaagagtggg cagtgttggt gctggcttga gggaggtcaa 2040 

agatatctac atagcaagtt tcaaaccaga ctaaataaaa gcctgtctcg acaggaaaga 2100 

aagaggcaaa ccataaacta ataagagatt tttaaaaatc tcggatatcc atgcagtaga 2160 

tataacctta gaaaggaagg aaattctgac gcgagttcca tatggattca ccttgaagat 2220 

gtgctgctaa aagaaggaag ccagtctcta gctggaggcg tggtctggag atagtgcacc 2280 

tgcctagcac cgcccaggct ggagagatgg ctctacactt aagaacactg actgcttcgg 2340 

gcgtgctggc gcaggccttt aatcccagca ctcgggaggc agaggcaggc ggatttctga 2400 

gttcgaggcc agcctggtct acagagtgag ttccaggaca gccagggcta cacagaaaaa 2460 

ccctgtctca gaaaaaaaaa accaaagacc taagtttgcc tcccaacacc caagtcactg 2520 

gcgccctctt ctggccttgg agggcacatg tgcatgccac acacagattc aaacatagaa 2580 

agaaagaact gccctagtga ggggcttggg atggacctct gtggtagagt gcttacctaa 2640 

catgctaagg cctggctcat gtagcccagg ctggccttat tcactatata gtgaaagatg 2700 

accatgaact cttaatggtc ctgaagacca ggattacaga cctctgccgc cacacaggtt 2760 

tttttgcagt gctggggaag gaacccatgg cttcatgcat gtcgggcagg cctataccat 2820 

ctgagctaca gccacagatt tatgatgccc tacattttat gtacattggt gttttgcctg 2880 

catgtgtgtc tgtgtgaggg tgttggatct cctggaactg aagttaatgg acagtcgtga 2940 

gctctcccgg ttggttgtct ggaagagcgg ccagtgcctt tattcgccga gccttctctc 3000 

cagccctaag atggcgtttc tactactgca tctcttagtc tcagaggagg caggagcagg 3060 

gctgaggaag acacacatct gtggcttcca ataagcattg gccagcccct ggccacccag 3120 

accacagcct tacggttagc cctgcttctc agactcctgg tgcaggctcc tgtcctttat 3180 

ctttttgctc ctgaggggtc ggtgatagtc acagtgccaa aggaatagtg cccacatccc 3240 

ccagcctcag gccaggtcct cagagaagaa aaacacaaat gagagaatga gaatcccatg 3300 

ccctgaggcc tgaggccagg ttcaggctgc atcgcccctg cgactccagg ctcctctcca 3360 

agttgcttta gttccaagaa gagcatcgga atcccagagg ctcctggtgg gtcccgggca 3420 

catgtggcta ttgtgggtct ttgctggttc cagggcactt ctgtttgggg tgtatgcgtg 3480 

tacaggtgta tgtgtataca ggtagagggc agaggataac ccaggtgccc accttggtgt 3540 

tttgagagag tctcactggc ctggaatttt ctaagaggcc aggctagctt gcccttggtc 3600 

tgacctttgc ctccctcccc agctctagga tacaggcatc catgaccaca cccagcttat 3660 

tacatttggg ttttagggga tggagctcag atctctgtgc ttcttgcagg ttaagcacgt 3720 

cagcagctca cccactctgc cccatctctg tcttttacag aaaaaatgct gtttcctcta 3780 

ctgcccagac acaggctggg ccgcaggggc cgagggctct gacttggagg gttgggcatt 3840 

ccccttccca ggagtgacac tgatacagga ctttgtgacc ccagaggaag aagctgagat 3900 

ggtgcgtctg atggactgcg acccctggaa gctctcacag tctgggagga agaagcaggt 3960 

acggtggcct gagctgagcc gaggtatggt ccctttgcca gtggccccgg ctacctcctg 4020 

tagccacacc ctagggatct ttggtcacag tgggtgtgga cttcctcatc aagcgtggct 4080 

gccgcgtctc tgtgcggctg tctctgcggc tgtctcgttg gtgaggggat gccaagctct 4140 

aggttggatt tctatcctgt gtgctgctag aggctgccgg gcatcacccg tttctattgt 4200 

gactctcact cctcacctgt atgtctcacc ttctatcttt tcccttcctc gttatctctc 4260 

ccttgccaca atgtagtcag tgccttagta gcttcaaagg tgcccctcac cctttgctcc 4320 

tggcaccata gtgctgggtt agagttctgg cgacatcagc cagttggggg tcccttcaag 4380 

cttcgtcctg tgctgggaca gccccagcca cccactctgc ccctgacctc tgaacagatg 4440 

gagcagtcct cctacctagg ctttctgggt cctgggattt catgcacaca ccagccatgc 4500 

ccagtttgtg gttgccatgg cttaagctgg gccacttctc cttcctgtct ccactgtagg 4560 

actatggccc taactgcttc tccttcctgt ctccactgca ggactatggc cctaaagtta 4620 

attttcggaa gcagaagctg aagatggcag gcttccaggg tctccctggc tttagccaga 4680 

aggtagtcca gagaatgggc ctttacccgg ggctggagga cttccagcct gtggaacagt 4740 

gcaatctgga ctacagccct gagcggggct ccgccatcga cccccacttg gacgacgcct 4800 

ggctgtgggg cgagcggctg gtgagcctca acctcctgtc agccacagtg gtgtccatgt 4860 

ctccagaggc ccctggcagc ctgcttctct gctcagcccc ctccgtcaga cctgatgctt 4920 

ttgaggacag ccttgtggct cctagcaggt ctgtcccctg ccaggaggtg gaggtggcca 4980 

tcacagtacc ccgccgctcc ttgctggtgc ttacaggggc cgcgaggcac cagtggacac 5040 

acgccatcca ccgcagacac atcaaggccc gccgtgtgtg cgccaccttc agggagctgt 5100 

ccagtgagtt cctgcctgga gggaagcagc aagaactggg ccaagaactg ctgcaggctg 5160 

cactctcgtt ccaggggaga ccggtgtgat gcttcccagg gcccaggagc tgtcactggc 5220 

ctggccaaaa gcttggctcc agcacaacca tcggaggagc taacactgag gtctccccac 5280 

agcagtagat tcgtggggtt tttttgagac aaggtctcat gtagcccagg ctagcctcca 5340 

attaattgtg tagctaagga tgaccttgga ctcttgcctt ttctacctcc tcttcccaag 5400 

ctctggcttg attattttgt tttgtttctc tttttgggac agggtctccg gcctagactg 5460 

gcctcagact ctgtttccag ccaaggatga ctttgaactc cggatcctcc tgcctctacc 5520 

tcttgaatgc tgggattgcc agcgtgcacc atcatatgca atttttgtct gtgctgggat 5580 

ggcagcaagc gttctgccag ctgagctacc ccacccccct agcctgttgg gggtttttga 5640 

gacaaggcct cacatgggct agactggcct ggaactcccc atcctcctgc ctcagcctcc 5700 

cagtcgctga ggtgacagtg tactggtgag gttttaggag gagccatctg acccttgacg 5760 

tcatgagcat cgtatgtcct gcccggagct ggttctgctg ggcctgggct gcggccattc 5820 

ctcagctcac tgagtgtcat atgtggaggg attgagtctt ttagaacttc agtacttggg 5880 

acgagtaagg tggctcagta gctaaaggtg ctgccaccaa gcctgatgtt cagtctctgc 5940 

aatccacgtg gtaaaaggag tgtcccctga tctccacacg cacatcaccc attttgataa 6000 

aattcataat aaaagaaaaa ccttggtctc atgtgaaatg aatttctcct tttcccatcc 6060 

ctgtgtgaag tagttgtagt tattttgttt tgttttaaaa cagggtctca ctttgtagcc 6120 

ttggctgtct tggaactcgc tttatagacc aggctggccc ttaactcata aagatctcta 6180 

cctctgccgc tgagtaagtg ccgggattaa agatatgcac caatccacag agcccaactc 6240 

tttcttttct tttctttttt tttttttttt tgagataagc ttcccatttg tagtacaggc 6300 

tggcctcaaa atttgaccag tcaggaccca aggattaaac ttagttttaa aaattacatt 6360 

gacttagtta tttagctatg gaagcaggca cagctctgtg tatggaggac agaagaccat 6420 

gcaggccaag gtggaaggtg gagttgtgtg gctggcctgc atgacagcct tgtacctcca 6480 

ggaaagggtc acagcctcgg ggtttgtgat accaagtttt gggaggcttg tgtttctgtg 6540 

tgcagattgc agacttatgt gggtgcagtg cacttgctct gtgcatgcat cagggggcca 6600 

gctgcaatcg catgcacgtg gtatccgtga ggtca 6635 

<210>4 

<211>1128 

<212>DNA 

<213>人（Homo Sapiens） 

<220>Homo sapiens β-actin cDNA sequence 

<400>4 

atggatgatg atatcgccgc gctcgtcgtc gacaacggct ccggcatgtg caaggccggc   60 

ttcgcgggcg acgatgcccc ccgggccgtc ttcccctcca tcgtggggcg ccccaggcac  120 

cagggcgtga tggtgggcat gggtcagaag gattcctatg tgggcgacga ggcccagagc  180 

aagagaggca tcctcaccct gaagtacccc atcgagcacg gcatcgtcac caactgggac  240 

gacatggaga aaatctggca ccacaccttc tacaatgagc tgcgtgtggc tcccgaggag  300 

caccccgtgc tgctgaccga ggcccccctg aaccccaagg ccaaccgcga gaagatgacc  360 

cagatcatgt ttgagacctt caacacccca gccatgtacg ttgctatcca ggctgtgcta  420 

tccctgtacg cctctggccg taccactggc atcgtgatgg actccggtga cggggtcacc  480 

cacactgtgc ccatctacga ggggtatgcc ctcccccatg ccatcctgcg tctggacctg  540 

gctggccggg acctgactga ctacctcatg aagatcctca ccgagcgcgg ctacagcttc  600 

accaccacgg ccgagcggga aatcgtgcgt gacattaagg agaagctgtg ctacgtcgcc  660 

ctggacttcg agcaagagat ggccacggct gcttccagct cctccctgga gaagagctac  720 

gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg ccctgaggca  780 

ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac taccttcaac  840 

tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac agtgctgtct  900 

ggcggcacca ccatgtaccc tggcattgcc gacaggatgc agaaggagat cactgccctg  960 

gcacccagca caatgaagat caagatcatt gctcctcctg agcgcaagta ctccgtgtgg 1020 

atcggcggct ccatcctggc ctcgctgtcc accttccagc agatgtggat cagcaagcag 1080 

gagtatgacg agtccggccc ctccatcgtc caccgcaaat gcttctag 1128 

<210>5 

<211>1128 

<212>DNA 

<213>人（Homo Sapiens） 

<220>Homo sapiens β-actin K84A mutation cDNA sequence 

<400>5 

atggatgatg atatcgccgc gctcgtcgtc gacaacggct ccggcatgtg caaggccggc   60 

ttcgcgggcg acgatgcccc ccgggccgtc ttcccctcca tcgtggggcg ccccaggcac  120 

cagggcgtga tggtgggcat gggtcagaag gattcctatg tgggcgacga ggcccagagc  180 

aagagaggca tcctcaccct gaagtacccc atcgagcacg gcatcgtcac caactgggac  240 

gacatggaggcaatctggca ccacaccttc tacaatgagc tgcgtgtggc tcccgaggag   300 

caccccgtgc tgctgaccga ggcccccctg aaccccaagg ccaaccgcga gaagatgacc  360 

cagatcatgtttgagacctt caacacccca gccatgtacg ttgctatcca ggctgtgcta   420 

tccctgtacg cctctggccg taccactggc atcgtgatgg actccggtga cggggtcacc  480 

cacactgtgc ccatctacga ggggtatgcc ctcccccatg ccatcctgcg tctggacctg  540 

gctggccggg acctgactga ctacctcatg aagatcctca ccgagcgcgg ctacagcttc  600 

accaccacgg ccgagcggga aatcgtgcgt gacattaagg agaagctgtg ctacgtcgcc  660 

ctggacttcg agcaagagat ggccacggct gcttccagct cctccctgga gaagagctac  720 

gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg ccctgaggca  780 

ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac taccttcaac  840 

tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac agtgctgtct  900 

ggcggcacca ccatgtaccc tggcattgcc gacaggatgc agaaggagat cactgccctg  960 

gcacccagca caatgaagat caagatcatt gctcctcctg agcgcaagta ctccgtgtgg 1020 

atcggcggct ccatcctggc ctcgctgtcc accttccagc agatgtggat cagcaagcag 1080 

gagtatgacg agtccggccc ctccatcgtc caccgcaaat gcttctag  1128 

<210>6 

<211>302 

<212>PRT 

<213>人（Homo Sapiens） 

<220>Homo ALKBH4 protein 

<400>6 

        10         20         30         40         50         60 

MAAAAAETPE VLRECGCKGI RTCLICERQR GSDPPWELPP AKTYRFIYCS DTGWAVGTEE 

        70         80         90        100        110        120 

SDFEGWAFPF PGVMLIEDFV TREEEAELVR LMDRDPWKLS QSGRRKQDYG PKVNFRKQKL 

       130        140        150        160        170        180 

KTEGFCGLPS FSREVVRRMG LYPGLEGFRP VEQCNLDYCP ERGSAIDPHL DDAWLWGERL 

       190        200        210        220        230        240 

VSLNLLSPTV LSMCREAPGS LLLCSAPSAA PEALVDSVIA PSRSVLCQEV EVAIPLPARS 

       250        260        270        280        290        300 

LLVLTGAARH QWKHAIHRRH IEARRVCVTF RELSAEFGPG GRQQELGQEL LRIALSFQGR 

302 

PV 

<210>7 

<211>302 

<212>PRT 

<213>人（Homo Sapiens） 

<220>Homo ALKBH4 H169A-D171A-H254A mutation protein 

<400>7 

        10         20         30         40         50         60 

MAAAAAETPE VLRECGCKGI RTCLICERQR GSDPPWELPP AKTYRFIYCS DTGWAVGTEE 

        70         80         90        100        110        120 

SDFEGWAFPF PGVMLIEDFV TREEEAELVR LMDRDPWKLS QSGRRKQDYG PKVNFRKQKL 

       130        140        150        160        170        180 

KTEGFCGLPS FSREVVRRMG LYPGLEGFRP VEQCNLDYCP ERGSAIDPAL ADAWLWGERL 

       190        200        210        220        230        240 

VSLNLLSPTV LSMCREAPGS LLLCSAPSAA PEALVDSVIA PSRSVLCQEV EVAIPLPARS 

       250        260        270        280        290        300 

LLVLTGAARH QWKAAIHRRH IEARRVCVTF RELSAEFGPG GRQQELGQEL LRIALSFQGR 

302 

PV 

<210>8 

<211>300 

<212>PRT 

<213>鼠（Mus Sapiens） 

<220>Mouse mALKBH4 protein 

<400>8 

        10         20         30         40         50         60 

MAAAAEVSLL QECGCKGIRT CLICERQRHR DPPWQICLQK KCCFLYCPDT GWAAGAEGSD 

        70         80         90        100        110        120 

LEGWAFPFPG VTLIQDFVTP EEEAEMVRLM DCDPWKLSQS GRKKQDYGPK VNFRKQKLKM 

       130        140        150        160        170        180 

AGFQGLPGFS QKVVQRMGLY PGLEDFQPVE QCNLDYSPER GSAIDPHLDD AWLWGERLVS 

       190        200        210        220        230        240 

LNLLSATVVS MSPEAPGSLL LCSAPSVRPD AFEDSLVAPS RSVPCQEVEV AITVPRRSLL 

       250        260        270        280        290        300 

VLTGAARHQW THAIHRRHIK ARRVCATFRE LSSEFLPGGK QQELGQELLQ AALSFQGRPV 

<210>9 

<211>375 

<212>PRT 

<213>人（Homo Sapiens） 

<220>Homo β-actin protein 

<400>9 

        10         20         30         40         50         60 

MDDDIAALVV DNGSGMCKAG FAGDDAPRAV FPSIVGRPRH QGVMVGMGQK DSYVGDEAQS 

        70         80         90        100        110        120 

KRGILTLKYP IEHGIVTNWD DMEmKIWHHTF YNELRVAPEE HPVLLTEAPL NPKANREKMT 

       130        140        150        160        170        180 

QIMFETFNTP AMYVAIQAVL SLYASGRTTG IVMDSGDGVT HTVPIYEGYA LPHAILRLDL 

       190        200        210        220        230        240 

AGRDLTDYLM KILTERGYSF TTTAEREIVR DIKEKLCYVA LDFEQEMATA ASSSSLEKSY 

       250        260        270        280        290        300 

ELPDGQVITI GNERFRCPEA LFQPSFLGME SCGIHETTFN SIMKCDVDIR KDLYANTVLS 

       310        320        330        340        350        360 

GGTTMYPGIA DRMQKEITAL APSTMKIKII APPERKYSVW IGGSILASLS TFQQMWISKQ 

       370    375 

EYDESGPSIV HRKCF 

<210>10 

<211>375 

<212>PRT 

<213>人（Homo Sapiens） 

<220>Homo β-actin protein 

<400>10 

        10         20         30         40         50         60 

MDDDIAALVV DNGSGMCKAG FAGDDAPRAV FPSIVGRPRH QGVMVGMGQK DSYVGDEAQS 

        70         80         90        100        110        120 

KRGILTLKYP IEHGIVTNWD DMEAIWHHTF YNELRVAPEE HPVLLTEAPL NPKANREKMT 

       130        140        150        160        170        180 

QIMFETFNTP AMYVAIQAVL SLYASGRTTG IVMDSGDGVT HTVPIYEGYA LPHAILRLDL 

       190        200        210        220        230        240 

AGRDLTDYLM KILTERGYSF TTTAEREIVR DIKEKLCYVA LDFEQEMATA ASSSSLEKSY 

       250        260        270        280        290        300 

ELPDGQVITI GNERFRCPEA LFQPSFLGME SCGIHETTFN SIMKCDVDIR KDLYANTVLS 

       310        320        330        340        350        360 

GGTTMYPGIA DRMQKEITAL APSTMKIKII APPERKYSVW IGGSILASLS TFQQMWISKQ 

       370    375 

EYDESGPSIV HRKCF 

<210>11 

<211>26 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400> 

atagaattcccatggcggcggctgcc 

<210>12 

<211>27 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>12 

accgtcgactcacacgggtcttccctg 

<210>13 

<211>25 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>13 

ttcgaattctatggcggcggctgcc 

<210>14 

<211>27 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>14 

gacctcgagatggcggcggctgccgcc 

<210>15 

<211>29 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>15 

tataatgcggccgccacgggtcttccctg 

<210>16 

<211>29 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>16 

cagctcgagatggatgatgatatcgccgc 

<210>17 

<211>35 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>17 

ataagaatgcggccgcctagaagcatttgcggtgg 

<210>18 

<211>33 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>18 

gccattgaccccgccctggccgacgcctggctg 

<210>19 

<211>31 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>19 

ggcaccagtggaaggctgccatccaccgcag 

<210>20 

<211>34 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>20 

ctgggacgacatggaggcaatctggcaccacacc 

<210>21 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>21 

attgggatccaagtgctctg 

<210>22 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>22 

gggtgtggctacaggaggta 

<210>23 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>23 

ctttggtcacagtgggtgtg 

<210>24 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>24 

tcagcggcagaggtagagat 

<210>25 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>25 

tgccgggattaaagatatgc 

<210>26 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220>引物序列 

<400>26 

gcaacccctctggtgtttta 

<210>27 

<211>19 

<212>RNA 

<213>人工序列 

<220>siRNA序列针对ALKBH4 

<400>27 

gaucccgggauugaaauga 

<210>28 

<211>19 

<212>RNA 

<213>人工序列 

<220>siRNA序列针对ALKBH4 

<400>28 

gggauugaaaugaggagca 

<210>29 

<211>19 

<212>RNA 

<213>人工序列 

<220>siRNA序列针对ALKBH4 

<400>29 

gggaucauuugagcuuaaa 

<210>30 

<211>19 

<212>RNA 

<213>人工序列 

<220>siRNA序列针对NM II 

<400>30 

gggccaacauugaaacaua 

<210>31 

<211>19 

<212>RNA 

<213>人工序列 

<220>siRNA序列针对NM II 

<400>31 

gugcuacaguuuggaaata 

<210>32 

<211>19 

<212>RNA 

<213>人工序列 

<220>siRNA序列针对NM II 

<400>32 

cucgggaugaggugauuaa