用于检测结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR方法、引物、探针及试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于检测结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR方法，包括步骤：1)采集患者痰液样本并进行处理；2)提取样本的DNA；3)以标准菌株的DNA为阳性对照，灭菌水为阴性对照，进行样本DNA的实时荧光定量PCR反应；4)根据反应得到的Ct值判断样本的检测结果，并计算样本中结核分枝杆菌的拷贝数。本发明还公开了上述检测方法所用的引物和探针以及包含该引物和探针的试剂盒。该检测方法简便、快速且特异性高，可以实现临床痰液样本中结核分枝杆菌的快速定量检测，从而有助于疾病的预防和及时治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种用于检测结核分枝杆菌的荧光定量PCR方法。 本发明还涉及用于该方法的引物和探针，以及包含该引物和探针的试剂盒。

背景技术

结核病是全球面临的主要公共健康问题之一，是引起成年人死亡的主要传染源，尤其是 近年来，由于大规模人口流动及细菌本身耐药性的产生，结核病的发病率有回升的趋势。

结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原体，目前对MTB的诊断主要采用实验室诊断与临床 体征相结合的方法。实验室诊断主要包括涂片染色法、细菌培养法、抗原抗体检测、PCR等 方法。其中，病人组织或体液标本的细菌培养是目前检测结核分枝杆菌的金标准，但其缺点 是检测周期较长(需要8周)，难以实现致病菌的快速检测，因此在临床上很容易贻误病情， 不利于早期治疗。抗原抗体检测通常采用ELISA(酶联免疫吸附试验)法，该方法具有操作 简单、价格低廉的优点，但在检测特异性和灵敏度方面还有待提高。

随着分子生物学的发展，PCR技术已成为目前常见的实验手段，特别是实时荧光定量PCR， 因具有技术成熟、灵敏度高、操作简单和特异性好的优点，已被逐步应用到临床上。同时， 利用基因芯片在细菌耐药性方面的应用，近几年出现了不少将荧光定量PCR技术和基因芯片 相结合的检测MTB及其耐药基因的方法，例如，名称为“一种从痰中提取细菌核酸的方法、 试剂盒及其应用”的中国发明专利(申请号200810105172.X)，利用了基因芯片技术，通过 比较不同菌株中16S rRNA基因的差异，设计引物和探针对MTB进行检测，但由于16S基因较 短(1500bp)，因此该方法的检测特异性较低；另一名称为“一种结核分枝杆菌复合群的荧光 定量RT-PCR检测方法”的中国发明专利申请(申请号201010522800.1)，在引物和探针设计 时，也采取了比较不同菌株中16S rRNA基因的方法，因此，也存在上述的问题，此外，该方 法采用人的基因组DNA最为阴性对照进行检测，其检测结果的特异性有待改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种能够特异性检测结核分枝杆菌的引物对。

为解决上述技术问题，本发明的用于实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物对，包 括上游引物和下游引物，其中，上游引物具有如SEQ ID No：1所示的序列或其互补链，下游 引物具有如SEQ ID No：2所示的序列或其互补链；所述上游引物还可以向5’端方向延伸10 个碱基，所述下游引物还可以向3’端方向延伸10个碱基。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种能够特异性检测结核分枝杆菌的探针。

为解决上述技术问题，本发明的用于实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，具有 如SEQ ID No：3所示的序列或其互补链，且所述探针的5’端连接有一个荧光报告基团，3’ 端连接有一个荧光淬灭基团。所述探针还可以向3’端方向延伸10个碱基。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种利用上述引物对和探针进行实时荧光定量PCR 检测结核分枝杆菌的方法，它不仅简便、快速，而且特异性高。

为解决上述技术问题，本发明的用于检测结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR方法，包括 以下步骤：

1)采集患者痰液样本，并进行处理；

2)提取样本中的DNA；

3)以结核分枝杆菌标准菌株中提取的DNA为阳性对照，灭菌水为阴性对照，利用前述引 物对和探针，对样本DNA进行实时荧光定量PCR反应，测定样本和标准品的Ct值；

4)利用步骤3)的测定结果，判断样本中是否含有结核分枝杆菌，并计算样本中结核分 枝杆菌的拷贝数。

步骤1)采集的样本，在2～8℃下保存不应超过24小时，在-20℃下保存不超过3个月， 在-80℃下可以长期保存，样本应低温运输。

步骤1)中，可以按照如下步骤进行样本的处理：取2～3mL样本，加入1～4倍体积的 4％氢氧化钠，混匀，室温液化0.5～3小时，至样本变为透明溶液；取已液化的痰液样本1～ 1.5mL，放入灭菌的1.5mL灭菌PE管中，10,000～15,000rpm离心5～10分钟，弃上清；沉 淀加入1mL生理盐水重悬，10,000～15,000rpm离心5～10分钟，弃上清；沉淀用于进行 DNA的提取。

步骤2)中，样本DNA的提取，可以利用商业化的DNA提取试剂盒，例如Qiagen公司或 TaKaRa公司的DNA提取试剂盒，按照试剂盒的说明书进行操作；也可以按照以下方法进行操 作：向经步骤1)处理后得到的沉淀中，加入50～100μL灭菌水，放在100℃水浴中煮沸10～ 15min，所得溶液即为样本DNA的溶液，取上清2～4μL，可直接用于荧光定量PCR反应。

步骤3)中，PCR反应采用20μL的反应体系，每份反应液中含2×PCR Master Mix 10 μL，10μmol/L的上、下游引物各0.2～0.6μL，10μmol/L探针0.6～1.0μL，ROX Reference Dye(50×)0.4μL，结核分枝杆菌DNA模板1～3μL，用灭菌水补充至总体积为20.0μL，反 应溶液在冰上配制。PCR反应条件为：95℃，30秒；然后进行40个循环：95℃，5秒，60℃，31 秒。

本发明要解决的技术问题之四是提供一种用于实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的试 剂盒。

为解决上述技术问题，本发明的用于实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的试剂盒，除 包含有常规实时荧光定量PCR试剂(包括：Taq酶、dNTP试剂、PCR缓冲液、灭菌水等)、阳 性对照(结核分枝杆菌标准菌株的DNA，浓度分别为10⁶、10⁵、10⁴copies/mL)、阴性对照外， 还包含有上述引物对和探针。

本发明的用于检测结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR方法，以及用于该方法的引物和探 针或试剂盒，不仅对结核分枝杆菌具有较好的检测特异性，而且简便、快速，可以在2～3小 时内完成临床痰液样本的检测诊断，从而有助于疾病的预防和及时诊断，在临床上具有良好 的应用前景。

附图说明

图1是结核分枝杆菌检测灵敏度测试图，图中横坐标是PCR反应的循环数，纵坐标是采 集的荧光信号值；

图2是采用琼脂糖凝胶电泳验证本发明试剂盒的可靠性；

图3A是使用本发明的试剂盒进行志贺菌检测的结果；

图3B是使用本发明的试剂盒进行军团菌检测的结果；

图3C是使用本发明的试剂盒进行其他菌检测的结果；

图4是利用本发明的试剂盒进行临床痰液样本检测的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.样本的采集和处理，及样本DNA的提取

按照临床样本采集要求，采集患者的痰液样本，采集的样本保存在-20℃。

将样本在冰上融化，取样本2mL，向样本中加入4mL的4％的NaOH溶液，混匀，室温处理 0.5小时。然后，取样本1.5mL，在13,000rpm离心10分钟，弃上清，加入1mL的1×PBS重 悬，在13,000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉淀。加入50μL灭菌水，在100℃水浴中煮 沸10分钟，所得溶液即为含样本DNA的溶液，取1μL该溶液用于实时荧光定量PCR反应。

2.检测灵敏度测试

通过对GenBank上结核分枝杆菌和其他物种序列的比对，选取结核分枝杆菌特异序列， 设计出一组用于PCR检测结核分枝杆菌核苷酸片段的引物和探针，其序列如下：

上游引物：5’-GGCTGTCGTTTTGCTCTG-3’

下游引物：5’-CTGATGTTGGTGTTGTAGGC-3’

检测探针：5’-CGACACCCGAACAACAGAGC-3’

上述检测探针的5’端连接有一个荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端连接有一个 荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基丹诺明)。

PCR反应采用20μL的反应体系，每份反应液中含有2×PCR Master Mix 10μL，上、下 游引物(10μmol/L)各0.4μL，探针(10μmol/L)0.8μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，灭菌水6.0μL，结核分枝杆菌DNA样品(浓度分别为：(a)2×10⁰ng/μL，(b)2×10^-1ng/ μL，(c)2×10^-2ng/μL，(d)2×10^-3ng/μL，(e)2×10^-4ng/μL，(f)2×10^-5ng/μL，(g) 2×10^-6ng/μL，(h)2×10^-7ng/μL，(i)2×10^-8ng/μL)2μL。反应溶液在冰上配制，配制 完成后使用ABI 7300real-Time PCR System进行PCR反应。

反应条件：95℃，30秒；然后进行40个循环，每个循环为：95℃，5秒，60℃，31秒。

反应结束后，对扩增曲线进行分析，得到以循环数为横坐标，吸光值为纵坐标的定量曲 线，如图1所示。从图中可以看出，当DNA模板浓度分别为2×10⁰ng/μL，2×10^-1ng/μL，2 ×10^-2ng/μL，2×10^-3ng/μL，2×10^-4ng/μL时，均出现明显的扩增曲线，但当模板浓度低 于2×10^-4ng/μL时，未出现明显的扩增曲线。即使用本发明的荧光定量PCR方法及试剂盒对 结核分枝杆菌的检测可以达到2×10^-4ng/μL(基因组DNA)的检测灵敏度，相当于40拷贝数 (copies)的结核分枝杆菌。

为了验证本发明试剂盒检测结果的可靠性，对实时荧光定量PCR反应产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测，结果如图2所示，其中的泳道1～9为上述不同拷贝数的结核分枝杆菌DNA模板， 泳道10为阴性对照(灭菌水)，M为100bp标记物(Marker)。检测结果与目的片段大小一致。

3.本发明试剂盒的特异性检验

分别用结核分枝杆菌DNA提取物、志贺菌DNA提取物、大肠杆菌DNA提取物、肺炎克雷 伯菌DNA提取物、李斯特菌DNA提取物、肠炎沙门菌DNA提取物、金黄色葡萄球菌DNA提取 物、军团菌DNA提取物为模板，采用本发明的试剂盒，按照上述检测灵敏度测试中所述的反 应体系和条件，进行实时荧光定量PCR检测。检测结果如图3A～3C所示，从图中可以看出， 只有以结核分枝杆菌DNA为模板的样品有明显的扩增曲线，其他的样本均无明显的扩增曲线。

4.临床痰液样本的检测

按照临床样本采集要求，采集患者痰液样本，采集的样本保存在2～8℃(不超过4小时)。

取样本2mL，向样本中加入4mL的4％NaOH溶液，混匀，室温处理1.0小时。然后取样 本1.5mL，在13,000rpm离心10分钟，弃上清，加入1.5mL的1×PBS重悬，在13,000rpm 离心10分钟，弃上清，保留沉淀。加入50μL灭菌水，放在100℃水浴中煮沸10分钟，所 得溶液即为样本DNA的溶液，可直接用于进行荧光定量PCR反应。

取上清2μL，以结核分枝杆菌标准菌株(源自ATCC27294，美国标准菌种保藏中心)提 取的DNA为阳性对照，无菌蒸馏水为阴性对照，利用本发明的试剂盒，并按照上述检测灵敏 度测试中所述的反应体系和条件进行实时荧光定量PCR反应。

反应结束后，分析PCR检测结果，得到每个样本的Ct_样本值、阳性标准品的Ct_标准值以及 阴性对照的Ct_水值(Ct为域值循环数，且Ct_标准≤35，Ct_水＞35)，若Ct_样本值≤35，且呈现典 型的扩增曲线，则为阳性结果，表明样本中含有结核分枝杆菌；若Ct_样本值＞35，或者无扩增 信号，则为阴性结果，表明样本中无结核分枝杆菌。根据图4所示的反应曲线可以看出，阳 性标准品和临床采集的样本均呈现出明显的扩增曲线，表明该临床痰液样本中含有结核分枝 杆菌。进一步根据公式copies＝标准品拷贝数*2^-ΔCt，式中ΔCt＝Ct_样本-Ct_标准，可以计算得 到样本中所含结核分枝杆菌的拷贝数。