同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法

摘要

本发明涉及一种同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，属植物保护领域。通过分别设计合成TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA正反向引物，CTAB法提取染病植物组织或传毒介体昆虫总RNA，采用一步法四重RT-PCR，达到对这4种病原物的同步快速检测。所设计的引物特异性强，能同时扩增出4种病原物。用CTAB法提取染病植物组织及传毒介体昆虫的总RNA，既能保证所提RNA的质量，也能降低检测成本。反转录与多重PCR一步完成，极大地节约了检测时间。本发明具有快速、高效、特异性强、灵敏度高和成本低廉等优点，能一次实现对与烟草丛顶病相关的4种病原物的同步检测，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，属植物保护领域。

背景技术

烟草丛顶病（tobacco bushy top disease）于1957年在津巴布韦北部的春克旺里烟区首次发生，此后爆发流行并造成很大损失。烟草丛顶病在我国的云南早有出现，但长期以来由于该病仅为零星发生，未对烟草生产造成重大损失而被忽视，直到1993年在云南保山、大理等地大面积爆发流行后才逐渐受到关注。此后该病在我国云南中西部烟区大规模流行，给部分烟区造成毁灭性损失，发病区域除涉及保山、大理、楚雄3个州市外，昆明、玉溪、红河、思茅、文山、西双版纳及怒江等州市也有烟草丛顶病零星发生。截止2001年，云南省累计发病面积达51300 hm²，其中8700 hm²绝收，1400 hm²改种，直接经济损失高达2.1亿元，烟草丛顶病已经成为云南省自20世纪90年代以来唯一导致大面积绝产的烟草病害。

烟草丛顶病由幽影病毒属的烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus，TBTV）和黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus，TVDV）复合侵染引起。另外在云南烟草丛顶病的感病烟株中常检测到一条伴随TBTV出现且其分子量约为1000 bp的小分子RNA，根据目前的研究推测该小分子RNA为TBTV的卫星RNA，称其为烟草丛顶病毒类似卫星RNA（Tobacco bushy top virus satellite-like RNA，Sat-TBTV）。2010年又从感染烟草丛顶病的植株中检测到了大小为3.0 kbp与烟草丛顶病相关的RNA，第九次国际病毒分类报告中将其命名为TVDVaRNA（Tobacco vein distorting virus-associated RNA，TVDVaRNA）。TBTV基因组不含编码外壳蛋白的基因，它可通过摩擦接种传播，在辅助病毒TVDV的帮助下可通过蚜虫传播。目前的研究结果表明，自然条件下表现典型烟草丛顶病症状的烟株，都由上述4种病原物复合侵染引起，而云南烟草丛顶病发病区很多未表现症状的烟株，也经常能够检测到TVDV及TVDVaRNA。迄今，国内外尚无特别有效的植物病毒病防治药剂，因此除了严防蚜虫的传播外加强烟株及蚜虫中烟草丛顶病4种病原物的检测和监测，对于准确诊断病害和防止病毒病的传播流行具有重要的现实意义，是生产上对烟草丛顶病进行综合治理的重要措施之一。 

通常检测鉴定植物病毒的方法有生物学、电镜技术、血清学技术和分子生物学技术等。生物学方法操作简单，但该方法检测周期长、灵敏度低，还受到季节、环境以及病毒种类等方面的影响，因此很难用于烟草丛顶病4种病原物的准确诊断。由于TBTV、Sat-TBTV和TVDVaRNA不编码外壳蛋白，没有粒体结构，电镜技术和常规血清学技术无法用于这3种烟草丛顶病病原物的检测鉴定；电镜技术仅能观察到病毒的粒体形态，很难准确鉴定出病毒种类，且设备昂贵，不适合作为TVDV检测的普通方法。TVDV的基因组能够编码外壳蛋白，病毒具有完整的粒体结构，可以用来作为抗原制备抗血清，但由于TVDV的分布局限于韧皮部，且病毒含量较低，不易直接从病株里提纯到病毒粒子，因此目前国内外尚无有关TVDV抗血清方面的报道。分子生物学技术，尤其是RT-PCR技术不但操作简单，而且特异性强、灵敏度高，但普通RT-PCR方法每次只能检测一种病毒，对于多种病原物复合侵染的情况，则需要针对每种病毒进行单独检测，工作量大，成本高，且效率低。

本发明采用一步法RT-PCR，针对烟草丛顶病的4种病原物，分别设计4对烟草丛顶病病原物的特异性引物，可通过一次PCR检测出4种烟草丛顶病的病原物，具有高效、快速、特异、灵敏及节约时间和减少成本等优点。

发明内容

本发明克服了现有技术在对烟草丛顶病多种病原物复合侵染烟草和传毒介体昆虫进行检测时的不足，提供了一种高效、灵敏、特异且低成本的检测烟草及传毒介体昆虫中TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA 4种病原物的方法。

本发明的技术方案为：同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照下面步骤进行：

   （1）引物设计合成：

（a）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

   （b）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

     TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，

     TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中，序列中的R=A或G，

     SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

     TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’；

    （2）CTAB法提取染病植物组织或传毒介体昆虫的总核酸，作为RT-PCR扩增模板；

    （3）一步法RT-PCR扩增；

（4）电泳检测；

（5）检测结果分析：根据每对引物扩增片段大小与病毒的关系，观察感染TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的烟草材料或传毒介体昆虫中检测到的不同核酸带，判断发病烟草或传毒介体昆虫中具体感染的TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV 病原物的种类。

所述CTAB法提取感病植物组织或传毒介体昆虫的总核酸，步骤如下：

第一步、样品准备

（1）感病植物组织准备：将3~5片病叶叠加在一起，称取50~100 mg至研钵中；

（2）传毒介体昆虫准备：取30~50头蚜虫至研钵中；

第二步、加入1.2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH 8.0的100 mM的Tris-HCl、1.4 M的 NaCl和20 mM 的EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2％巯基乙醇；

第三步、恒温处理：充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65℃温浴下处理15~60 min；

第四步、离心处理：首先，将离心管放入离心机中12000~13000 r/min离心处理15 min，取750 μL上清液至另一1.5 mL的离心管，加入750 μL体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，涡旋震荡混匀30 s；然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中12000~13000 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 μL上清液至又一1.5 mL的离心管中，并加入600 μL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中12000~13000 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 μL 70 % 乙醇，并放入离心机中12000~13000 r/min离心处理10 min； 

第五步、干燥：用微量移液器吸出液体，沉淀部分在20℃~25℃条件下自然干燥10~15 min；

第六步、溶解：加入100 μL 20 mmol/L pH8.0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打5~10次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：核酸沉淀溶解液-20℃保存备用；或者将所获得的总核酸以干粉状态放入-80℃进行长期保存备用。

所述一步法RT-PCR采用宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScript^? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒，反应体系为15 μL，由0.6 μL 的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7.5 μL 的2×1 Step Buffer、各0.6 μL的10 μM正反向引物TBTVdF和TBTVdR、各0.5 μL的10μ M正反向引物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0.4 μL的10 μM正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0.3 μL的10 μM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、2.8 μL的ddH₂O和0.5 μL的RNA 模板混合而成。

所述一步法RT-PCR的反应条件为：在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度为50℃，反应时间30 min；然后在温度为94℃时，保持2 min，使RTase失活；温度控制在94℃进行变性30 sec，在温度55℃~60℃间进行退火处理30 sec，然后，温度控制在72℃，延伸1 min，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72℃再延伸10 min后的PCR产物在温度-4℃进行保存。  

在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1.0 %的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 mL加入5 μL Gold View染色剂混匀。在0.5 × TBE缓冲液环境中，90 V稳压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。

所述的检测引物扩增片段大小与所检测病原物的对应关系如表1所示：

                                                 

本发明的有益效果：

（1）TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA是目前烟草丛顶病中发现的4种病原物，这4种病原物往往复合侵染烟草造成严重的危害。本发明针对这4种病原物分别设计了多对特异性引物，为尽量减少引物之间的相互作用，经过反复的实验筛选出TBTVdF和TBTVdR、TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、SatTBTVdF和SatTBTVdR、TVDVdF和TVDVdR这4对特异性强且相互间无干扰的检测引物，且这4对引物分别都能均一地扩增出目标产物。

附图说明

图1为多重RT-PCR的特异性和兼容性；

图2为不同稀释倍数RNA模板的多重RT-PCR扩增效果；

图3为部分烟草丛顶病田间样品多重RT-PCR的检测结果；

图中：泳道1为TBTV；泳道2为TVDVaRNA；泳道3为Sat-TBTV；泳道4为TVDV；泳道5为TBTV + Sat-TBTV；泳道6为TVDVaRNA + TVDV；泳道7为烟叶样品TBTV + TVDVaRNA + Sat-TBTV + TVDV检测结果；泳道8为带毒蚜虫TBTV + TVDVaRNA + Sat-TBTV + TVDV检测结果；泳道9为健康烟草叶片扩增结果；泳道10为模板10⁰×稀释的扩增效果；泳道11为模板10¹×稀释的扩增效果；泳道12为模板10²×稀释的扩增效果；泳道13为模板10³×稀释的扩增效果；泳道14为10⁴×稀释的扩增效果；泳道15为烟叶样品TBTV + Sat-TBTV 的检测结果；泳道16为烟叶样品TVDV的检测结果；泳道17为健康烟草叶片的检测结果；泳道18为烟叶样品TBTV + TVDVaRNA + Sat-TBTV + TVDV的检测结果；泳道19为带毒蚜虫TBTV + TVDVaRNA + Sat-TBTV + TVDV的检测结果；泳道20为烟草样品TVDVaRNA + TVDV的检测结果；泳道21为烟草样品TVDVaRNA + Sat-TBTV + TVDV的检测结果；泳道M为2 Kb Plus DNA Ladder。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，以方便技术人员理解。

实施例1：

以田间感病烟草植株为材料，同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照下面步骤进行：

（1）引物设计合成：

（a）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

（b）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

       TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，

       TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中序列中的R=A或G，

       SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

       TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’；

上述引物由北京六合华大基因公司合成；

（2）CTAB法提取染病植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板，具体按照下面步骤进行：

第一步、感病植物组织准备：将3片病叶叠加在一起，称取50 mg至研钵中；

第二步、加入1.2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH 8.0的100 mM的Tris-HCl、1.4 M的 NaCl和20 mM 的EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2％巯基乙醇；

第三步、恒温处理：充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65℃温浴下处理15 min；

第四步、离心处理：首先，将离心管放入离心机中12000 r/min离心处理15 min，取750 μL上清液至另一1.5 mL的离心管，加入750 μL体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，涡旋震荡混匀30 s；然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中12000 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 μL上清液至又一1.5 mL的离心管中，并加入600 μL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中12000 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 μL 70 % 乙醇，并放入离心机中12000 r/min离心处理10 min； 

第五步、干燥：用微量移液器吸出液体，沉淀部分在20℃条件下自然干燥10 min；

第六步、溶解：加入100 μL 20 mmol/L pH8.0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打5次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：核酸沉淀溶解液-20℃保存备用。

（3）一步法RT-PCR扩增：所述一步法RT-PCR采用宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScript^? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒，反应体系为15 μL，由0.6 μL 的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7.5 μL的2×1 Step Buffer、各0.6 μL的10 μM正反向引物TBTVdF和TBTVdR、各0.5 μL的10 μM正反向引物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0.4 μL的10 μM正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0.3 μL的10 μM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、2.8 μL的ddH₂O和0.5 μL的RNA模板混合而成。

所述一步法RT-PCR的反应条件为：在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度为50℃，反应时间30 min；然后在温度为94℃时，保持2 min，使RTase失活；温度控制在94℃进行变性30 sec，在55℃退火处理30 sec，然后，温度控制在72℃，延伸1 min，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72℃再延伸10 min后的PCR产物在温度-4℃进行保存。

（4）电泳检测：在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1.0%的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 mL加入5μL Gold View染色剂混匀。在0.5 × TBE缓冲液环境中，90 V稳压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。

（5）检测结果分析：观察发现，从田间感病烟草植株中检测到了1049 bp、792 bp、598 bp和357 bp 4条核酸带，而健康对照中未检测到任何条带，根据表1中每对引物扩增片段大小与病毒的关系，参见图3的17和18号泳道的条带，判断田间发病的烟草丛顶病烟草叶片中感染了TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV 4种病原物，引物特异性强、兼容性高。

实证分析：扩增产物真实性验证

挑选上述扩增产物中的1049 bp、792 bp、598 bp和357 bp 4条核酸带，在紫外灯下从凝胶中分别切下相应条带，采用爱思进生物技术（杭州）有限公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 50-prp纯化回收后，将回收产物连接至宝生物工程（大连）有限公司的pMD18-T Vector，按常规分子克隆方法转化至E. coli DH5α感受态细胞中，采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒小量制备试剂盒（离心柱型）提取重组质粒，每个片段至少选3个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序。序列分析表明，1049 bp的cDNA与GenBank中登录的TBTV的核苷酸一致性达99%，792 bp的cDNA与GenBank中登录的TVDVaRNA的核苷酸一致性达96%，598 bp的cDNA与GenBank中登录的Sat-TBTV的核苷酸一致性达99%，357 bp的cDNA与GenBank中登录的TVDV的核苷酸一致性达99%，证明通过本发明从田间感病烟草中获得的1049 bp、792 bp、598 bp和357 bp 4条核酸带就是TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的相应cDNA扩增产物，本发明的扩增产物真实可信。

实施例2：

以温室人工接种感病烟草植株为材料，同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照下面步骤进行：

（1）引物设计合成：

（a）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

（b）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

       TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，

       TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中序列中的R=A或G，

       SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

       TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’，

上述引物由北京六合华大基因公司合成；

（2）CTAB法提取染病植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板，具体按照下面步骤进行：

第一步、感病植物组织准备：将4片病叶叠加在一起，称取70 mg至研钵中；

第二步、加入1.2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH 8.0的100 mM的Tris-HCl、1.4 M的 NaCl和20 mM 的EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2％巯基乙醇；

第三步、恒温处理：充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65℃温浴下处理35 min；

第四步、离心处理：首先，将离心管放入离心机中12500 r/min离心处理15 min，取750 μL上清液至另一1.5 mL的离心管，加入750 μL体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，涡旋震荡混匀30 s；然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中12500 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 μL上清液至又一1.5 mL的离心管中，并加入600 μL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中12500 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 μL 70% 乙醇，并放入离心机中12500 r/min离心处理10 min； 

第五步、干燥：用微量移液器吸出液体，沉淀部分在23℃条件下自然干燥13 min；

第六步、溶解：加入100 μL 20 mmol/L pH8.0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打7次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：核酸沉淀溶解液-20℃保存备用。

（3）一步法RT-PCR扩增：所述一步法RT-PCR采用宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScript^? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒，反应体系为15 μL，由0.6 μL 的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7.5 μL的2×1 Step Buffer、各0.6 μL的10 μM正反向引物TBTVdF和TBTVdR、各0.5μL的10 μM正反向引物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0.4 μL的10 μM正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0.3 μL的10 μM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、2.8 μL的ddH₂O和0.5 μL的RNA模板混合而成。

所述一步法RT-PCR的反应条件为：在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度为50℃，反应时间30 min；然后在温度为94℃时，保持2 min，使RTase失活；温度控制在94℃ 进行变性30 sec，在60℃退火处理30 sec，然后，温度控制在72℃，延伸1 min，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72℃再延伸10 min后的PCR产物在温度-4℃进行保存。

（4）电泳检测：在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1.0 %的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 mL加入5μL Gold View染色剂混匀。在0.5 × TBE缓冲液环境中，90 V稳压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。

（5）检测结果分析：观察发现，烟草植株中检测到了1049 bp、792 bp、598bp和357 bp 4条核酸带，而健康对照中未检测到任何条带，根据表1中每对引物扩增片段大小与病毒的关系，参见图1的7和9号泳道，判断温室人工接种发病的烟草丛顶病烟草叶片中感染了TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV 4种病原物，重复性好。

实证分析：扩增产物真实性验证

随机挑选上述扩增产物中的1049 bp、792 bp、598bp和357 bp 4条核酸带，在紫外灯下从凝胶中分别切下相应条带，采用爱思进生物技术（杭州）有限公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 50-prp纯化回收后，将回收产物连接至宝生物工程（大连）有限公司的pMD18-T Vector，按常规分子克隆方法转化至E. coli DH5α感受态细胞，采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒小量制备试剂盒（离心柱型）提取重组质粒，每个片段至少选3个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序。序列分析表明，1049 bp的cDNA与GenBank中登录的TBTV的核苷酸一致性达98%，792 bp的cDNA与GenBank中登录的TVDVaRNA的核苷酸一致性达96%，598 bp的cDNA与GenBank中登录的Sat-TBTV的核苷酸一致性达96%，357 bp的cDNA与GenBank中登录的TVDV的核苷酸一致性达99%，证明通过本发明温室人工接种的感病烟草中获得的1049 bp、792 bp、598 bp和357 bp 4条核酸带就是TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的相应cDNA扩增产物，再次证明本发明的扩增产物真实可信。

实施例3：

以一种温室人工接种感病烟草为材料，同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照下面步骤进行：

（1）引物设计合成：

（a）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

     （b）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

       TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，

       TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中序列中的R=A或G，

       SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

       TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’， 

上述引物由北京六合华大基因公司合成；

（2）CTAB法提取染病植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板，具体按照下面步骤进行：

第一步、感病植物组织准备：将5片病叶叠加在一起，称取100 mg至研钵中；

第二步、加入1.2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH 8.0的100 mM的Tris-HCl、1.4 M的 NaCl和20 mM 的EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2％巯基乙醇；

第三步、恒温处理：充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65℃温浴下处理60 min；

第四步、离心处理：首先，将离心管放入离心机中13000 r/min离心处理15 min，取750 μL上清液至另一1.5 mL的离心管，加入750 μL体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，涡旋震荡混匀30 s；然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中12500 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 μL上清液至又一1.5 mL的离心管中，并加入600 μL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中13000 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 μL 70% 乙醇，并放入离心机中13000 r/min离心处理10 min； 

第五步、干燥：用微量移液器吸出液体，沉淀部分在25℃条件下自然干燥15 min；

第六步、溶解：加入100 μL 20 mmol/L pH8.0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打10次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：将所获得的总核酸以干粉状态放入-80℃进行长期保存备用。

（3）一步法RT-PCR扩增：所述一步法RT-PCR采用宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScript^? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒，反应体系为15 μL，由0.6 μL 的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7.5 μL的2×1 Step Buffer、各0.6 μL的10 μM正反向引物TBTVdF和TBTVdR、各0.5 μL的10 μM正反向引物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0.4 μL的10 μM正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0.3 μL的10 μM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、2.8 μL的ddH₂O和0.5 μL的RNA 模板混合而成。

所述一步法RT-PCR的反应条件为：在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度为50℃，反应时间30 min；然后在温度为94℃时，保持2 min，使RTase失活；温度控制在94℃进行变性30 sec，在57℃退火处理30 sec，然后，温度控制在72℃，延伸1 min，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72℃再延伸10 min后的PCR产物在温度-4℃进行保存。

（4）电泳检测：在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1.0 %的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 mL加入5 μL Gold View染色剂混匀。在0.5 × TBE缓冲液环境中，90 V稳压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。

（5）检测结果分析：观察发现，感病烟草植株中检测到了1049 bp和598 bp 2条核酸带，而健康对照中未检测到任何条带，根据表1中每对引物扩增片段大小与病毒的关系，参见图1的泳道5和9，判断温室人工接种发病的烟草丛顶病烟草叶片中感染了TBTV和Sat-TBTV 2种病原物，重复性好。

实证分析：扩增产物真实性验证

随机挑选上述扩增产物中的1049 bp和598 bp 2条核酸带，在紫外灯下从凝胶中分别切下相应条带，采用爱思进生物技术（杭州）有限公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 50-prp纯化回收后，将回收产物连接至宝生物工程（大连）有限公司的pMD18-T Vector，按常规分子克隆方法转化至E. coli DH5α感受态细胞中，采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒小量制备试剂盒（离心柱型）提取重组质粒，每个片段至少选3个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序。序列分析表明，1049 bp的cDNA与GenBank中登录的TBTV的核苷酸一致性达98%，598 bp的cDNA与GenBank中登录的Sat-TBTV的核苷酸一致性达96%，证明通过本发明温室人工接种的感病烟草中获得的1049 bp和598 bp 2 条核酸带就是TBTV和Sat-TBTV的相应cDNA扩增产物，再次证明本发明的扩增产物真实可信。

实施例4：

以田间传毒蚜虫为材料，同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照下面步骤进行：

（1）引物设计合成：

（a）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

      （b）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

       TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，

       TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中序列中的R=A或G，

       SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

       TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’，

上述引物由北京六合华大基因公司合成；

（2）CTAB法提取传毒介体昆虫的总核酸，作为RT-PCR扩增模板；具体按照下面步骤进行：

第一步、传毒介体昆虫准备：取30头蚜虫至研钵中；

第二步、加入1.2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH 8.0的100 mM的Tris-HCl、1.4 M的 NaCl和20 mM 的EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2％巯基乙醇；

第三步、恒温处理：充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65℃温浴下处理15 min；

第四步、离心处理：首先，将离心管放入离心机中12000 r/min离心处理15 min，取750 μL上清液至另一1.5 mL的离心管，加入750 μL体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，涡旋震荡混匀30 s；然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中12000 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 μL上清液至又一1.5 mL的离心管中，并加入600 μL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中12000 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 μL 70% 乙醇，并放入离心机中12000 r/min离心处理10 min； 

第五步、干燥：用微量移液器吸出液体，沉淀部分在20℃条件下自然干燥10 min；

第六步、溶解：加入100 μL 20 mmol/L pH8.0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打5次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：核酸沉淀溶解液-20℃保存备用。

（3）一步法RT-PCR扩增：所述一步法RT-PCR采用宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScript^? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒，反应体系为15 μL，由0.6 μL 的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7.5 μL的2×1 Step Buffer、各0.6 μL的10 μM正反向引物TBTVdF和TBTVdR、各0.5 μL的10 μM正反向引物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0.4 μL的10 μM正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0.3 μL的10 μM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、2.8 μL的ddH₂O和0.5 μL的RNA 模板混合而成。

所述一步法RT-PCR的反应条件为：在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度为50℃，反应时间30 min；然后在温度为94℃时，保持2 min，使RTase失活；温度控制在94℃ 进行变性30 sec，在55℃退火处理30 sec，然后，温度控制在72℃，延伸1 min，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72℃再延伸10 min后的PCR产物在温度-4℃进行保存。

（4）电泳检测：在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1.0%的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 mL加入5 μL Gold View染色剂混匀。在0.5 × TBE缓冲液环境中，90 V稳压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。

（5）检测结果分析：观察发现，蚜虫材料中检测到了1049 bp、792 bp、598bp和357 bp 4条核酸带，根据表1中每对引物扩增片段大小与病毒的关系，参见图3的19号泳道，判断田间传毒蚜虫中感染的TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV 4种病原物，重复性好。

实证分析：扩增产物真实性验证

随机挑选上述扩增产物中的1049 bp、792 bp、598bp和357 bp 4条核酸带，在紫外灯下从凝胶中分别切下相应条带，采用爱思进生物技术（杭州）有限公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 50-prp纯化回收后，将回收产物连接至宝生物工程（大连）有限公司的pMD18-T Vector，按常规分子克隆方法转化至E. coli DH5α感受态细胞，采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒小量制备试剂盒（离心柱型）提取重组质粒，每个片段至少选3个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序。序列分析表明，1049 bp的cDNA与GenBank中登录的TBTV的核苷酸一致性达98%，792bp的cDNA与GenBank中登录的TVDVaRNA的核苷酸一致性达96%，598 bp的cDNA与GenBank中登录的Sat-TBTV的核苷酸一致性达96%，357 bp的cDNA与GenBank中登录的TVDV的核苷酸一致性达99%，证明通过本发明从田间传毒的蚜虫中获得的1049 bp、792bp、598 bp和357 bp 4条核酸带就是TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的相应cDNA扩增产物，再次证明本发明的扩增产物真实可信。

实施例5：

以温室人工饲毒蚜虫为材料，同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照下面步骤进行：

（1）引物设计合成：

（a）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

     （b）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

       TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，其中，序列中的R=A或G，

       TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，

       SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

       TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’，

上述引物由北京六合华大基因公司合成；

（2）CTAB法提取传毒介体昆虫的总核酸，作为RT-PCR扩增模板；具体按照下面步骤进行：

第一步、传毒介体昆虫的准备：取40头蚜虫至研钵中；

第二步、加入1.2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH 8.0的100 mM的Tris-HCl、1.4 M的 NaCl和20 mM 的EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2％巯基乙醇；

第三步、恒温处理：充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65℃温浴下处理35 min；

第四步、离心处理：首先，将离心管放入离心机中12500 r/min离心处理15 min，取750 μL上清液至另一1.5 mL的离心管，加入750 μL体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，涡旋震荡混匀30 s；然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中12500 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 μL上清液至又一1.5 mL的离心管中，并加入600 μL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中12500 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 μL 70 % 乙醇，并放入离心机中12500 r/min离心处理10 min； 

第五步、干燥：用微量移液器吸出液体，沉淀部分在23℃条件下自然干燥10 min；

第六步、溶解：加入100 μL 20 mmol/L pH8.0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打7次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：核酸沉淀溶解液-20℃保存备用。

（3）一步法RT-PCR扩增：所述一步法RT-PCR采用宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScript^? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒，反应体系为15 μL，由0.6 μL 的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7.5 μL 的2×1 Step Buffer、各0.6 μL的10 μM正反向引物TBTVdF和TBTVdR、各0.5 μL的10 μM正反向引物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0.4 μL的10 μM正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0.3 μL的10μM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、2.8 μL的ddH₂O和0.5 μL的RNA 模板混合而成。

所述一步法RT-PCR的反应条件为：在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度为50℃，反应时间30 min；然后在温度为94℃时，保持2min，使RTase失活；温度控制在94℃ 进行变性30 sec，在57℃退火处理30 sec，然后，温度控制在72℃，延伸1 min，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72℃再延伸10 min后的PCR产物在温度-4℃进行保存。

（4）电泳检测：在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1.0%的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 mL加入5 μL Gold View染色剂混匀。在0.5 × TBE缓冲液环境中，90 V稳压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。

（5）检测结果分析：观察发现，蚜虫材料中检测到了1049 bp、792 bp、598bp和357 bp 4条核酸带，而健康对照中未检测到任何条带，根据表一中每对引物扩增片段大小与病毒的关系，参见图1的 8和9号泳道，判断温室人工饲毒蚜虫感染了TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV 4种病原物，重复性好。

实证分析：扩增产物真实性验证

随机挑选上述扩增产物中的1049 bp、792 bp、598bp和357 bp 4条核酸带，在紫外灯下从凝胶中分别切下相应条带，采用爱思进生物技术（杭州）有限公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 50-prp纯化回收后，将回收产物连接至宝生物工程（大连）有限公司的pMD18-T Vector，按常规分子克隆方法转化至E. coli DH5α感受态细胞，采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒小量制备试剂盒（离心柱型）提取重组质粒，每个片段至少选3个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序。序列分析表明，1049 bp的cDNA与GenBank中登录的TBTV的核苷酸一致性达98%，792bp的cDNA与GenBank中登录的TVDVaRNA的核苷酸一致性达96%，598 bp的cDNA与GenBank中登录的Sat-TBTV的核苷酸一致性达96%，357 bp的cDNA与GenBank中登录的TVDV的核苷酸一致性达99%，证明通过本发明从温室人工饲毒蚜虫中获得的1049 bp、792bp、598 bp和357 bp 4条核酸带就是TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的相应cDNA扩增产物，再次证明本发明的扩增产物真实可信。

实施例6：

    1、实验材料

以田间感病烟草植株为材料，同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照下面步骤进行：

（1）引物设计合成：

（a）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

     （b）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

       TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，

       TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中，序列中的R=A或G，

       SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

       TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’，

上述引物由北京六合华大基因公司合成；

（2）CTAB法提取染病植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板，具体按照下面步骤进行：

第一步、感病植物组织准备：将5片病叶叠加在一起，称取80 mg至研钵中；

第二步、加入1.2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH 8.0的100 mM的Tris-HCl、1.4 M的 NaCl和20 mM 的EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2％巯基乙醇；

第三步、恒温处理：充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65℃温浴下处理60 min；

第四步、离心处理：首先，将离心管放入离心机中13000 r/min离心处理15 min，取750 μL上清液至另一1.5 mL的离心管，加入750 μL的体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，涡旋震荡混匀30 s；然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中13000 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 μL上清液至又一1.5 mL的离心管中，并加入600 μL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中13000 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 μL 70 % 乙醇，并放入离心机中13000 r/min离心处理10 min； 

第五步、干燥：用微量移液器吸出液体，沉淀部分在25℃条件下自然干燥10min；

第六步、溶解：加入100 μL 20 mmol/L _PH8.0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打10次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：核酸沉淀溶解液-20℃保存备用。

（3）一步法RT-PCR扩增：所述一步法RT-PCR采用宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScript^? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒，反应体系为15 μL，由0.6 μL 的PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7.5 μL 的2×1 Step Buffer、各0.6 μL的10μM正反向引物TBTVdF和TBTVdR、各0.5μL的10μM正反向引物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0.4μL的10μM正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0.3μL的10μM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、2.8 μL 的ddH₂O和0.5 μL 的RNA 模板混合而成。

所述一步法RT-PCR的反应条件为：在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度为50℃，反应时间30min；然后在温度为94℃时，保持2min，使RTase失活；温度控制在94℃ 进行变性30 sec，在60℃退火处理30 sec，然后，温度控制在72℃，延伸1 min，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72℃再延伸10 min后的PCR产物在温度-4℃进行保存。

（4）电泳检测：在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1.0%的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 mL加入5μL Gold View染色剂混匀。在0.5 × TBE缓冲液环境中，90 V稳压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。

（5）检测结果分析：观察发现，在田间感病烟草植株叶片中检测到了792 bp和357 bp 2条核酸带，而健康对照中未检测到任何条带，根据表1中每对引物扩增片段大小与病毒的关系，参见图3的17和20号泳道，判断从田间感病烟草叶片中检测到了TVDVaRNA和TVDV这种2种病原物。

实证分析：扩增产物真实性验证

随机挑选上述扩增产物中的792 bp和357 bp 2 条核酸带，在紫外灯下从凝胶中分别切下相应条带，采用爱思进生物技术（杭州）有限公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 50-prp纯化回收后，将回收产物连接至宝生物工程（大连）有限公司的pMD18-T Vector，按常规分子克隆方法转化至E. coli DH5α感受态细胞，采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒小量制备试剂盒（离心柱型）提取重组质粒，每个片段至少选3个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序。序列分析表明，792 bp的cDNA与GenBank中登录的TVDVaRNA的核苷酸一致性达99%， 357 bp的cDNA与GenBank中登录的TVDV的核苷酸一致性达99%，证明通过本发明从田间感病烟草植株中获得的792 bp和357 bp 这2条核酸带就是TVDVaRNA和TVDV的相应cDNA扩增产物，再次证明本发明的扩增产物真实可信。

通过对温室和田间的烟草及蚜虫样品所扩增的目标条带进行割胶纯化回收、cDNA克隆及序列分析均验证了所扩增产物的真实性，并对各引物的工作浓度、退火温度等进行了优化，最终确定了检测这4种病原物的反应体系和PCR扩增的循环参数等。

为尽可能节约检测成本，在进行RT-PCR扩增时，可以将反应体系由通常的50μL优化减少至15μL，15μL反应体系中各引物的最佳工作浓度为：10 μM正反向引物TBTVdF和TBTVdR各0.6 μL、10 μM正反向引物TVDVaRNAdF和 TVDVaRNAdR各0.5 μL、10 μM正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR各0.4 μL、10 μM正反向引物TVDVdF和TVDVdR各0.3 μL。PCR扩增的最佳退火温度为60℃。另外，本发明对稀释至10^-3的样品模板仍能同时获得4种病原物清晰的扩增结果（参见图2）。因此，本发明设计的引物特异性强，尽可能地避免了引物间的相互干扰，能真正做到对TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的准确检测鉴定，重复性好、灵敏度高。

传统RT-PCR检测烟草丛顶病病原物时要对TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA 4种病原物逐一进行检测，所用的试剂量较大，耗时较长。本方法将反转录和多重PCR一步完成，一次反应即能同时检测4种病原物，且反应体系仅为通常体系的三分之一，与传统RT-PCR相比，在对大批量样品进行检测时最多能够节约三分之二的检测时间和试剂成本。此外，在总RNA的提取中，用CTAB法提取染病植物组织及传毒介体昆虫的总RNA，既能保证所提RNA的质量，也能显著降低检测成本。因此，本发明具有高效率、低成本的特点，尤其适合较大样品量的快速检测。

结果表明：无论是在一种病毒单独侵染，还是在两种或4种病原物复合侵染的情况下，本发明的方法均能在相同实验条件下从温室和田间感病烟草样品及介体蚜虫中检测到相应病原物，而阴性对照无非特异性结果发生，检测结果特异性强、真实可靠。由于反转录与多重PCR一步完成，一次扩增就能同时检测TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV 4种病原物，既简化了检测手续，又节约了检测时间和检测成本。另外，CTAB法提取染病植物组织或介体蚜虫的总核酸既能保证所提总RNA的质量，也能有效降低检测成本。因此本发明具有效率高、特异性强、灵敏度高和成本低等优点，可应用于烟草或其他相关植物及传毒介体昆虫上发生的TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV等 4种病原物的同步检测，具有广阔的应用前景。

本发明是通过附图进行说明的，在不脱离本发明范围的情况下，还可以对本发明专利进行各种变换及等同代替，因此，本发明专利不局限于所公开的具体实施过程，而应当包括落入本发明专利权利要求范围内的全部实施方案。