一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法

摘要

本发明公开了一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，以在鲫鱼肠道细胞中调控营养物质消化吸收的关键转录因子CDX2的表达作为分析鲫鱼消化吸收率的依据，根据其荧光定量PCR结果来进行分子水平的分析，既涵盖传统的消化吸收率评定方法，又提出了更为方便的基因分析来进行评定：选择鲫鱼肠道细胞中CDX2基因的定量表达结果与传统湿式灰化定量法测的鲫鱼表观消化率呈正相关作为评定依据。与传统方法相比，本发明可以从分子水平准确的对鲫鱼表观消化率和以后的肠道消化吸收潜能进行评定，方法简单、方便，能够为鲫鱼饲料配方优化提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明属于鲫鱼消化吸收率分析技术领域，涉及一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法。

背景技术

鱼类对饲料中营养物质的充分利用是鱼类快速生长的必要条件，因此其对营养物质的消化吸收直接影响鱼类生产性能的提高。在饲料配方中，把鲫鱼对饲料的消化吸收率进行准确评价以选择优良饲料是确保鲫鱼高效养殖的重要前提。

消化吸收率是评价饲料营养价值的重要指标之一。而目前对其研究的方法主要有两种：体外消化法和体内消化法。体外消化法虽简便但无法反映体内消化的真实情况，所以缺乏可靠性，已很少采用。体内试验法又分为直接法和间接法两种。直接法由于工作量太大而没有间接法那样应用广泛。无论是直接法还是间接法，都存在粪便的收集问题，操作繁琐。

相关研究发现，CDX2作为一种肠道上皮细胞特异性核转录因子，对肠道发育以及营养物质在肠道内消化吸收起着关键性作用。它调控了机体内糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢和矿物元素代谢等相关功能基因的表达，并对肠道上皮细胞增殖、分化具有重要的调节作用。在实践中发现，CDX2基因的相对表达量随着鲫鱼消化吸收率的升高而升高，降低而降低。于是就产生了用CDX2基因作为鲫鱼消化吸收率的一个分子标志，进而用来评价鲫鱼对某种饲料消化吸收的程度，具有重要的理论指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，该方法能够对鲫鱼的消化吸收率进行准确的评定并能预测其以后肠道消化吸收的潜力，为鲫鱼的饲料配方优化提供技术支持。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法包括以下步骤：

（1）取待检测的鲫鱼，解剖并分离出肠道，将肠道投入保存液中，以用于基因表达的分析；

（2）提取第（1）步中的肠道总RNA；

（3）反转录合成cDNA；

（4）以第（3）步中的cDNA为模板，用CDX2引物进行PCR克隆，其中，CDX2引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

（5）实时荧光定量PCR检测，其中，目的基因引物为所述的CDX2引物，荧光定量内参基因引物为管家基因β-Actin引物，该引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

（6）定量PCR结束后，从扩增曲线得出Ct值，计算CDX2基因的表达量，CDX2基因的表达量=2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)- ΔCt校准样，根据CDX2基因的表达量来判断鲫鱼消化吸收率的高低，即CDX2基因的表达量高，鲫鱼的消化吸收率高，相反，CDX2基因的表达量低，鲫鱼的消化吸收率低。

上述的基因分析方法，第（4）步cDNA片段克隆的PCR反应体系：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH₂O加至25 μL；PCR反应流程：94 ℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，4℃10 min。

上述的基因分析方法，第（5）步实时荧光定量PCR检测， 按照SYBR Green I 染料法要求，二步法进行定量PCR，反应体系：Takara SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL、浓度10 μM的上下游引物各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH₂O加至25 μL，反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s、55 ℃ 25 s、72 ℃ 11 s 共40个循环，95 ℃1 min、55 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s 终止，4 ℃保存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）本发明提供的用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，将传统的化学分析方法提高到分子水平的基因分析方法，操作简单且准确率高。

（2）以肠道上皮细胞特异性核转录因子CDX2基因的表达作为鲫鱼肠道消化吸收率的评定方法，根据其表达量的高低来进行鲫鱼消化吸收率的分析，不但可以从分子水平快速方便对鲫鱼消化吸收率进行评定，还可以对其以后肠道消化吸收的潜能进行评定，方法简单且准确率高，能够为鲫鱼饲料配方优化提供技术支持。

附图说明

图1：丁酸钠对鲫鱼肠道CDX2基因相对表达量的影响；                                           

图2：CDX2基因的相对表达量与干物质表观消化率建立的数学模型。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

本发明提供一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，通过对肠道上皮细胞特异性核转录因子CDX2基因进行定量PCR表达分析，根据其在鲫鱼肠道中的表达量，进而从分子水平上评定鲫鱼的消化吸收率，下面检测丁酸钠对鲫鱼肠道CDX2基因表达量和消化吸收率的影响。

以初始体重（6.02±0.16）g 的鲫鱼为研究对象，在鲫鱼基础饲料中分别添加0.0 g/kg、1.0 g/kg、 2.5 g/kg 、5.0 g/kg 、7.5 g/kg的包膜丁酸钠，配制5种等氮等能的实验饲料。饲料配方如下：各原料组份按重量百分比为：面粉8%、淀粉20%、豆粕32%、鱼粉28%、豆油3%、鱼油3%、氯化胆碱0.5%、磷酸二氢钙1%、三氧化二铬0.5%、甲基纤维素2%、预混料2%。其中预混料可为每公斤饲料提供：VA 20 mg；VB₁ 10 mg；VB₂ 15 mg；VB₆ 15 mg；VB₁₂8 mg；烟酸胺100 mg；VC(35%) 1000 mg；泛酸钙40 mg；生物素2 mg；肌醇200 mg；叶酸10 mg；VE 400 mg；VK 320 mg；VD 310 mg；MgSO₄·7H₂O 600 mg；ZnSO₄·7H₂O 600 mg；MnSO₄·7H₂O 80 mg；ki 1.5 mg；Na₂SeO₃ 3 mg；CoCl·6H₂O(10%) 5 mg；CuSO₄·5H₂O 30 mg；NaCl 100 mg；次粉150 mg；沸石粉4780.5mg；抗氧化剂200 mg。

研究不同浓度包膜丁酸钠通过促进鲫鱼肠细胞增殖对其生长作用的影响。实验在室内养殖系统中进行，每水族缸饲喂30尾，每处理组3个重复，以鱼体重3%－5%投喂量，日投喂3次，试验持续7周。其中，对照组投喂的饲料中包膜丁酸钠含量为0.0 g/kg，四个实验组投喂的饲料中包膜丁酸钠含量分别为1.0 g/kg、 2.5 g/kg 、5.0 g/kg 、7.5 g/kg。

试验结束后，用本发明检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，对上述各组的鲫鱼进行基因表达分析，具体过程如下：

（1）随机取待检测的鲫鱼3尾，在冰盘上解剖并分离出肠道，样品迅速投入RNA fixer （RNA fixer购自北京百泰克生物技术有限公司)保存液中，用于基因表达的分析；

（2）从NCBI中查询并下载斑马鱼(NM_001098762）、塞内加尔多鳍鱼(DQ522900)的CDX2基因序列，DNAMAN软件查找基因的同源保守区。用Primer Premier 5.0软件设计引物，用于下面步骤CDX2基因的cDNA片段克隆和实时荧光定量PCR检测。参照金鱼管家基因β-actin(AB039726)设计内参引物Actin, 作为荧光定量内参基因引物，设计的两对引物见表1：

                 表1

（3）按照总RNA提取试剂盒说明书（试剂盒为E.Z.N.A.^TM Total RNA KitⅡ，购自OMEGA公司）提取待检测鲫鱼前肠组织总RNA。

（4）反转录合成cDNA ，DNA酶消化总RNA样品（3μg总RNA/1 μL DNase）。cDNA第一链的合成（RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，购自Fermentas公司）：RNA 模板1 μL、0.5 μg /μL oligo(dT) 18引物1 μL、DEPC处理的dd H₂O 补足12 μL，65 ℃水浴5 min。简短离心立即放在冰上1min，加入5×Reaction Buffer 4 μL、40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL、10mM dNTP Mix 2 μL、Transcriptase 1 μL，简短离心立即放在42 ℃水浴60 min，70 ℃终止反应10 min，-20 ℃保存。

（5）CDX2基因的cDNA片段克隆，  PCR反应体系：2×PCR Taq Mix 12.5 μL、CDX2基因上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH₂O加至25 μL。PCR反应流程：94 ℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，4℃10 min；

（6）实时荧光定量PCR检测，根据Kenneth 等设计的比较阈值法来测定目的基因在不同组织的相对表达量。按照SYBR Green I染料法要求，二步法进行定量PCR（SYBR^? Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒，购于TaKaRa）。反应体系：Takara SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL、上下游引物S、A（10 μM）各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH₂O加至25 μL。反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s、55 ℃ 25 s、72 ℃ 11 s 共40个循环，95 ℃1 min、55 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s 终止，其中，目的基因引物为CDX2引物，荧光定量内参基因引物为管家基因β-Actin引物。

（7）定量PCR结束后，从扩增曲线得出Ct值，根据Ct 值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)计算基因引物的扩增效率和分析熔解曲线, 以确定引物和扩增参数达到进行荧光定量检测组织相对表达量的要求。各样品引物PCR扩增的Ct 值由各自的扩增曲线分别得出, 并根据公式: ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)- ΔCt校准样（参考Chillaron J,Roca R,Valencia A, et al. Heteromeric amino acid transporters: biochemistry, genetics, and physiology[J]. American Physiological Society, 2001,281(6):995-1018.

）, 其中ΔCt校准样设置为8， 计算出样品中基因CDX2 mRNA 相对表达丰度, 然后作图。根据CDX2基因的表达量来判断鲫鱼消化吸收率的高低，即CDX2基因的表达量高，鲫鱼的消化吸收率高，相反，CDX2基因的表达量低，鲫鱼的消化吸收率低。

本发明中的引物合成均由博尚生物技术公司完成；所使用的仪器有：Stratagene Mx3000p实时荧光定量PCR仪，S1000^TM Thermal Cycler PCR扩增仪，购自美国；BYY-6B型稳压稳流电泳仪，DZKW-4电子恒温水浴锅，购自北京；BIOFUGE tresco 台式离心机，BS224S电子天平，购自德国。

实验结果表明：与对照组相比，丁酸钠添加量达到2.5 g/kg时，鲫鱼干物质与蛋白质表观消化率、肠道CDX2基因的相对表达量显著升高，分别比对照组提高8.36%、6.21%和56.43%（P<0.05）。而且鲫鱼干物质与蛋白质表观消化率随着肠道CDX2基因相对表达量的升高而升高，下降而下降，呈现的规律与本发明描述内容相一致，具体请见表2和图1。

表2 丁酸钠对鲫鱼饲料表观消化率的影响

丁酸钠水平（g/Kg）干物质表观消化率(%)蛋白质表观消化率(%)067.83±0.2581.13±0.141.069.2±0.5383.13±0.292.573.5±0.2286.17±0.125.073.6±0.4286.83±0.217.5 62.67±1.2176.67±0.76

将CDX2基因的相对表达量与干物质表观消化率建立的数学模型如下：

Y=0.2079X+58.335

从上述函数可以看出，它们之间具有高度的线性正相关性。

综上所述，本发明用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，将传统的化学分析方法提高到分子水平的基因分析方法，不仅可以从分子水平评价鲫鱼的消化吸收率，还能预测其以后肠道消化吸收的潜力，为鲫鱼的饲料配方优化提供技术支持。

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<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

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