一株Pseudomonas psychrophila HA-4低温磺胺甲基异恶唑降解菌及其筛选方法和应用

摘要

一株

说明书

技术领域

本发明属于生物工程、环境工程技术领域，涉及菌株Pseudomonas psychrophila HA-4及其在降解磺胺甲基异恶唑中的应用。

背景技术

药品与个人护理用品(Pharmaceuticals and personal care products) 主要包括各种处方药和非处方药、香料、染发剂、化妆品、遮光剂、发胶、洗发水、香皂等。其中大部分药物在生物体内未经代谢就直接排入到环境中，另外在药物的生产过程中以及处理过期与未使用药物的过程中也会导致其进入水环境中；个人护理用品也会在洗漱和游泳时直接进入水环境。

尽管多数PPCPs在环境中存在的浓度很低，但由于生物富集作用, 随着时间的增加，PPCPs将最终对生态系统，尤其对水环境产生深远且不可恢复的影响。水体中PPCPs常用的处理方法有物理法、化学法和生物法等，而生物处理法相较而言被认为是最为环境友好和成本低廉的方法。PPCPs的生物处理与其化合物的结构、初始浓度、初级底物的浓度、接种微生物的来源及培养时间有关。

磺胺甲基异恶唑作为一种抗菌药物被广泛地应用于人体，它属于PPCPs中的一种。目前，在我国城市污水处理厂出水中，该药物的平均浓度水平最高，甚至有负去除的现象存在，而且在北方地区其平均浓度在冬季要高于春季。

国外研究表明，Bacillus firmus 、Bacillus cereus 、Rhodococcus rhodochrous、Pseudomonas、 Flavobacterium 、Aeromonas 等具有降解磺胺甲基异恶唑的能力。目前，国内外研究学者主要研究磺胺甲基异恶唑在常温条件下的生物降解而在低温条件下的报道较少。

发明内容

本发明的目的就是为强化低温生化系统去除以磺胺甲基异恶唑为代表的PPCPs类污染物的效能，从自然界中分离出菌株Pseudomonas psychrophila HA-4，能够在低温环境中促进磺胺甲基异恶唑的降解，对低温城市污水中的磺胺甲基异恶唑的去除奠定理论基础。是一株低温假单胞菌属菌株。

本发明的技术解决方案是：一株Pseudomonas psychrophila HA-4低温磺胺甲基异恶唑降解菌，其特征在于是一株低温假单胞菌属菌株，于2012年3月27 日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No.5944。

菌株Pseudomonas psychrophila HA-4是从活性污泥中分离得到，设定温度(10℃)筛选，具体筛选步骤如下：

（1）取20mL哈尔滨太平城市污水厂好氧池新鲜活性污泥加入100mL含有20mg/L以磺胺甲基异恶唑为唯一碳源、能源的无机盐培养基三角瓶中，置于温度为10℃，转速为150r/min的摇床中培养一周，获得富集菌液；

（2）取10mL富集菌液加入100mL磺胺甲基异恶唑无机盐培养基三角瓶中，重复步骤（1）的培养条件3~4次，每次磺胺甲基异恶唑的浓度逐级提高，最终至100mg/L，获得驯化菌液；

（3）取100μL驯化菌液加入含有100mg/L磺胺甲基异恶唑固体无机盐培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为10℃的培养箱中，培养一周，获得单菌落；

（4）重复操作步骤（3）3~4次，即完成纯种低温磺胺甲基异恶唑降解菌的获得；

（5）将筛选出的纯种低温磺胺甲基异恶唑降解菌接种到斜面富集培养基，于4 ^oC下保存，接种量10%；

其中无机盐培养基的成分是：3.5g K₂HPO₄、0.5gNaCl、1.5g KH₂PO₄、0.15g MgSO₄·7H₂O、0.5g (NH₄)₂SO₄、1mL 微量元素溶液溶于1000mL蒸馏水中，调节pH7.0；无机盐固体培养基的成分是在无机盐培养基的成分中另加入琼脂  2g/L;

富集培养基成分为：1.5 g KH₂PO₄、 0.15 g MgSO₄·7H₂O、 0.5 g (NH₄)₂SO₄、0.5 g NaCl、3.5 g K₂HPO₄、2g蛋白胨、18g 琼脂、 1.0 mL微量元素溶液溶于1000mL的蒸馏水中，调节pH到7.0；

微量元素溶液的成分是：0.1 g CuSO₄·5H₂O、 0.3 g MnSO₄·4H₂O、0.2 g ZnSO₄·7H₂O、 2.0 g NaHCO₃·10H₂O、 0.5 g CoCl₂·6H₂O、0.05g CaCl₂·2H₂O、0.5g FeSO₄·7H₂O、0.02g (NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O溶于1000mL的蒸馏水中。

步骤（2）获得的驯化菌液的OD₆₆₀=1.192；培养基均是在121℃，高压灭菌20分钟后使用。

该菌株Pseudomonas psychrophila HA-4适宜在 (pH 6.0)的培养介质中生长，生长温度为10℃，其细菌学形态特征：为革兰氏阴性杆菌，无鞭毛，好氧，可降解磺胺甲基异恶唑，能够以磺胺甲基异恶唑为唯一碳源和能源生长。

经过菌种鉴定，得到了长度为1609bp的16S rDNA序列。

PCR引物采用细菌16S rDNA的通用引物 F8 (5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG- 3)和 R1522 (5’-AAG GAC GTC ATC CAG CCG CA-3’）。用PCR仪（GeneAmp, PCR System 9700）进行扩增反应。反应体系总体积为25μl：超纯水16.2μl，10хBuffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，F8引物1 μl，R22引物1 μl，ExTaq酶 0.3 μl，总DNA作一定稀释后取2 μl于反应体系中。94℃预变性5 min, 经过30个循环，其中，98℃变性20 s，55℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，30个循环后再在72℃延伸7 min，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测。通过Blast程序进行同源性比较，表明该菌株与 Pseudomonas psychrophila的同源性高达99%。

本发明的菌株Pseudomonas psychrophila HA-4应用于低温下污水中磺胺甲基异恶唑的生物处理。

本发明的菌株Pseudomonas psychrophila HA-4在应用前需在带有磺胺甲基异恶唑的无机盐培养基中进行驯化，培养条件为菌株在10℃，pH 7.0，低温好氧培养。该菌株对低温生境中磺胺甲基异恶唑有较高的降解能力，且具有广泛的底物广谱性，见表1：

表1 菌株HA-4的底物广谱性

底物结果底物结果卡马西平+咔唑+17α-乙炔基雌二醇+雌酮+雌三醇+二苯胺+硝基苯-联苯胺+对苯二酚+1-氨基-2-荃酚-4-磺酸+布洛芬+二甲苯-二异酸甲苯酯+4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶+甲苯-苯-

注: +: 生长良好; -: 不生长

本发明所达到的有益效果是：本发明提供的菌株Pseudomonas psychrophila HA-4具有较高的降解磺胺甲基异恶唑的能力，在菌株最佳生长条件下，对100 mg/L的磺胺甲基异恶唑，在短时间内，降解率达到35.34%以上。

附图说明

图1 是本发明的菌株Pseudomonas psychrophila HA-4的扫描电镜照片。

图2 是本发明的菌株Pseudomonas psychrophila HA-4在以磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮源培养基中生长与磺胺甲基异恶唑降解曲线图。

图3 是本发明的菌悬液对不同初始浓度磺胺甲基异恶唑的降解曲线图。

图4 是本发明的假单胞菌属菌株在以初始浓度为100mg/L的磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮源培养基中的最佳pH生长条件的确定。

图5 是本发明的假单胞菌属菌株在以初始浓度为100mg/L的磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮源培养基中的最佳温度生长条件的确定。

图6是本发明的假单胞菌属菌株在以初始浓度为100mg/L的磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮源培养基中的最佳转速生长条件的确定。

图7 是本发明的假单胞菌属菌株在以初始浓度为100mg/L的磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮源培养基中的最佳接种量生长条件的确定。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明提供的菌株Pseudomonas psychrophila从活性污泥中分离得到，设定温度(10℃)筛选，具体筛选步骤如下：

（1）取20mL哈尔滨太平城市污水厂好氧池新鲜活性污泥加入100mL含有20mg/L以磺胺甲基异恶唑为唯一碳源、能源的无机盐培养基三角瓶中，置于温度为10℃，转速为150r/min的摇床中培养一周，获得富集菌液；

（2）取10mL富集菌液加入100mL磺胺甲基异恶唑无机盐培养基三角瓶中，重复步骤（1）的培养条件3~4次，每次磺胺甲基异恶唑的浓度逐级提高，最终至100mg/L，获得驯化菌液，获得的驯化菌液的OD₆₆₀=1.192；

（3）取100μL驯化菌液加入含有100mg/L磺胺甲基异恶唑固体无机盐培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为10℃的培养箱中，培养一周，获得单菌落；

（4）重复操作步骤（3）3~4次，即完成纯种低温磺胺甲基异恶唑降解菌的获得；

（5）将筛选出的纯种低温磺胺甲基异恶唑降解菌接种到斜面富集培养基，于4 ^oC下保存，接种量10%；

其中无机盐培养基的成分是：3.5g K₂HPO₄、0.5gNaCl、1.5g KH₂PO₄、0.15g MgSO₄·7H₂O、0.5g (NH₄)₂SO₄、1mL 微量元素溶液溶于1000mL蒸馏水中，调节pH7.0；无机盐固体培养基的成分是在无机盐培养基的成分中另加入琼脂  2g/L;

富集培养基成分为：1.5 g KH₂PO₄、 0.15 g MgSO₄·7H₂O、 0.5 g (NH₄)₂SO₄、0.5 g NaCl、3.5 g K₂HPO₄、2g蛋白胨、18g 琼脂、 1.0 mL微量元素溶液溶于1000mL的蒸馏水中，调节pH到7.0；

微量元素溶液的成分是：0.1 g CuSO₄·5H₂O、 0.3 g MnSO₄·4H₂O、0.2 g ZnSO₄·7H₂O、 2.0 g NaHCO₃·10H₂O、 0.5 g CoCl₂·6H₂O、0.05g CaCl₂·2H₂O、0.5g FeSO₄·7H₂O、0.02g (NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O溶于1000mL的蒸馏水中。

培养基均是在121℃，高压灭菌20分钟后使用。

该菌株Pseudomonas psychrophila HA-4适宜在 (pH 6.0)的培养介质中生长，生长温度为10℃，其细菌学形态特征：为革兰氏阴性杆菌，无鞭毛，好氧，可降解磺胺甲基异恶唑，能够以磺胺甲基异恶唑为唯一碳源和能源生长。

该菌株Pseudomonas psychrophila HA-4培养特征：

该菌在以磺胺甲基异恶唑为唯一碳源的固体培养基上10℃培养6-7天，菌落小，呈圆形，边缘整齐，略有凸起，菌落呈乳白色，极易挑起。扫描电镜观察为短杆菌（见图1）。

本发明提供的菌株Pseudomonas psychrophila HA-4的16S rDNA序列。

PCR引物采用细菌16S rDNA的通用引物 F8 (5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG- 3)和 R1522 (5’-AAG GAC GTC ATC CAG CCG CA-3’）。用PCR仪（GeneAmp, PCR System 9700）进行扩增反应。反应体系总体积为25μl：超纯水16.2μl，10хBuffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，F8引物1 μl，R22引物1 μl，ExTaq酶 0.3 μl，总DNA作一定稀释后取2 μl于反应体系中。94℃预变性5 min, 经过30个循环，其中，98℃变性20 s，55℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，30个循环后再在72℃延伸7 min，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测。通过Blast程序进行同源性比较，表明该菌株与 Pseudomonas psychrophila的同源性高达99%，序列如下：

TTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGATAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCT

实施例2

本发明在以磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮源培养基中对其降解及菌株Pseudomonas psychrophila HA-4生长状况研究的应用，其步骤如下：

菌株Pseudomonas psychrophila HA-4在温度10℃、初始pH值6.0、摇床转速150r/min，50mL锥形瓶装液量20mL的条件下，HA-4菌悬液的接种量为15%，磺胺甲基异恶唑降解体系的初始浓度100mg/L，连续培养192h，每24h检测磺胺甲基异恶唑的浓度。采用高效液相色谱法，色谱条件是采用Waters e2695 Alliance HPLC，色谱柱为Symmetry                                                -C18柱(4.6×250 mm, 5 μm)；流动相为乙腈：甲酸水=40：60（V/V）；检测波长265nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；进样量10μL；保留时间8min。测得192h内磺胺甲基异恶唑的降解率为35.34%。

制备HA-4菌悬液：

将用富集培养基培养的HA-4菌液分装到离心管中, 在8000 r/min 条件下离心15 min，弃去上清液, 然后向离心管中加入灭过菌的磷酸缓冲溶液，搅匀离心管底部沉淀的菌体，再次离心, 如此洗涤菌体3次, 以去除菌体表面吸附的培养基。将得到的菌体用无机盐培养基配置，即得到菌悬液。图2为菌株Pseudomonas psychrophila HA-4在富集培养基中的生长与磺胺甲基异恶唑的降解情况；由图可知，磺胺甲基异恶唑的降解发生在菌株生长的对数期。

实施例3

本发明在以磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮源培养基中对其降解研究的应用：

将变化实施例2中磺胺甲基异恶唑降解体系的初始浓度，其它步骤同实施例2。图3为HA-4菌悬液对不同初始浓度磺胺甲基异恶唑的降解情况；由图3可见，菌株Pseudomonas psychrophila HA-4对磺胺甲基异恶唑有高效的降解能力，可耐受磺胺甲基异恶唑浓度高达200mg/L。

实施例4

本发明的假单胞菌属菌株的最佳生长条件研究的应用：

将实施例2中以磺胺甲基异恶唑为唯一碳、氮源培养基换为富集培养基，变化 pH、温度、摇床转速以及接种量，其它步骤同实施例2。由图4、图5、图6以及图7可见，在初始浓度100mg/L的磺胺甲基异恶唑降解体系中，连续培养192h，菌株Pseudomonas psychrophila HA-4的最佳生长条件，即温度10℃、pH=6.0、摇床转速150r/min、接种量为10%。

TTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGATAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCT