miR-214在制备预防或治疗老年痴呆症产品中的应用

摘要

本发明公开了一种miR-214在制备预防或治疗老年痴呆症产品中的应用。本发明提供了miR-214在制备如下1）和/或2）产品中的应用：1）预防和/或治疗老年痴呆症；2）降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量；所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列1。本发明的实验证明，提高miR-214表达的物质可以预防和/或治疗神经退行性疾病如老年痴呆症。而在早期的临床诊断中，miR-214也可以作为诊断神经退行性疾病的生物指标，通过检测病人中miR-214水平的检测，结合其他有效指标，医生可以对病人进行及时的神经退行性疾病早期诊断，进而对神经退行性疾病和认知水平的损失进行有效的控制。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种miR-214在制备预防或治疗老年痴呆症 产品中的应用。

背景技术

老年性痴呆(Alzheimer,AD)是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性 进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障 碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的 病因及发病机制尚未阐明。老年痴呆症作为退化疾病，必须在尸检时才能发现。

发明内容

本发明的一个目的是提供miR-214的新用途。

本发明提供了miR-214在制备如下1）和/或2）产品中的应用：

1）预防和/或治疗老年痴呆症的产品；

2）降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量的产品；

所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述应用中，所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导引起。

上述应用中，所述产品为药物；所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。

本发明的另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，为miR-214或miR-214类似物；

所述产品为如下1）和/或2）：1）预防和/或治疗老年痴呆症；2）降低老年痴呆 症的神经元细胞死亡数量；

所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述miR-214类似物为Syn-mmu-miR-214-3p miScript miRNA Mimic（QIAGEN  MSY0000661）。

上述产品中，所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导引起。

上述产品中，所述产品为药物；

所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。

提高miR-214表达的物质在制备如下1）和/或2）产品中的应用也是本发明保护 的范围：

1）预防和/或治疗老年痴呆症；

2）降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量；

所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述提高miR-214表达的物质为miR-214或miR-214类似物。

上述miR-214类似物为Syn-mmu-miR-214-3p miScript miRNA Mimic（QIAGEN  MSY0000661）；上述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述应用中，所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导引起；

所述产品为药物；

所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。

本发明的实验证明，与mi-214抑制剂、Scramble相比，miR-214和mi-214类似 物可以降低老年痴呆症的神经元细胞的死亡率，说明miR-214具有预防和/或治疗老年 痴呆症的作用；在异氟醚的伤害处理下，老年痴呆症的神经元细胞的死亡率增加，但 是在miR-214和mi-214类似物租用下仍然可以降低老年痴呆症的神经元细胞的死亡 率，说明即使在异氟醚的伤害处理下，miR-214仍具有预防和/或治疗老年痴呆症的作 用。

附图说明

图1为在大鼠神经元中显微注射miR-214或者mimic miR-214(M-miR-214)抵消 了培养基中外源性的Aβ1-42预处理情况下异氟醚引起的细胞死亡

图2为在大鼠神经元中显微注射miR-214或者mimic miR-214(M-miR-214)抵消 了细胞内Aβ1-42毒性作用下异氟醚引起的细胞死亡

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、miR-214在预防或治疗老年痴呆症中的应用

一、老年痴呆症神经元细胞模型的建立

对分离培养的神经元进行淀粉样蛋白beta的处理可以很好地模拟老年痴呆症， 具体如下：

1、分离培养获得神经元细胞

1）、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被10min，吸除，无菌 操作台上15min自然晾干，置于培养箱中备用；

2）、取脑：选取新生24h的SD大鼠（维通立华，名称：SD大鼠24小时乳鼠） 数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用 弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪 刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）

3）、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回， 小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，充分剪碎组织；

4）、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37℃培养箱内 消化20min左右，期间轻摇数次；

5）过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液 体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；

6）、接种：以1100rpm离心5min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞， 轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为100000个/ml， 加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于37℃、含5%CO2培养箱 中培养；12小时内禁止晃动

7)、换液：接种后24h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48h时 加入终浓度为10μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3d 半量换无血清DMEM/F12培养液，得到离体神经元细胞。

2、淀粉样蛋白beta的处理神经元细胞得到老年痴呆症的神经元细胞模型

eAβ1-42的处理：直接向培养离体神经元细胞的培养液中加入终浓度为1μm的 Aβ1-42（BACHEM H-1368），培养1天，得到eAβ1-42处理老年痴呆症的神经元细胞， 即为老年痴呆症的神经元细胞模型。

iAβ1-42的处理：通过显微注射的方法向离体神经元细胞内注射浓度为10nm Aβ1-42水溶液(25Fl/cell)，培养1天，得到iAβ1-42处理老年痴呆症的神经元细 胞，即为老年痴呆症的神经元细胞模型。

二、miR-214在预防或治疗老年痴呆症中的应用

异氟醚，是一种带乙醚样气味的无色澄明液体，用于各种手术全身、半身麻醉。

miR-214的核苷酸序列为：ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU（序列1）；注射前溶于生理 盐水（0.9%氯化钠水溶液）中，得到10nM的miR-214溶液。

Syn-mmu-miR-214-3p miScript miRNA Mimic（QIAGEN MSY0000661；又称为mi-214 类似物或M-mi-214）、Anti-mmu-miR-214-3p miScript miRNA Inhibitor（QIAGEN  MIN0000661；又称为mi-214抑制剂或I-mi-214）、Scramble均购自QIAGEN公司购买 https://www.qiagen.com/geneglobe/searchresults.aspx?hits=10&usedl inktype=l ink。

注射前M-mi-214（mi-214类似物）、I-mi-214（mi-214抑制剂）、Scramble分别 溶于生理盐水（0.9%氯化钠水溶液）中，得到10nM的M-mi-214（mi-214类似物）溶 液、I-mi-214（mi-214抑制剂）溶液、Scramble溶液。

1、miR-214对eAβ1-42处理老年痴呆症的神经元细胞模型的影响

1）方法

分为异氟醚处理组和对照处理组：

A、异氟醚处理组（isoflurane）：将eAβ1-42处理老年痴呆症的神经元细胞中加 入终浓度为0.5%（异氟醚占细胞培养液的体积百分含量）异氟醚(Guoyao Group, Beijing,China)后，在5%CO₂、37度培养3h得到异氟醚处理组细胞；将异氟醚处理 组细胞再进行如下5个小组处理：

无RNA处理小组：不经过任何处理的异氟醚处理组细胞37度5%CO₂培养；

miR-214小组：将终浓度10nM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50个异氟 醚处理组细胞中，37度5%CO₂培养；为提高miR-214表达小组；

M-mi-214（mi-214类似物）小组：将终浓度10nM的M-mi-214溶液按照25fL/cell 注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%CO₂培养；为提高miR-214表达小组；

I-mi-214（mi-214抑制剂）小组：将终浓度10nM的I-mi-214溶液按照25fL/cell 注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%CO₂培养；为抑制miR-214表达小组；

Scramble小组：将终浓度10nM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50个异 氟醚处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

B、对照处理组（ctrl）：将eAβ1-42处理老年痴呆症的神经元细胞在5%CO₂，37 度培养3h得到对照处理组细胞；再将对照处理组细胞进行如下5个小组处理：

无RNA处理小组：不经过任何处理的对照处理组细胞在37度5%CO₂培养；

miR-214小组：将终浓度10nM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50个对照 处理组细胞中，37度5%CO₂培养；为提高miR-214表达小组；

M-mi-214（mi-214类似物）小组：将终浓度10nM的M-mi-214溶液按照25fL/cell 注射到50个对照处理组细胞中，37度5%CO₂培养；为提高miR-214表达小组；

I-mi-214（mi-214抑制剂）小组：将终浓度10nM的I-mi-214溶液按照25fL/cell 注射到50个对照处理组细胞中，37度5%CO₂培养；为抑制miR-214表达小组；

Scramble小组：将终浓度10nM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50个对 照处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

2)细胞死亡率检测

（1）上述各小组培养24h时间后，取培养在玻片上的细胞，4%多聚甲醛固定25min， PBS浸洗二次，每次5min；

（2）将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100中处理15min，PBS浸洗二次， 每次5min；

（3）制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP 液混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液。

（4）玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl荧光素标 记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h，PBS漂洗3 次。

（5）玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒 中反应37℃×30min，PBS漂洗3次。在培养了细胞的玻片上加50-100μlDAB底物， 反应15-25℃×10min，PBS漂洗3次。

（6）封片，将已经处理好的玻片倒扣在滴有甘油PBS混合液的载玻片上，用指 甲油封片，放在显微镜下观察，有凋亡情况的细胞被染色。

统计各小组死亡细胞数量，计算细胞死亡率结果如图1所示。

图1的左边柱形图组为对照处理组（ctrl），右边柱形图组为异氟醚处理组 （isoflurane），具体结果如下：

对照处理组中的无RNA处理小组、miR-214小组、M-mi-214（mi-214类似物）小 组、I-mi-214（mi-214抑制剂）小组、Scramble小组中的细胞死亡率分别为52%、27%、 30%、86%、54%；可以看出，与mi-214抑制剂、Scramble和无RNA处理相比，miR-214 和mi-214类似物可以降低老年痴呆症的神经元细胞（外源性eAβ1-42处理）的死亡率， 说明miR-214具有预防和/或治疗老年痴呆症的作用。

异氟醚处理组中的无RNA处理小组、miR-214小组、M-mi-214（mi-214类似物） 小组、I-mi-214（mi-214抑制剂）小组、Scramble小组中的细胞死亡率分别为75%、 24%、25%、91%、76%；可以看出，异氟醚处理组中的无RNA处理细胞死亡率高于对照 处理组中的无RNA处理小组，说明异氟醚可以促进老年痴呆症的神经元细胞死亡；而 miR-214和mi-214类似物仍然可以降低老年痴呆症的神经元细胞（外源性eAβ1-42 处理）的死亡率，说明即使在异氟醚的伤害处理下，miR-214仍具有预防和/或治疗老 年痴呆症的作用。

因此，在大鼠神经元中显微注射miR-214或者mimic miR-214(M-miR-214)抵消 了外源性的eAβ1-42处理得到老年痴呆症的神经元细胞模型在异氟醚处理引起的细 胞死亡。

2、iAβ1-42处理老年痴呆症的神经元细胞模型进行异氟醚处理

1）方法

分为异氟醚处理组和对照处理组：

A、异氟醚处理组（isoflurane）：将iAβ1-42处理老年痴呆症的神经元细胞中加 入终浓度为0.5%（异氟醚占细胞培养液的体积百分含量）异氟醚(Guoyao Group, Beijing,China)后，在5%CO₂、37度培养3h得到异氟醚处理组细胞；将异氟醚处理 组细胞再进行如下5个小组处理：

无RNA处理小组：不经过任何处理的异氟醚处理组细胞37度5%CO₂培养；

miR-214小组：将终浓度10nM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50个异氟 醚处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

M-mi-214（mi-214类似物）小组：将终浓度10nM的M-mi-214溶液按照25fL/cell 注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

I-mi-214（mi-214抑制剂）小组：将终浓度10nM的I-mi-214溶液按照25fL/cell 注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

Scramble小组：将终浓度10nM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50个异 氟醚处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

B、对照处理组：将eAβ1-42处理老年痴呆症的神经元细胞5%CO₂，37度培养3h 得到对照处理组细胞；再将对照处理组细胞进行如下5个小组处理：

无RNA处理小组：不经过任何处理的对照处理组细胞在37度5%CO₂培养；

miR-214小组：将终浓度10nM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50个对照 处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

M-mi-214（mi-214类似物）小组：将终浓度10nM的M-mi-214溶液按照25fL/cell 注射到50个对照处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

I-mi-214（mi-214抑制剂）小组：将终浓度10nM的I-mi-214溶液按照25fL/cell 注射到50个对照处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

Scramble小组：将终浓度10nM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50个对 照处理组细胞中，37度5%CO₂培养；

2)细胞死亡率检测

（1）上述各小组培养24h时间后，取培养在玻片上的细胞，4%多聚甲醛固定25min， PBS浸洗二次，每次5min；

（2）将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100中处理15min，PBS浸洗二次， 每次5min；

（3）制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP液 混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液。

（4）玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl荧光素标记 的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h，PBS漂洗3次。

（5）玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中 反应37℃×30min，PBS漂洗3次。在培养了细胞的玻片上加50-100μlDAB底物，反 应15-25℃×10min，PBS漂洗3次。

（6）封片，将已经处理好的玻片倒扣在滴有甘油PBS混合液的载玻片上，用指甲 油封片，放在显微镜下观察，有凋亡情况的细胞被染色。

统计各小组死亡细胞数量，计算细胞死亡率结果如图2所示。

图2的左边柱形图组为对照处理组（ctrl），右边柱形图组为异氟醚处理组 （isoflurane），具体结果如下：

对照处理组中的无RNA处理小组、miR-214小组、M-mi-214（mi-214类似物）小 组、I-mi-214（mi-214抑制剂）小组、Scramble小组中的细胞死亡率分别为51%、22%、 36%、89%、51%；可以看出，与mi-214抑制剂、Scramble和无RNA处理相比，miR-214 和mi-214类似物可以降低老年痴呆症的神经元细胞（内源性iAβ1-42处理）的死亡 率，且miR-214更好的降低细胞死亡率，说明miR-214具有预防和/或治疗老年痴呆症 的作用。

异氟醚处理组中的无RNA处理小组、miR-214小组、M-mi-214（mi-214类似物） 小组、I-mi-214（mi-214抑制剂）小组、Scramble小组中的细胞死亡率分别为80%、 24%、34%、90%、74%；可以看出，异氟醚处理组中的无RNA处理细胞死亡率高于对照 处理组中的无RNA处理小组，说明异氟醚可以促进老年痴呆症的神经元细胞死亡；而 miR-214和mi-214类似物仍然可以降低老年痴呆症的神经元细胞（内源性iAβ1-42 处理）的死亡率，说明即使在异氟醚的伤害处理下，miR-214仍具有预防和/或治疗老 年痴呆症的作用。

因此，在大鼠神经元中显微注射miR-214或者mimic miR-214(M-miR-214)抵消 了内源性的iAβ1-42处理得到老年痴呆症的神经元细胞模型在异氟醚处理引起的细 胞死亡。