用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法

摘要

本发明涉及一种用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法，通过在传统的DNA电化学传感器设计基础上，通过引入一个独特的附加DNA探针，起到了DNA单链检测的信号增强效应，并可以进一步应用到基于核酸适体的蛋白质电化学传感器中。本发明可以解决传统的用于DNA单链与特异蛋白质分子检测的电化学传感器件所固有的检测灵敏度低、前处理过程繁琐、检测底限浓度高的缺点，在DNA电化学传感器领域中具有很好的推广价值。

说明书

【技术领域】

本发明涉及分析检测技术，尤其涉及一种用于DNA单链与蛋白分子检测的电化学传感器。

【背景技术】

近年来由于在疾病早期诊断、生物标志物的快速准确检测以及环境监测等领域的快速发展的需求，越来越多的可用于DNA以及特异蛋白质分子检测的生物传感器件受到人们关注。其中电化学传感器由于制作成本低、快速检测以及便携性等优点，逐渐成为研究开发者关注的热点，也被认为是最具有应用价值的DNA以及特异蛋白质分子高灵敏检测方法之一。在电化学传感器的研发过程中，检测灵敏度的提高是最核心的关键问题。而传统的电化学传感器的构建方法依然存在信号值和检测灵敏度较低、检测低限浓度较高的缺点，从而限制了电化学传感器在DNA以及特异蛋白质分子检测中的应用。

【发明内容】

基于此，本发明提供一种可用于DNA单链与特异蛋白质分子检测的电化学传感器，以解决传统电化学传感器信号值较低、灵敏度较低以及检测低限浓度较高的缺点。

一种用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法，包括如下步骤：

提供一金盘电极，并对所述金盘电极进行预处理；

将预处理后的所述金盘电极在pH 7.4的浓度为200mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中与0.5μM的捕获探针和5.0μM的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，反应温度为37℃，持续时间为16小时；

将上述处理后的含有捕获探针在pH 7.4的浓度为200mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中与0.5μM的附加探针和5.0μM的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，反应温度为37℃，持续时间为16小时；

将含有捕获探针和附加探针的金盘电极用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液清洗后，再在pH 7.4的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中与6-巯基乙醇反应，温度为30℃，反应时间为2小时；

随后清洗所述金盘电极，并将所述金盘电极与0.5μM的报告探针在杂交缓冲溶液中反应，温度为40℃，反应时间为4小时，得到所述电化学传感器；其中，所述杂交缓冲溶液为50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、100mM氯化钠与质量浓度0.1％的吐温20的混合液，所述杂交缓冲液的pH为7.4。

优选的，所述捕获探针的DNA序列为：5′-HS-(CH₂)₆-AGA CAA GGA AAATCC TTC CCC CCC CTG AAG TGG GTC GAA AA-3′或者5′-HS-(CH₂)₆-AGACAA GGA AAA TCC TTC CCC CCC CGG TTG GTG TGG TTG G-3′。

优选的，所述附加探针的DNA序列为：5′-AAT GAA GTG GGT CG-(CH₂)₃-SH-3′或5′-GGT TGG TGT GGT TGG-(CH₂)₃-SH-3′。

优选的，所述报告探针的DNA序列为：5′-(CH₂)₆-MB-CGA CCC ACT TCATTC CCC CCT TGA AGG ATT TTC CTT GTC T-3′或5′-(CH₂)₆-MB-CCA ACCACA CCA ACC CCC CCC CCT TGA AGG ATT TTC CTT GTC T-3′。

进一步优选的，所述捕获探针的DNA序列为：5′-HS-(CH₂)₆-AGA CAA GGAAAA TCC TTC CCC CCC CTG AAG TGG GTC GAA AA-3′；

所述附加探针的DNA序列为：5′-AAT GAA GTG GGT CG-(CH₂)₃-SH-3′；

所述报告探针的DNA序列为：5′-(CH₂)₆-MB-CGA CCC ACT TCA TTC CCCCCT TGA AGG ATT TTC CTT GTC T-3′。

进一步优选的，所述捕获探针的DNA序列为：5′-HS-(CH₂)₆-AGA CAA GGAAAA TCC TTC CCC CCC CGG TTG GTG TGG TTG G-3′；

所述附加探针的DNA序列为：5′-GGT TGG TGT GGT TGG-(CH₂)₃-SH-3′；

所述报告探针的DNA序列为：5′-(CH₂)₆-MB-CCA ACC ACA CCA ACC CCCCCC CCT TGA AGG ATT TTC CTT GTC T-3′。

优选的，金盘电极进行预处理包括如下步骤：取直径为2.0毫米的金盘电极，先后用粒径大小分别为1.0毫米、0.3毫米、0.05毫米的三氧化二铝粉体打磨抛光，随后将金盘电极依次在二次水、乙醇、丙酮中超声清洗多次；清洗后的金盘电极先后放入0.5M氢氧化钠溶液、0.5M硫酸溶液中进行电化学循环扫描后，用二次水清洗多次，随后将金盘电极用高纯氮气吹干。

通过电化学标记物修饰的报告探针和固定于金电极表面的捕获探针形成双链结构，引入的目标检测物可与捕获探针结合，使报告探针末端部分处于半游离状态，并且巧妙的在金电极表面引入一种独特的可以和报告探针末端部分结合的附加探针，使产生的电化学信号得到增强，从而提高了检测灵敏度。

本发明与传统的用于DNA单链与特异蛋白质分子检测的电化学传感器相比，具有信号增强、灵敏度高以及检测低限浓度低的优点，并且具有很好的推广使用价值。

【附图说明】

图1为实施例1中引入附加探针的电化学传感器的构建及检测流程示意图；

图2为引入和未引入附加探针的电化学传感器对目标检测物的响应信号对比，其中a为空白信号，b为未引入附件探针得到的信号，c为引入附加探针后得到的信号；

图3A～图3D为引入和引入附加探针的电化学传感器对不同浓度的目标检测物的信号对比，其中图3A为未引入附加探针的电化学传感器对浓度分别为0(a)，0.04nM(b)，0.2nM(c)，1nM(d)，and 2nM(e)的目标检测物的响应信号；图3B为引入附加探针的电化学传感器对浓度分别为0(a)，0.04nM(b)，0.2nM(c)，1nM(d)，and 2nM(e)的目标检测物的响应信号；图3C为未引入附加探针的电化学传感器对不同浓度的目标检测物的线性响应曲线；图3D为引入附加探针的电化学传感器对不同浓度的目标检测物的线性响应曲线；

图4为实施例2中用于蛋白质分子凝血酶的电化学传感器构建及检测流程示意图；

图5为引入和引入附加探针的电化学传感器对凝血酶的响应信号对比，其中a为空白信号，b为未引入附件探针得到的信号，c为引入附加探针后得到的信号；

图6为引入附加探针的电化学传感器对不同浓度凝血酶的线性响应曲线。

【具体实施方式】

下面主要结合附图及具体实施例对用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法作进一步详细的说明。

实施例1

如图1所示，取直径为2.0毫米的金盘电极110一支，先后用粒径大小分别为1.0毫米、0.3毫米、0.05毫米的三氧化二铝粉体打磨抛光，随后将金盘电极110依次在二次水、乙醇、丙酮中超声清洗多次。清洗后的金盘电极110先后放入0.5M氢氧化钠溶液、0.5M硫酸溶液中进行电化学循环扫描后，用二次水清洗多次，随后将金盘电极110用高纯氮气吹干。处理后的金盘电极110在pH 7.4的浓度为200mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(以下简称Tris-HCl)中与0.5μM的捕获探针120和5.0μM的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，反应温度为37℃，持续时间为16小时，其中捕获探针120的DNA序列为：5′-HS-(CH₂)₆-AGA CAAGGA AAA TCC TTC CCC CCC CTG AAG TGG GTC GAA AA-3′。在同样的缓冲溶液和反应条件下，将金盘电极110进一步与0.5μM的附加探针130反应，附加探针130的DNA序列为：5′-AAT GAA GTG GGT CG-(CH₂)₃-SH-3′。将捕获探针120和附加探针130共同修饰的金盘电极110用Tris-HCl缓冲溶液清洗后，进一步在pH 7.4的10mM Tris-HCl缓冲溶液中与6-巯基乙醇反应，温度为30℃，反应时间为2小时。随后用二次水清洗，将金盘电极110与0.5μM的报告探针140在杂交缓冲溶液(含50mM Tris-HCl，100mM氯化钠，0.1％的吐温20，pH 7.4)中反应，温度为40℃，反应时间为4小时，其中报告探针140的DNA序列为：5′-(CH₂)₆-MB-CGA CCC ACT TCA TTC CCC CCT TGA AGG ATT TTC CTT GTC T-3′。修饰后的金盘电极110用Tris-HCl清洗多次，从而得到电化学传感器。

选取DNA序列为5′-TTT TCG ACC CAC TTC A-3′的DNA单链作为目标检测物150，分别以不同的浓度在杂交缓冲溶液中与金盘电极反应5小时，温度为45℃。随后用Tris-HCl进行清洗后，进行电化学检测。电化学检测在型号为CHI660D的电化学工作上进行，交变频率为15Hz，采集方波伏安电化学信号；采取修饰后的金盘电极110为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极(Ag/AgCl电极)为参比电极，并以含有10mM的磷酸缓冲溶液和100mM的氯化钠溶液作为支持电解液，从而构成典型的三电极系统。

实验结果表明：如图2和图3所示，附加探针130的引入对目标检测物的电化学信号有明显的增强效应，相对于未引入附加探针130而得到的电化学信号提高了3.2倍(相对于空白样品的信号增强值)；图3进一步表明未引入和引入附加电极130对检测信号与检测灵敏度的差别，证明了附加电极130对检测灵敏度的增强效应。图3D表明引入附加探针130的电化学传感器对目标检测物150的检测底限浓度为2.0pM。因此，附加探针130的引入可以实现对电化学传感器的信号增强效应，从而提高了检测灵敏度。

实施例2

如图4所示，金盘电极210的预处理过程与实施例1相同。处理后的金盘电极210在pH 7.4浓度为200mM的Tris-HCl缓冲溶液中与0.5μM的捕获探针220和5.0μM的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，反应温度为37℃，持续时间为16小时，其中捕获探针220为凝血酶的核酸适体序列：5′-HS-(CH₂)₆-AGACAA GGA AAA TCC TTC CCC CCC CGG TTG GTG TGG TTG G-3′。在同样的缓冲溶液和反应条件下，将金盘电极210进一步与0.5μM的附加探针230反应，附加探针230的DNA序列为：5′-GGT TGG TGT GGT TGG-(CH₂)₃-SH-3′。将捕获探针220和附加探针230共同修饰的金盘电极210用Tris-HCl缓冲溶液清洗后，进一步在pH 7.4的10mM的Tris-HCl缓冲溶液中与6-巯基乙醇反应，温度为30℃，反应时间为2小时。随后用二次水清洗，将金盘电极210与0.5μM的报告探针240在杂交缓冲溶液(含50mM Tris-HCl，100mM氯化钠，0.1％的吐温20，pH 7.4)中反应，温度为40℃，反应时间为4小时，其中报告探针240的DNA序列为：5′-(CH₂)₆-MB-CCA ACC ACA CCA ACC CCC CCC CCT TGAAGG ATT TTC CTT GTC T-3′。修饰后的金盘电极210用Tris-HCl清洗多次，从而得到电化学传感器。制作过程原理如图4所示。

选取凝血酶作为蛋白质分子目标检测物250，分别以不同的浓度在杂交缓冲溶液中与金盘电极210反应3小时，温度为28℃。随后用Tris-HCl进行清洗后，进行电化学检测，电化学检测方法与采取的三电极系统与实施例1相同。

实验结果表明，如图5所示，附加探针230的引入对凝血酶的检测具有明显的信号增强效应，提高了其检测灵敏度，相对于未引入附加探针230得到的电化学信号提高了2.0倍(相对于空白样品的信号增强值)；图6表明引入附加探针230的电化学传感器对不同浓度的凝血酶检测有很好的线性响应，检测底限浓度为20.0pM。因此，这种信号增强型电化学传感器的构建方法可用于蛋白质分子的高灵敏度检测。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。