烟草及烟草制品中三种苯氧羧酸类农药残留量的测定方法

摘要

一种烟草及烟草制品中三种苯氧羧酸类农药残留量的测定方法，其特征在于：用乙腈对样品进行浸提，再加入无水硫酸镁与氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸二氢钠振荡促使其分层，随后进行分散固相萃取，以液相色谱-串联质谱直接测定烟草及烟草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏农药残留量。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件，与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：本发明方法样品前处理过程简单、快速，无需衍生化，并具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

说明书

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品中农药残留的理化检验技术领域，主要涉及烟草及烟草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏等三种氯苯氧羧酸类农药残留量的测定技术。

背景技术

烟草作为吸食品，其农药残留量问题已成为吸烟安全性问题中的重要组成部分，烟草及烟草制品农药残留量指标是各国在烟草制品质量控制中的重要内容，已成为国际市场烟叶评价和选购的重要因素，也是烟草国际贸易中进行商品检验的重要内容。苯氧乙酸类物质是最早研制出来并投入使用的除草剂。由于其价格低廉、除草速度较快、除草谱较宽等优点，在生产中一直发挥重要作用，广泛用于小麦、玉米和水稻田防除阔叶杂草。然而，该类除草剂对作物的安全性受环境条件、作物生育期的影响较大，应用不当可能会产生较重的药害；同时，该类除草剂对阔叶作物敏感、飘移和挥发性强，易于对周围阔叶作物发生药害。在使用过程中，发现对人、畜有一定的内分泌扰乱作用，随着该类除草剂使用量及使用范围的日益增大，其在作物中的残留及对人类健康和环境造成的危害也越来越为人们所关注。研究和发展针对这类农药残留物的检测技术，是国际上关注的课题。我国和其他各国都制定了严格的残留限量,  如日本规定 2, 4, 5-涕不得检出, 国际食品法典委员会，日本等制定的2, 4-滴在大多农产品中的限量为0.05 mg/kg。CORESTA农用化学品咨询委员会(ACAC)在2008年制定的118种农用化学品指导性残留限量表中将麦草畏、2,4-滴和2,4,5-涕等有机氯除草剂农药的限量分别定为0.20 mg/kg，0.20 mg/kg和0.05 mg/kg，目前我国烟草行业还没有制定烟草有机氯除草剂残留的限量标准。由于此类化合物极性较大、稳定性差、不易气化，需用重氮甲烷或三氟化硼丁醇衍生后才能用气相色谱或气质联用法进行测定。YC/T 181-2004【中华人民共和国烟草行业标准 YC/T 181－2004 烟草及烟草制品有机氯除草剂农药残留量的测定 气相色谱法】规定了烟草及烟草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏等3种氯苯氧羧酸类农药的测定方法，为该类农药残留量的检测提供了分析依据，但该法是经过衍生化后用气相色谱法测定。衍生化试剂重氮甲烷和三氟化硼丁醇毒性较强，且整个操作步骤较繁琐、分析成本较高、单个样品的检测周期较长。未见烟草中此类农药检测的其它文献报道。

关于对于土壤、水、大米、水稻和纺织品中苯氧羧酸类残留测定的报道较多，而且苯氧羧酸类除草剂多残留分析的报道多采用气相色谱或气质联用测定。液相色谱-串联质谱法测定烟草中的苯氧乙酸类除草剂未见报道。本实验采用高效液相色谱-串联质谱对烟草中3种苯氧羧酸类除草剂残留进行分析，并对样品提取和分离等条件进行了研究，建立了测定烟草中3种苯氧羧酸类除草剂多残留的分析方法，方法简便、快速、净化效果较好, 各项技术指标均符合残留检测的要求。

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种采用基质分散固相萃取烟草及烟草制品中农药残留，无需衍生化等繁琐过程，直接以液相色谱-串联质谱测定烟草及烟草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏等三种苯氧羧酸类农药残留量的测定方法，该方法能快速、准确检测烟草及烟草制品中三种苯氧羧酸类农药残留量，测定结果准确、测定干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种烟草及烟草制品中三种苯氧羧酸类农药残留量的测定方法，用乙腈对样品进行浸提，再加入无水硫酸镁和氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸二氢钠振荡促使其分层，随后进行分散固相萃取，以液相色谱-串联质谱直接测定烟草及烟草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏农药残留量。具体步骤如下：

a、样品的提取：准确称取2 g样品（精确至0.01 g）于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡直至样品被水充分浸润；静置10 min后移取10 mL乙腈至离心管中，加入200μL乙酸，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000 rpm 速率振荡1 min；将离心管置于-18 ℃条件下保持10 min，然后向离心管中加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸二氢钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000 rpm速率振荡2 min，然后以4000 rpm速率离心10 min；

b、样品净化：移取上清液1.0 mL于1.5 mL离心管中，加入150 mg无水硫酸镁及25 mg PSA吸附剂，于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm速率振荡2 min，以6000 rpm 速率离心2 min；吸取上清液经0.45μm有机相滤膜过滤，移取200 μL，加入800μL乙腈，用LC-MS/MS检测；

c、标准工作溶液制备：分别称取0.01g三种农药(2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏)标准品到不同的10mL容量瓶中，用乙腈稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的标准工作溶液；分别移取上述标准工作溶液200μL和200μL空白样品提取溶液，然后加入600μL乙腈，配制成基质混合标准工作溶液； 

d、液相色谱-串联质谱测定:吸取以上配制好的不同浓度的农药标准工作溶液，注入液相色谱-串联质谱仪；

e、农药残留量测定结果的计算

以外标法进行农药残留量的定量分析，即以农药的色谱峰面积与对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.999,对提取后的样品进行测定，测得检出农药的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中的2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏等农药的残留量。

所述标准工作溶液的配制方式如下：分别称取0.01 g 2,4-滴、2,4,5-涕和麦草畏三种农药标准品至不同的10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，制得1.0 mg/mL的标准储备液；分别移取以上三种农药单一标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度；配得混合标准储备液（10μg /mL）；分别移取混合标准储备液25μL, 50μL, 100μL, 250μL , 500μL 及1000μL到6个10 mL容量瓶中，用乙腈定容；各标准工作溶液的浓度分别为0.025μg/mL, 0.05μg/mL, 0.1μg/mL, 0.25μg/mL, 0.5μg/mL, 1.0μg/mL；分别移取上述标准工作溶液200μL和200μL空白样品提取溶液混合，并加入600μL乙腈；各溶液浓度分别为0.005μg/mL, 0.01μg/mL, 0.02μg/mL, 0.05μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2μg/mL。

采用的液相色谱条件为：色谱柱：Atiantis dC18 (150 mm×2.1 mm，3 um, 美国Waters公司)；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水（含0.1 %甲酸)，等度洗脱，流动相A和流动相B比例为50∶50，流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5μL；采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描; 电喷雾离子源(ESI); 雾化气流量为60 psi; 气帘气流量18 psi; 辅助加热气流量为60 psi; 离子化温度500 ℃; 碰撞气流量为10 psi; 4种气体均为氮气; 停留时间为100 msec; 电离电压5500 V, 负离子MRM模式采集。MRM参数见表1。

表1 质谱条件

*定量离子

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件，与现有技术相比具有如下优良效果：

⑴本发明方法样品前处理过程简单，大大缩短了每个烟草样品的萃取前处理时间。行业标准《YC/T 181-2004烟草及烟草制品 有机氯除草剂农药残留量的测定 气相色谱法》，该标准方法采用二氯甲烷萃取，以三甲基亲氧化硫溶液甲酯衍生化，气相色谱-质谱测定，其前处理过程复杂费时，不利于高通量样品快速检测。

本发明方法将烟末用乙腈进行浸提，再加无水硫酸镁、氯化钠等促使其分层，最后取萃取液进行分散固相萃取。该方法提高萃取效率，又能对烟草中的色素及烟草植物组织的其他共萃物（脂肪酸、叶绿素等）起到较好的吸附净化作用，避免了样品浓缩、净化、衍生等过程造成的待测农药组分损失，又使实验操作更加简单、快捷。

⑵ 行业标准《YC/T 181-2004烟草及烟草制品 有机氯除草剂农药残留量的测定 气相色谱法》使用的衍生化试剂对人体健康有害，从而限制了它们的使用；本发明无需衍生化从而使前处理过程变得比较简单。

（3）本发明方法具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

①    本发明方法的检测限：

将不同浓度的2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏农药标准工作溶液注入LC-MS/MS，以3倍信噪比（S/N = 3）计算检测限（LOD），检测限在0.007μg/g-0.02μg/g之间。

②    本发明方法的重复性和加标回收率：

在烟草样品中加入2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏农药的标准溶液，然后进行前处理和LC－MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表2。由表2可以看出，三种农药的回收率在95％－110.0％之间，平均相对标准偏差（RSD）小于8%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

 

表2    三种苯氧羧酸类农药的回收率和重复性（n=6）

附图说明

图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．仪器与试剂：

农药：2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏，均为标准品；乙腈、乙酸均为农残级。

API 4000四极杆串联质谱仪；涡旋振荡仪(美国Labnet公司)；Sigma 3-30K离心机(德国Sigma公司)；AE 163电子天平（感量：0.0001g）和AE 166电子天平（感量：0.01g）（瑞士Mettler公司）。

2．样品处理：

准确称取2 g样品（精确至0.01 g）于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡直至样品被水充分浸润。静置10 min后移取10 mL乙腈至离心管中，加入200μL乙酸，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000 rpm 速率振荡1 min。将离心管置于-18 ℃条件下保持10 min，然后向离心管中加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸二氢钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000 rpm速率振荡2 min，然后以4000 rpm速率离心10 min。

移取上清液1.0 mL于1.5 mL离心管中，加入150 mg无水硫酸镁及25 mg PSA吸附剂，于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm速率振荡2 min，以6000 rpm 速率离心2 min。吸取上清液经0.45μm有机相滤膜过滤，移取200μL，然后加入800μL乙腈，用LC-MS/MS检测。

3.准备标准工作溶液：分别称取0.01 g三种农药（2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏）标准品（精确至0.0001 g）至不同的10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，制得1.0 mg/mL的标准储备液。然后分别移取以上三种农药单一标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度。配得10μg/mL的混合标准储备液。分别移取一定体积的混合储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，即配制成不同浓度的农药标准工作溶液，标准序列：0.025μg/mL, 0.05μg/mL, 0.1μg/mL, 0.25μg/mL, 0.5μg/mL, 1.0μg/mL。分别移取上述标准工作溶液200μL和200μL空白样品提取溶液混合，然后加入600μL乙腈。分别对这些标准溶液进行LC-MS/MS分析。 

4.测定方法: 将配制好的不同浓度的农药标准工作溶液注入LC-MS/MS，并对各标样峰面积（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线。对提取后的样品待测液进行测定，测得农药的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中的2,4-滴和2,4,5-涕含量分别为0.09μg/g和0.12μg/g。

采用的LC-MS/MS条件为：色谱柱：Atiantis dC18 (150 mm×2.1 mm，3 um, 美国Waters公司)；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水（含0.1 %甲酸)，等度洗脱，流动相A和流动相B比例为50∶50，流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5μL。扫描方式：负离子扫描; 电喷雾离子源(ESI); 雾化气流量为60 psi; 气帘气流量18 psi; 辅助加热气流量为60 psi; 离子化温度500 ℃; 碰撞气流量为10 psi; 4种气体均为氮气; 停留时间为100 msec; 电离电压5500 V, 负离子MRM模式采集，MRM参数见表1。

为判断方法的准确性，在此样品中加入0.1μg/g的2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏标准溶液，进行同上的样品前处理，以LC-MS/MS测得2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏选择离子峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏含量分别为0.18μg/g，0.20μg/g和0.09μg/g，即2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏的加标回收率为94.7％，90.9% 和90.0％，说明此方法是准确的。

实例2： 按照实例1所述方法，选择另一烟叶样品，测得样品中2,4滴和麦草畏的残留量分别为0.12μg/g和0.18μg/g。

实例3：按照实例1所述方法，选择另一烟叶样品，测得样品中2,4,5-涕含量为0.22μg/g。