一种能够分泌荧光铁载体的铜绿假单胞菌及其应用

摘要

本发明涉及微生物材料在环境污染物检测中的应用，具体讲是一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1分泌的荧光铁载体及其应用。铜绿假单胞菌PA1，该菌株已在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2011年04月28日；编号为CGMCC No.4799。利用本发明中涉及的铜绿假单胞菌PA1分泌的荧光铁载体检测环境中的呋喃唑酮，具有特异性高、快速等优点，在优化实验条件基础上，可以实现对呋喃唑酮的快速、灵敏检测。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物材料在环境污染物检测中的应用，具体讲是一种能够分泌荧光铁载体的铜绿假单胞菌及其应用。

背景技术

呋喃唑酮又名痢特灵，分子式为C₈H₇N₃O₅，是一种人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物。由于呋喃唑酮具有价格便宜、药效快等优点，常用来预防和控制霍乱、球虫病、猪肠炎和火鸡黑头病等因细菌和原生物引起的感染，在水产养殖中也有一定的应用。然而研究表明，呋喃唑酮可使实验动物发生基因突变并诱发癌变。呋喃唑酮在水产养殖环境中的残留导致鱼虾类的慢性中毒，严重危及鱼类的健康养殖。目前国际上已经将呋喃唑酮列为违禁药物，我国的农业部文件农牧发[2002]1号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出，并颁布了禁止使用该类兽药的禁令。目前，呋喃唑酮主要的检测方法为高效液相色谱。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够分泌荧光铁载体的铜绿假单胞菌及其应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种能够分泌荧光铁载体的铜绿假单胞菌：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1，该菌株已在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2011年04月28日；编号为CGMCC No.4799。

能够分泌荧光铁载体的铜绿假单胞菌的应用，利用铜绿假单胞菌分泌的荧光铁载体检测呋喃唑酮。

所述铜绿假单胞菌分泌的荧光铁载体的产生及纯化过程为：

1)PA1培养：将铜绿假单胞菌培养在无机盐加丁二酸培养基中，培养温度为28～30℃，培养转速180～200rpm/min，培养时间为48-72h；

2)荧光铁载体的纯化：将上述培养物以10,000  13,000rpm的转速下离心5-10min，取上清，将上清液中加入2倍于上清液体积的结合缓冲液，然后将此混合溶液加入到铜离子螯合色谱柱中进行亲和层析，洗脱下组分，即为荧光铁载体。

所述无机盐加丁二酸培养基成分为每升水中加入磷酸氢二钾6.0g，磷酸二氢钾3.0g，硫酸铵1.0g，七水硫酸镁0.1g和丁二酸4.0g。

所述结合缓冲液为0.02M磷酸钠和1M氯化钠，pH 7.2。所述的洗脱缓冲液的成分为0.02M磷酸钠，0.5M氯化钠，0.05M EDTA，pH 7.2。

荧光铁载体的纯化过程为：将混入了结合缓冲液的上清液加入到铜离子螯合色谱柱中，然后加入5-10倍体积的结合缓冲液进行洗涤，使荧光铁载体结合到铜离子螯合的色谱柱上。最后加入2-5倍体积的洗脱缓冲液进行洗脱，即可得到较纯的荧光铁载体。

本发明提供一种能够在特定条件下分泌荧光铁载体的菌株PA1，该菌株是从烟台海岸带水域中分离得到。主要分离方法是将采集到的海水进行浓缩，然后涂布到无机盐加丁二酸培养基中28℃培养48h，挑选具有荧光特性的菌落。该菌落经16S rDNA鉴定为铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1于2011年04月28日被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，编号为CGMCC No.4799。该菌在平板上培养边缘不齐，扁平湿润。该菌在特定的培养基中培养，如上述的无机盐加丁二酸培养基，能够分泌黄绿色的荧光色素。

在含有荧光铁载体的HEPES缓冲体系中加入呋喃唑酮，并混合均匀。通过肉眼在紫外灯下观察该混合物荧光变化或是通过在荧光光谱仪中测定荧光强度。

本发明所具有的优点：本发明通过有效地分离铜绿假单胞菌PA1产生的荧光铁载体，检测环境中的呋喃唑酮。细菌培养简单，分离步骤简单，反应具有特异性高、速度快等优点。

附图说明

图1为本发明实施例分离的铜绿假单胞菌PA1的16S rDNA。

图2为本发明实施例提供的铜绿假单胞菌PA1分泌的荧光铁载体在渔药作用下，肉眼观察到的荧光的变化。其中B3为含有50ppm的呋喃唑酮，而其他孔为含有50ppm的其他渔药，包括DDT(A1)、敌百虫(A2)、磺胺嘧啶(A3)、磺胺多辛(A4)、磺胺噻唑(A5)、磺胺甲基嘧啶(B1)、磺胺二甲基嘧(B2)、呋喃唑酮(B3)、六六六(B4)、多菌灵(B5)、己烯雌酚(C1)、二嗪农(C2)、乙基溴硫磷(C3)、甲基溴硫磷(C4)、未加渔药的对照(C5)。

图3为本发明实施例提供的铜绿假单胞菌PA1分泌的荧光铁载体在渔药作用下，利用荧光光谱仪测定的荧光特性的变化。

具体实施方式

实施例1：铜绿假单胞菌PA1的16S rDNA的获取

收集处于稳定期的铜绿假单胞菌PA1，提取该菌的基因组DNA。具体步骤为：

(1)30℃过夜培养的PA1菌株按1％的体积比接种到含有10mL LB培养基的试管中，待细菌的OD₆₀₀≈1.0左右时，取1mL菌液于1.5mL离心管中10,000g离心1min收集菌体。

(2)在上述所得菌体中加1mL 0.9％NaCl洗涤沉淀，10,000g离心3min。

(3)弃上清，450μL TE缓冲液(12mM Tris-HCl，12mM EDTA，pH 8.0)重新悬浮沉淀，而后加入50μL 20％的SDS，轻轻的上下颠倒离心管使之混匀，75℃水浴中放置5min，至菌液裂解变澄清。

(4)向菌液中加500μL的苯酚-氯仿(体积比3∶1)抽提，轻轻颠倒使之混匀，室温静置5min后10,000g离心5min。

(5)将上清转移至一新的1.5mL离心管并用TE缓冲液补足体积到500μL，加500μL的苯酚-氯仿(体积比3∶1)，混匀室温静置5min后10,000g离心5min。再将上清转移至一新的离心管中，如此反复，直至看不到中间的蛋白质层为止。

(6)上清转移至一新的1.5ml离心管并用TE缓冲液补足体积到500μL，加500μL氯仿，轻轻混匀后10,000g离心5min。

(7)上清转移至一新的1.5mL离心管，加上清液1/10体积的3M NaAc混匀，然后加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒几次，此时应看到有絮状沉淀产生，而后以10,000g离心5min。

(8)弃上清，加入1mL 70％的乙醇洗涤沉淀，10,000g离心5min，尽量吸干液体，室温干燥约10min。(9)加入50μL含有终浓度为10-20mg/mL RNaseA的TE缓冲液溶解DNA。

利用8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACG ACTT)为引物，提取的PA1基因组DNA为模板，PCR扩增其16S rDNA并进行鉴定。PCR的条件为94℃变性4min，94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，从第二步开始，30个循环。PCR产物由北京诺赛基因进行测序。DNA测序片段见图1。该序列已经提交到美国国家生物技术信息中心(NCBI)，序列号为JF894117。

实施例2：荧光铁载体的纯化

(1)PA1培养：从平板上选取一环铜绿假单胞菌PA1菌落接入无机盐加丁二酸培养基，摇瓶装液量30％，培养温度为28～30℃，培养转速180～200rpm/min，培养时间为48h。所述无机盐加丁二酸培养基成分为每升水中加入磷酸氢二钾6.0g，磷酸二氢钾3.0g，硫酸铵1.0g，七水硫酸镁0.1g和丁二酸4.0g。

(2)荧光铁载体的纯化：将培养的细菌在10,000rpm的转速下离心5min，取上清。上清液中加入其2倍体积的结合缓冲液，将加入了结合缓冲液的上清液加入到铜离子螯合色谱柱中，然后加入5-10倍体积的结合缓冲液进行洗涤，使荧光铁载体结合到铜离子螯合的色谱柱上。最后加入2-5倍体积的洗脱缓冲液进行洗脱。即可得到较纯的荧光铁载体。

实施例3：紫外灯下观察呋喃唑酮对荧光铁载体的荧光猝灭作用。

将DDT、敌百虫、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧、呋喃唑酮、六六六、多菌灵、己烯雌酚、二嗪农、乙基溴硫磷、甲基溴硫磷分别加入到含有荧光铁载体的HEPES溶液中，使其终浓度分别为50ppm，反应在96孔板中进行。将含有经过上述处理的混合溶液的96孔板置于紫外灯下(波长为256nm)用肉眼观察荧光的变化。实验结果如图2，发现呋喃唑酮的加入能够较快地引起荧光铁载体的荧光猝灭，而其他的农药加入则未影响该荧光铁载体的荧光强度，由此可以认为50ppm的呋喃唑酮的加入能够特异地引起荧光铁载体的荧光猝灭。

实施例4：利用荧光光谱仪测定呋喃唑酮对荧光铁载体的荧光猝灭作用。

将敌百虫、多菌灵、呋喃唑酮、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、甲基溴硫磷、二嗪农、乙基溴硫磷分别加入到含有纯化的荧光铁载体溶液的HEPES溶液中，使各种渔药的终浓度分别为50ppm。将此混合液在荧光光谱仪中测定其荧光强度的变化。实验结果如图3，发现呋喃唑酮的加入能够猝灭80％的荧光，而其他农药的加入则基本上未影响该荧光铁载体的荧光强度，由此可以认为50ppm的呋喃唑酮的加入能够特异性地将80％的荧光铁载体产生的荧光猝灭。