家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性的分子检测方法

摘要

本发明提供一种家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性分子检测方法及试剂盒，所述方法包括以下步骤：单头家蝇基因组DNA的提取；家蝇CYP6D1v1抗性等位基因的分子检测；所述试剂盒包括：单头家蝇基因组DNA提取的试剂；及家蝇CYP6D1v1抗性等位基因分子检测的试剂。本发明的方法需要生物材料少；对材料的要求低；可以区分种群的杂/纯合状态：有利预测种群抗性基因频率的变化趋势，便于抗性的早期诊断；快速、准确。

说明书

技术领域

本发明涉及家蝇对拟除虫菊酯类代谢抗性的分子检测方法，适合用于家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂由CYP6D1v1介导的代谢抗性的快速检测，属于生物技术领域。

背景技术

家蝇(Musca domestica)是一种重要的疾病传媒，据报道它可以传播100多种人畜疾病。家蝇也是重要的畜牧业害虫，家蝇的发生可以导致畜禽产品产量和质量的降低。因此家蝇种群的控制对于人类的健康和国民经济的发展都具有十分重要的意义。家蝇的防治长期以来主要依赖化学农药，抗药性问题突出。抗药性导致杀虫剂杀虫效率的下降，由此引发诸如杀虫剂使用次数和剂量增加，虫媒人畜疾病的流行等问题已给人类带来巨大损失。

拟除虫菊酯杀虫剂(如溴氰菊酯)已广泛用于家蝇的防治，家蝇对这类杀虫剂普遍产生了抗性。抗药性的检测是科学制定有效的防治措施的前提，对减少化学药剂对环境的污染和合理制定抗药性治理具有重要的指导意义。家蝇对拟除虫菊酯类的抗性的检测常采用生物测定，这种方法存在如下缺点：(1)试验周期长：一般需要24小时以上才能得到结果；(2)对试虫的数量和质量要求高：为保证生测结果的准确性，需要使用特定生理状态的试虫；(3)难于检测早期抗性和预测抗性的发展趋势：生物测定的方法只能记录杀虫剂剂量和试虫死亡率的信息，而无法测定个体的基因型。

近年来，随着对家蝇抗药性抗性分子机制的了解，国内外开始尝试家蝇抗性的分子检测技术的研究。研究表明，细胞色素P450介导的代谢解毒作用增强是家蝇对拟除虫菊酯类抗性的主要机制。在高抗性的家蝇品系如美国的LPR品系和中国的BJD品系，抗性都与家蝇的CYP6D1v1等位基因相关联，CYP6D1v1抗性等位基因的序列特点是其5’启动子区存在一段15bp的插入片段。进一步的研究结果表明CYP6D1v1这一等位基因在美国和中国的自然家蝇种群中也普遍存在。

发明内容

因此，本发明的目的是针对目前家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性检测方法的周期长、对试虫的数量和质量要求高，难于检测早期抗性和预测抗性的发展趋势的不足，提供一种高效、快速、对材料要求低、需要生物材料少的家蝇由细胞色素P450 CYP6D1v1介导的对拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性的分子检测方法，从而能够有效杀蝇，减少传染疾病的传播。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性分子检测方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：单头家蝇基因组DNA的提取；

步骤2：家蝇CYP6D1v1抗性等位基因的分子检测。

优选地，所述家蝇CYP6D1v1抗性等位基因的序列如SEQ ID NO：1的序列所示。

优选地，所述步骤2中通过PCR扩增进行CYP6D1v1抗性等位基因分子检测。

优选地，所述PCR扩增中所用的特异引物为：

qxh6d1F：5′-ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3′

qxh6d1R：5′-GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3′。

另一方面，本发明提供一种用于家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性分子检测的试剂盒，所述试剂盒包括：单头家蝇基因组DNA提取的试剂；及家蝇CYP6D1v1抗性等位基因分子检测的试剂。

优选地，所述家蝇CYP6D1v1抗性等位基因的序列如SEQ ID NO：1的序列所示。

优选地，用于对家蝇CYP6D1v1抗性等位基因的分子检测的试剂包括以下特异引物：

qxh6d1F：5′-ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3′

qxh6d1R：5′-GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3′。

再一方面，本发明提供一种用于家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性检测的试剂盒在家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性分子检测中的应用。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明建立的抗性分子检测技术与传统生物测定相比具有如下优点：(1)需要生物材料少，数量在50-200头就可以满足检测要求；(2)对材料的要求低：可以采用任何虫态的试虫，可以用活体，也可以用保存的样品，可以用整头家蝇，也可以用虫体的某一部位(如双翅)；(3)可以区分种群的杂/纯合状态：有利预测种群抗性基因频率的变化趋势，便于抗性的早期诊断；(4)快速：从DNA的提取到PCR产物的检测，数小时就可以完成。

本发明提供了的方法准确性高：运用限制性内切酶对DNA序列设计的特异性，结果的准确性高。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为单头家蝇PCR扩增的试验结果示意图，图中1-6为PCR扩增的样品，M为DNA分子量标记(DNA Marker)；

图2为单头家蝇CYP6D1v1抗性等位基因检测的试验结果示意图，图中SS为敏感纯合子；SR为杂合子；RR为抗性纯合子；M为100bp DNA分子量标记(DNA Marker)；

图3为北京自然种群家蝇样品CYP6D1v1抗性等位基因检测的试验结果示意图，图中1-10为样品，M为100bp DNA分子量标记(DNA Marker)；

图4为吉林长春自然种群家蝇样品CYP6D1v1抗性等位基因检测的试验结果示意图，图中1-10为检测样品，M为100bp DNA分子量标记(DNAMarker)；

图5为山东济南自然种群家蝇样品CYP6D1v1抗性等位基因检测的试验结果示意图，图中1-15为检测样品，M为100bp DNA分子量标记(DNAMarker)。

具体实施方式

实施例1  单头家蝇基因组DNA的提取

(参考Rinkevich FD et al.Frequencies of the pyrethroid resistance allelesof Vssc1and CYP6D1in house flies from the eastern United States.InsectMolecular Biology(2006)，15(2)，157-167)

本发明所用家蝇分别为实验室保存的拟除虫菊酯类杀虫剂敏感纯合品系(SS)、抗性纯合品系(RR基因型)、敏感与抗性品系的杂交一代杂合子(SR基因型)，前述家蝇品系为BJD系，均可得自中国科学院动物研究所(北京市朝阳区北辰西路1号院-5号)，以及分别采自山东、北京与吉林的野生家蝇，也可得自中国科学院动物研究所。

1.单头家蝇基因组DNA的提取方法(参考Rinkevich et al 2006)

(1)取单头家蝇(去腹部)置于1.5mL体积的离心管(eppendorf管)中，加入0.5mL裂解缓冲液，碾磨将虫体捣碎，置60度温浴，20分钟后取出；

(2)加75μL的8M醋酸钾，混匀，置冰上10分钟；

(3)14000g离心5min，取400μL上清液(避免取到沉淀)转至新的离心管；

(4)加入800μL(上清液的2倍体积)100％冰冷乙醇，室温放置10min；

(5)离心10分钟，弃上清，沉淀用0.5mL70％乙醇清洗；

(6)离心5分钟，沉淀干燥后，加入50μL水重溶。

制备的DNA样品可直接用于后续的PCR，也可以将样品保存在4℃下备用，或在-20℃条件下长期保存。

以上方法中使用的试剂配制方法如下：

(1)溶液A：含100mM Tris HCl pH 8.0，10mM EDTA，50mM NaCl(高压灭菌，室温保存)；

(2)0.15M精胺(spermine)(过滤灭菌，分装保存在-20℃)；(Fluka公司)

(3)0.5M亚精胺(spermidine)(过滤灭菌，分装保存在-20℃)；(Fluka公司)

(4)20mg/mL蛋白酶K(过滤灭菌，分装保存在-20℃)；(Merck公司)

(5)10％ SDS，用溶液A配制，无须灭菌；

(6)8M醋酸钾(室温保存，100mL水中溶解醋酸钾78.51g)；

(7)裂解缓冲液(现配现用)：为溶液A含1％ SDS；0.15mM精胺，0.5mM亚精胺和0.1mg/mL(20U/mg)蛋白酶K。

实施例2  CYP6D1v1抗性等位基因检测

采用PCR-RFLP方法，分两步，第一步为PCR，第二步酶切。

(1)设计特异引物：

qxh6d1F：5′-ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3′(SEQ ID NO：3)

qxh6d1R：5′-GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3′(SEQ ID NO：4)。

(2)PCR：PCR反应体系20μL，含10xbuffer 2.0μL，dNTP(各2.5mM混合物)1.5μL，引物(10μM)qxh6d1F 0.5μL，qxh6d1R 0.5μL；家蝇基因组DNA 2μL；Taq酶0.5μL(tiangen)，灭菌水8.5μL。PCR条件：94℃ 3min，30循环94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 45s)，延伸72℃ 5min。取5μL PCR产物2.0％琼脂糖凝胶检测，在约470bp处有条带(图1)。

(3)酶切：取2-5μL的DNA产物，加Buffer 4(New England BioLabs)2.0μL，Hpy188 III(New England BioLabs)0.2μL，100X BSA(NewEngland BioLabs)0.2μL，加灭菌水至20μL，37℃温育1-2小时。取10μL酶切产物在2.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测。

(4)结果解读：如图2所示，如果在476bp一条带，为抗性纯合，即家蝇CYP6D1v1抗性等位基因(如SEQ ID NO：1所示)；如果在476bp、328bp、133bp有三条带，为杂合型；如果在328bp和133bp有条带，为敏感基因型(如SEQ ID NO：2所示)。

具体试验实施例

试验实施例1

取北京自然种群家蝇样品1-10按上述实施例所述方法进行检测，如图3所示，除7号样品为杂合体外，其它样品为敏感纯合个体。

试验实施例2

取吉林长春自然种群家蝇样品1-10，并以实验室保存的拟除虫菊酯类杀虫剂纯合品系(SS)、抗性纯合品系(RR基因型)、敏感与抗性品系的杂交一代杂合子(SR基因型)为对照，按上述实施例所述方法进行检测，如图4所示，样品2、3、4、6、8、9、13、14、15为敏感纯合基因型个体；样品1、5、7、10、11、12位杂合基因型个体。

试验实施例3

取山东济南自然种群家蝇样品1-10按上述实施例所述方法进行检测，并以实验室保存的拟除虫菊酯类杀虫剂纯合品系(SS)、抗性纯合品系(RR基因型)、敏感与抗性品系的杂交一代杂合子(SR基因型)为对照，如图5所示，所有检测的山东样品为敏感(SS)纯合子。