N-苄基脂肪酰胺类化合物在制备神经保护药物中的应用

摘要

本发明公开了N-苄基脂肪酰胺类化合物在制备神经保护药物中的应用，其中，R1表示H或羟基或C1-4烷氧基；R2表示C7-C23的饱和或不饱和脂肪烃基。本发明的化合物可作为神经保护剂，用于制备治疗脑缺血、脑损伤、多发性硬化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种N-苄基脂肪酰胺类化合物在制备神经保护药物中的应用，该化合物有可能被用于治疗脑缺血、脑损伤、多发性硬化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经疾病。 

背景技术

神经细胞是中枢神经系统的主体，神经元损伤是许多神经疾病的主要原因，脑卒中、多发性硬化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经损伤、感染、变性，皆因神经元受到损害，导致部分或全部神经功能丧失。因此，有效地保护神经元是治疗多种神经疾病的一个切入点。 

在神经系统中，内源性大麻素对神经元的存活起重要作用。N-花生四烯酰乙醇胺(anandamide，AEA)如下式所示 

是最早被分离鉴定的内源大麻素，也是脑内重要的神经递质，不但参与多种急性神经损伤模型的保护，而且对多种神经退行性疾病也有保护作用。 

除内源性AEA外，体内外研究表明，AEA类似物也有广泛的神经保护作用。迄今为止，研究最为系统的AEA类似物是脂肪酰氨基酸类化合物，如下式所示， 

其中R'为饱和或不饱和烃基，R为氨基酸残基。它们由饱和或不饱和脂肪酸与不同的氨基酸结合而成。天然脂肪酰氨基酸最早在弯曲杆菌等微生物体内发现，近年来研究证实，哺乳动物体内亦存在此类化合物，并发现其生物学功能与AEA类似。中国专利CN1974545B公开了一类脂肪酰胺化合物及其作为神经保护剂在制备治疗脑缺血、脑中风、阿尔茨海默病、帕金森病等神经疾病药物中的应用。 

N-苄基脂肪酰胺类化合物是南美植物玛咖中的特征化学成分，其结构与AEA相似，与专利CN1974545B公开的以脂肪酰氨基酸为基本结构的化合物不同。McCollom M M等(文献：McCollom M M,Villinski JR,Gafner S,etal.Analysis of macamides in samples of Maca(Lepidium meyenii)by HPLC-UV-MS/MS.Phytochemical Analysis,2005,16:463–469)报道了此类物质的合成方法，而在本发明之前，没有出现本发明的化合物用于神经保护方面的报道。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供上述N-苄基脂肪酰胺类化合物在制备神经保护药物中的应用。 

上述N-苄基脂肪酰胺类化合物结构如下： 

其中，R₁为H或羟基或C1-4烷氧基，R₂为C7-C23的饱和或不饱和脂肪烃基。 

本发明通过式(I)的N-苄基脂肪酰胺类化合物对大鼠离体脑片缺氧缺糖(OGD)损伤的作用研究，以及对沙土鼠短暂前脑缺血和大鼠大脑中动脉阻塞再灌注神经元保护作用的研究，证实式(I)化合物具有中枢神经细胞保护活性，可用于制备神经保护药物，以治疗或预防脑缺血、脑损伤、多发性硬化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经疾病。 

通式(I)所示的N-苄基脂肪酰胺类化合物可与有机酸或无机酸形成可药用的加成盐。 

本发明还提供作为神经保护剂的药物组合物，其中包含有效剂量的通式(I)所述的化合物或通式(I)所述化合物的盐，还可以包含一种或多种药学上可接受的载体。 

上述的药学上可接受的载体是无毒并且对通式(I)化合物的发挥疗效没有不利影响。此类载体可以是本领域通常能得到的任意固体赋形剂、液体赋形剂、半固体赋形剂或气体赋形剂。固体赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油硬脂酰酯、氯化钠、无水脱脂乳等。液体和半固体赋形剂包括甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。 

本发明所述的化合物施用方式可以是口服，肌肉、静脉或皮下注射，或全身施用(例如透皮、鼻吸入或栓剂)。 

本发明所述的化合物的实际施用量依赖于许多因素，如待治疗疾病的严重性、治疗对象的年龄和相对健康程度、施用途径和方式，以及其他因素。通式(I)的化合物在治疗上的有效量是每天0.03-30mg/kg体重，可根据实际情况一次或多次施用。 

本发明所述的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。如使化合物(I)与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，如片剂、药丸、胶囊、半固体、粉末、 缓释剂型、溶液、混悬液、配剂、气雾剂等。 

附图说明

图1不同N-苄基脂肪酰胺类化合物预处理对大鼠脑片OGD损伤的保护作用。 

图2不同浓度的N-苄基脂肪酰胺类化合物预处理对大鼠脑片OGD损伤的保护作用。 

图3N-苄基棕榈酰胺预处理对前脑缺血再灌注沙土鼠海马CAl区神经元存活率的影响。 

图4N-苄基棕榈酰胺预处理对前脑缺血再灌注沙土鼠海马CAl区神经元存活率的影响柱状图。 

图5N-苄基棕榈酰胺对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑梗死面积的影响。 

图6N-苄基棕榈酰胺对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑梗死面积的影响柱状图。 

具体实施方式

实施例1 

N-苄基脂肪酰胺类化合物的合成，合成路线如下 

脂肪酸与二氯亚砜加热回流得脂肪酰氯。将苯甲胺或苯甲胺衍生物溶于吡啶中，缓慢滴加得到的脂肪酰氯，搅拌反应1h。经萃取、重结晶等，制得N-苄基脂肪酰胺类化合物。 

一共制备如下N-苄基脂肪酰胺类化合物，所制得化合物的结构分别为： 

1.N-苄基棕榈酰胺： 

2.N-(3-甲氧苄基)棕榈酰胺： 

3.N-苄基十八烷酰胺： 

4.N-(3-甲氧苄基)十八烷酰胺 

5.N-苄基油酰胺 

6.N-(3-甲氧苄基)油酰胺 

其中化合物1的核磁和质谱数据为： 

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：7.30(5H，m，H-3′to H-7′)，5.74(1H，s，N-H)，4.44(2H，d，J=5.7Hz，H2-1′)，2.21(2H，t，J=7.7Hz，H2-2)，2.00(4H，m，H2-8，H2-11)，1.66(2H，m，H2-3)，1.29(20H，m，H2-4to H2-7，H2-12to H2-17)，0.88(3H，t，J=6.6Hz，H3-18)； ¹³C-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：172.89(C-1)，138.45(C-2′)129.99(C-10)，129.73(C-9)，128.68(C-4′，C-6′)，127.80(C-3′，C-7′)，127.46(C-5′)，43.58(C-1′)，36.78(C-2)，31.88(C-16)，29.12-29.75(C-4to C-7and C-12to C-15)，27.21(C-11)，27.16(C-8)，25.74(C-3)；ESI-HRMS  m/z346.3142(calculated for C23H39NO，[M+H]+，346.3104). 

证明其为N-苄基棕榈酰胺。 

实施例2 

N-苄基脂肪酰胺类化合物对大鼠离体脑片缺氧缺糖(OGD)损伤的保护作用 

1．脑片的制备 

实验前，将正常脑脊液(nACSF)分为两份，分别在室温(25℃)下和冰浴(0℃)中通入混合氧气1小时，使其饱和备用。大鼠断头，迅速取出全脑，随后浸入冰nACSF中，1分钟后取出，沿冠状面切去并修平端脑和脑于端，502胶水粘贴在振动切片机托架上，用冰nACSF浸浴整个脑组织，混和氧气持续通入。快速切取400μm厚脑片，用表面抛光的粗口吸管将脑片移至表面皿，浸入混合氧气饱和的冰nACSFF中，迅速剥离出皮层和海马组织，随后用粗口吸管将皮层与海马脑片移至内置尼龙网罩的小烧杯里，使其浸浴在混合氧气饱和的nACSF内，在室温下恢复孵育90分钟，孵育过程中避免脑片受气泡震动，以及脑片之间相互覆盖、挤压，孵育结束后脑片供后续实验使用。 

2.实验分组及给药 

随机取出皮层脑片，在室温下恢复孵育90分钟后移入37℃混和氧气饱和的nACSF中再孵育30分钟，随后分别行OGD损伤实验：①对照组：37℃混和氧气饱和的nACSF中继续孵育；②损伤组：脑片移入混合氮气(95％N₂+5％CO₂)饱和的无葡萄糖人工脑脊液中(以10mmol/L的蔗糖代替nACSF中的葡萄糖)，孵育10分钟，再恢复nACSF正常孵育2小时；③给药组：在损伤前30分钟，损伤和恢复正常孵育2小时期间孵育液中分别加入10μmol/L的不同N-苄基脂肪酰胺类化合物和不同浓度的N-苄基棕榈酰胺。孵育结束后，所有脑片行TTC(2,3,5-二苯基氯化四氮唑)染色。 

脑片孵育结束随后浸入含2％TTC的nACSF中，在37℃水浴箱内避光染色，期间轻轻摇动，以防止脑片之间互相粘附或粘贴在瓶壁上，影响脑片染色。30分钟后取出脑片，用生理盐水漂洗两次，滤纸吸去表面水分，称量湿重，以1g：20ml的比例加入抽提液(乙醇：DMSO=1：1v/v)，然后抽提24小时，期间摇动数次，以保证所有脑片抽提完全。避光抽提结束后，按200ul/孔的量将抽提液加至96孔板上，酶标仪测定各孔在490nm波氏处的吸光度(A值)。按以下公式计算组织损伤百分率： 

组织损伤百分率=(1-A_490损伤/～A_490对照)×100％ 

3.N-苄基脂肪酰胺类化合物预处理对大鼠脑片OGD损伤的保护作用 

脑片OGD损伤10分钟后恢复正常孵育2小时，脑片TTC染色程度降低，组织损伤百 分率为58.6±0.91％，预先给予N-苄基脂肪酰胺类化合物与脑片孵育，各种N-苄基脂肪酰胺类化合物聚能降低脑片的组织损伤百分率(见图1)。 

N-苄基棕榈酰胺在其浓度为0.1、1、3、10、30μmol/L时均能降低脑片的组织损伤百分率，以浓度为3μmol/L和10μmol/L时作用最明显(见图2)。图4横坐标表示N-苄基脂肪酰胺类化合物的不同浓度，纵坐标表示对应的组织损伤百分比，*表示p<0.05，**表示p<0.01。 

实施例3 

N-苄基脂肪酰胺类化合物对短暂前脑缺血再灌注沙土鼠神经元损伤的保护作用 

1．动物分组 

成年雄性蒙古沙土鼠术前在22～25℃环境中饲养1～2天，手术前夜禁食，随意进水。随机分成假手术组、模型组和给药组3组。 

2.模型制作 

采用双侧颈总动脉阻断法制作沙土鼠短暂前脑缺血再灌注损伤模型。将沙土鼠按350mg/kg剂量腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉，俯卧位固定。模型组游离双侧颈动脉，予以微动脉夹闭5分钟+松开微动脉夹恢复脑血流。假手术组仅游离暴露双侧颈动脉，不予微动脉夹闭。给药组在术前三天以及夹闭双侧颈动脉前30分钟分别以及术后4天按3mg/kg剂量股静脉注射受试药物(N-苄基棕榈酰胺)。 

3.组织观察 

神经元计数：沙土鼠短暂前脑缺血再灌注术后第4天，腹腔注射350mg/kg10％水合氯醛溶液麻醉沙土鼠，开胸，经升主动脉用4％中性甲醛灌注固定。取视交叉后1～4mm脑块进行石蜡包埋，进行冠状面切片，取齿状回与海马互包平面的切片粘在挂胶玻片上，切片厚10μm。切片经Nissel染色，在200倍光镜下计数海马CAl中段100单位长度内存活神经元数目。 

4.实验结果 

沙土鼠短暂前脑缺血再灌注术后第4天，取出大脑行组织切片观察海马CAl区神经元的存活情况。与假手术组相比，模型组、给药组沙土鼠海马CAl区存活神经元数在缺血再灌注术后4天均明显减少。给药组在沙土鼠前脑缺血再灌注后4天海马CAl区存活神经元明显多于模型组(见图3、4，p<0.05)。 

实施例4 

N-苄基脂肪酰胺类化合物对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠皮层神经元凋亡的保护作用 

1.动物分组与给药 

将实验大鼠按体重随机分为3组，即假手术组、模型组、给药组，给药组在术前三天和 术前l小时腹腔注射N-苄基棕榈酰胺3mg/kg，假手术组和模型组腹腔注射等容积DMSO，给药后1h施行手术。 

2.大鼠局灶性脑缺血再灌注模型制备 

采用中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制备大鼠大脑再灌注模型。将麻醉后大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉(CCA)、右颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA与CCA，夹闭ICA远心端，于ECA与ICA分又处作一切口，插入一头端加热成光滑球形、前端经多聚赖氨酸处理的直径为0.25mm的尼龙线，然后松开夹闭ICA的动脉夹，继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤，线插入深度为18.5±0.5mm左右，致MCA入口阻塞而致脑缺血，尼龙线外留约lcm，缝合肌肉皮肤，腹腔注射硫酸庆大霉素2ml，2小时后轻轻提拉线头至有阻力，实现再灌。模型成功标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Homer’s征及对侧以前肢为手的偏瘫。假手术组仅结扎右侧颈总动脉，不作切口，不栓。 

3．组织学观察 

TTC染色法测定梗死体积：术后后24小时，断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分冠状切成5片。迅速将脑片置于2％TTC染液中，37℃避光温孵30分钟(孵育过程中晃动脑片使之染色充分)，取出后置于10％甲醛液中避光保存。24小时后拍照并输入计算机，用AUTO--CAD图像处理软件计算梗死面积(红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)，各脑片梗死面积之和乘以厚度(2mm)为总的梗死体积。梗死体积百分比=梗死灶体积/对侧半球的体积×100%。 

4.实验结果 

经TTC染色后，模型组和给药组大鼠皮质及纹状体梗死区呈苍白色，未缺血区呈红色，与MCA支配的脑区一致，说明模型成功。假手术组未见梗死灶，模型组和给药组大鼠均有不同程度的梗死灶，且给药组梗死体积百分比明显小于模型组(见图5、6)，差异有统计学意义(p<0.05)。 

实施例5 

本发明药物组合物片剂的制备 

采用亲水型辅料(羟丙基纤维素和淀粉)，在活性成分中加入适当的稀释剂，再通过混合粉碎法的微粉化处理，使药物表面覆盖了一层亲水材料，微粒均匀分散，可以改善其溶解特性，有助于提高药物的生物利用度。然后见混合物压片，每片重100mg，活性成分含量我70mg。一个具体配方如下： 

实施例6 

本发明药物组合物胶囊的制备 

将活性成分与助剂混合，过筛，在核实的容器中混合均匀，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为30mg。一个具体配方如下： 

N-苄基棕榈酰胺     30mg 

乳糖               168mg 

硬脂酸镁           2mg。