一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用

摘要

本发明公开了一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用。本发明筛选出结核肽Ag85B

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种结核/HIV抗原肽双特异性T细胞受体（TCR），以及利用该TCR制备得到的一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体，逆转录病毒载体转染得到的CD8⁺ T细胞及其在制备抗结核/HIV共感染疾病药物中的应用。

背景技术

结核（Tuberculosis, TB）是全球最致命的慢性感染疾病之一。近十年来，由于全球流动人口增加，结核病防治工作受到忽视，多药耐药结核菌广泛流行，免疫抑制剂大量使用，尤其是HIV与结核分枝杆菌并发感染，致使结核病重新蔓延，全球疫情再度恶化。结核潜伏感染者一旦感染HIV，机体免疫系统会被加速破坏，减弱甚至丧失对结核分枝杆菌的抑制效应，患者更容易发展成活动性结核；同时，结核分枝杆菌通过刺激单核细胞和巨噬细胞大量分泌单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）促进HIV的转录，加速病毒增殖，促使病情恶化。2010年全球新增结核病人880万，其中110万共感染HIV；全球结核死亡人数140万，其中1/4为合并感染HIV致死。

目前，TB/HIV双重感染者的治疗主要是抗TB与抗逆转录病毒治疗的结合，其疗程长，多种药物相互作用，药物重叠的毒副作用大，易产生耐药性，病人服药依从性差，对这两种疾病同时有效的药物稀缺，整合抗TB与抗逆转录病毒治疗存在时间和药物选择的巨大挑战，以及出现免疫重建炎症综合症等问题。因此，亟需开发针对TB/HIV共感染行之有效的治疗方法。

抗TB与抗HIV感染的免疫机制都是以T细胞介导的细胞免疫为主。已有大量实验证据表明，抗原特异性CD8⁺ T细胞在控制TB和HIV感染中发挥着至关重要的作用。效应CD8⁺ T细胞通过以下三种途径来发挥作用：1）发挥细胞毒作用，通过穿孔素和颗粒酶B（granzyme B）途径直接杀伤感染靶细胞；2）释放Th1型细胞因子，如干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α），抑制病原体复制，促进巨噬细胞清除胞内病原体；3）介导Fas/FasL杀伤机制，直接杀伤靶细胞。而在TB/HIV共感染者体内，效应CD8⁺ CTL数量和反应水平均很低。因此，通过过继转移大量效应CD8⁺ T细胞至TB/HIV共感染者体内，可增强其抗TB/HIV感染的能力。

过继细胞免疫治疗已在抗TB和HIV感染中显示了巨大潜力。利用灭活的结核菌体外致敏PBL，将其回输给多药耐药肺结核患者，取得良好疗效。将患者自体HIV特异性CD8⁺ CTL过继回输治疗6例HIV感染者，最初2周所有患者CD4计数增加，5名患者血浆病毒血症减少。24周后，2名患者的HIV病毒负载继续减少，另1名患者CD4计数增加超过2倍。尽管过继细胞免疫治疗展现出光明的前景，但这种方法的普遍应用却存在许多障碍。我们很难从处于疾病进展期的患者体内分离出效应T细胞，因为此时CTL反应是不断消耗的，接受长期治疗的个体也是如此，因为随着病原体负载减少，针对病原体的CTL反应也减少。另外，从患者体内分离出的T细胞往往是已最终分化的，很难扩增。即使可以扩增，回输患者体内后其存活时间也很短。而通过抗原特异T细胞受体基因修饰初始T细胞，人为赋予普通T细胞识别特异抗原的能力，短期内获得大量效应T细胞，则可有效解决这一问题。

T细胞抗原受体（T cell receptor, TCR）是所有T细胞表面的特征性标志，在T细胞抗原识别中起关键作用。TCR是由α、β两条肽链构成的异二聚体，每条肽链又可分为可变区（V区），恒定区（C区），跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区（Vα、Vβ）又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1、CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。

根据TCR Vα、Vβ基因的同源性，可将80多个TCR Vα基因分为32个家族、60多个TCR Vβ基因分为24个家族。利用每个T细胞克隆均有其独特CDR3序列的特点，采用CDR3谱型分析技术，可测定各TCR家族各CDR3出现的频率，由此反映T细胞的克隆性。未接受抗原刺激的T细胞中，针对各种抗原的T细胞克隆分布均匀，表现为多家族和多克隆性，具体地，表现为各家族均出现呈高斯分布的约8个CDR3峰；抗原刺激则引起识别该抗原的某一个或几个特异TCR家族T细胞反应性增生，表现为该家族CDR3成员出现少于4个峰的寡克隆或单克隆分布，其中具有单克隆CDR3分布（表现为单峰）的TCR家族即是抗原特异单克隆增生的TCR家族。对该家族PCR产物进行测序，可获得抗原特异TCR CDR3序列。

发明内容

本发明的目的在于：筛选出结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL) 双特异的TCR，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8⁺ T细胞中，获得表达结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL) 双特异TCR的CD8⁺ T细胞，以及该经过TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞在制备抗结核/HIV共感染疾病药物中的应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种结核/HIV抗原肽双特异性T细胞受体（TCR），包括α链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQ ID NO: 3所述的序列；β链的CDR3区含有SEQ ID NO: 4所示的序列。

所述TCR的α链是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。

优选的，所述TCR的α链氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，β链氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

编码上述结核/HIV抗原肽双特异性TCR的基因。

一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR的融合基因，其序列如SEQ ID NO:13所示。

一种重组逆转录病毒载体，含有编码结核/HIV抗原肽双特异性TCR的基因。

所述逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。

上述重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。

上述逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞。

结核/HIV抗原肽双特异性TCR、编码该TCR的基因，含有该基因的重组逆转录病毒载体、逆转录病毒、该逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞在制备抗结核病、艾滋、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。

具体步骤流程如下：

1、筛选出结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)双特异的TCR

① 淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；

② 贴壁法获取树突状细胞（dendritic cells，DC），IL-4和GM-CSF诱导DC成熟；

③ 磁珠分选出CD8⁺ T细胞；

④ 结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)分别负载DCs对CD8⁺ T细胞进行三轮刺激，诱导抗原特异CD8⁺ T细胞发生克隆扩增；

⑤ 提取CD8⁺ T细胞mRNA，逆转录为cDNA；

⑥ 利用基因扫描（GeneScan）监测刺激前后CDR3谱型变化，找出刺激后单克隆扩增的抗原特异的CD8⁺ T细胞TCR基因家族。

2、构建重组逆转录病毒载体

① 根据GeneBank报道的人α、β基因家族可变区（variable region，V）和恒定区（constant region，C）基因序列，设计α、β链基因全长序列引物，扩增特异性TCR α、β全长基因；

② 采用本实验室已经构建好的最小鼠源化C区（minimum murinized C region，简称为mC。包括mCα和mCβ，其中共9个氨基酸被鼠C区相应位点的氨基酸替换）分别替换α、β全长基因C区（参照文献：Luo W, Zhang XB, Huang YT, Hao PP, Jiang ZM, Wen Q, Zhou MQ, Jin Q, Ma L. Development of genetically engineered CD4⁺ and CD8⁺ T-cells expressing TCRs specific for a 38 kDa M. tuberculosis antigen. J Mol Med. 2011,89(9):903-13）。鼠源化突变的目的在于减少内外源性TCR α、β基因的错配，因为CD8⁺ T细胞存在内源性TCR α、β基因的表达，通过突变可以促使外源性α与β基因表达的蛋白正确装配成TCR蛋白分子并稳定表达在CD8⁺ T细胞表面，同时利于其竞争结合CD8⁺ T细胞表面的CD3分子，增强信号传导功能，提高修饰后CD8⁺ T细胞的抗结核活性。当然，此处还可以采取其他策略来减少内外源性TCR α、β基因的错配，如：以CD3ζ链替换α、β全长基因部分C区（Sebestyen, Z. et al. (2008) Human TCR that incorporate CD3{zeta} induce highly preferred pairing between TCR{alpha} and {beta} chains following gene transfer. J. Immunol. 180, 7736-7746）；在外源性α、β基因C区引入二硫键（Boulter, J.M. et al. (2003) Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng. 16, 707-711）；突变外源性α、β基因C区关键氨基酸以改变α、β链之间的静电荷（Voss, R.H. et al. (2008) Molecular design of the Cab interface favors specific pairing of introduced TCRab in human T cells. J. Immunol. 180, 391-401）；将外源性α、β基因V区合并为一条单链TCR并与CD3ζ链融合（Willemsen, R.A. et al. (2000) Grafting primary human T lymphocytes with cancer-specific chimeric single chain and two chain TCR. Gene Ther. 7, 1369-1377）；利用2A连接外源性α、β基因实现平衡表达（Leisegang M, Engels B, Meyerhuber P, Kieback E, Sommermeyer D, Xue SA, Reuss S, Stauss H, Uckert W. Enhanced functionality of T cell receptor-redirected T cells is defined by the transgene cassette. J Mol Med. 2008, 86:573-583.）等。

③ 利用重组PCR技术，将已经最小突变TCR α、β基因通过自剪切多肽2A连接，并克隆至pGEM-T载体测序鉴定。

④ 将测序正确的α、β全长基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP，酶切鉴定；

⑤ 采用磷酸钙转染法，包装逆转录病毒，低温差速离心法浓缩病毒；

⑥ 重组逆转录病毒转染NIH-3T3细胞，利用流式细胞术测定病毒感染NIH3T3细胞GFP的表达量，计算重组逆转录病毒滴度。计算公式：病毒感染滴度（IU/ml）=NIH3T3细胞总数×GFP阳性率/病毒浓缩液量（ml）。

3、鉴定重组逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞的抗结核和抗HIV活性

① 采用Ficoll密度梯度离心法，分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血PBMC；

② 磁珠分选CD8⁺ T细胞；

③ IL-2和抗-CD3单抗活化分选出的CD8⁺ T细胞；

④ 按感染复数（multiplicity of infection, MOI）=13将重组逆转录病毒pMX-β15-2A-α17-IRES-GFP感染CD8⁺ T细胞；

⑤ 使用IL-2和抗CD3单抗刺激感染后的CD8⁺ T细胞；

⑥ 流式细胞术检测病毒感染后阳性细胞的百分比；

⑦ 测定病毒转染的CD8⁺ T细胞的抗TB活性：

实验设置以下8组：① TCR基因修饰CD8⁺ T细胞 + 不负载抗原肽的DC；② 未转染CD8⁺ T细胞 + 负载Ag85B_199-207 的DC；③ 未转染CD8⁺ T细胞 + 负载Env_120-128 的DC；④ 空载体转染CD8⁺ T细胞 + 负载Ag85B_199-207 的DC；⑤ 空载体转染CD8⁺ T细胞 +负载Env_120-128 的DC；⑥ TCR基因修饰CD8⁺ T细胞 + 负载CMV pp65_495-503 的DC；⑦ TCR基因修饰CD8⁺ T细胞 + 负载Ag85B_199-207 的DC；⑧ TCR基因修饰CD8⁺ T细胞 + 负载Env_120-128 的DC。

用酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测上述各组细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α的分泌水平；用时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmuno-assay，TRFIA）检测CD8⁺ T细胞对分别负载结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)的DC的杀伤活性。

其中，CD8⁺ T细胞是人体内的一种细胞亚群，可由人外周血中分离获得，并进行体外扩增培养，分离和培养的实验设备要求低，技术成熟。

逆转录病毒载体是由某种逆转录病毒序列构建的基因运载工具，能够携带外源基因或DNA进入宿主细胞，并整合到染色体基因组上，目前已成为商业化产品，容易购买和获得。

重组逆转录病毒载体的构建方法为本领域常用的分子克隆技术，重组逆转录病毒转染方法是目前常用的生物技术手段，除本发明中使用的磷酸钙法外，还可以使用其它化学转染法，包括：DEAE-葡聚糖法、人工脂质体法；以及物理方法，包括：显微注射、电穿孔、基因枪等。

本发明的有益效果在于：

本发明成功筛选出结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)双特异的TCR，携带该TCR基因的逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，这种双特异性使得即使其中一种病原体发生突变产生免疫逃逸时，仍可对另一种病原体产生反应。该方法制备的逆转录病毒载体具有结核/HIV共感染疾病基因治疗的应用价值，可为结核/HIV共感染的过继细胞免疫治疗开辟新径。

附图说明

图1 结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)刺激前后CD8⁺ T细胞TCR α和β链CDR3谱型分析；

图2 重组逆转录病毒载体pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP构建示意图；

图3 pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP的酶切鉴定（M．DL15000 marker；1. pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP；2. pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP的 BamH I酶切产物；3. pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP的BamH I+XhoI双酶切产物）；

图4荧光显微镜观察重组病毒转染后NIH3T3细胞GFP的表达(×10。a. 明场；b. 荧光；c.叠加图）；

图5流式细胞术检测重组病毒转染后NIH3T3细胞GFP的表达（a．未转染；b. pMX-IRES-GFP；c. pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP）；

图6荧光显微镜观察重组病毒转染后CD8⁺ T细胞GFP的表达（×20。a. pMX-IRES-GFP；b. pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP）；

图7 流式细胞术检测CD8⁺ T细胞的GFP表达阳性率（a．未转染；b. pMX-IRES-GFP；c. pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP）；

图8 ELISA检测CD8⁺ T细胞IFN-γ的分泌水平；

图9 ELISA检测CD8⁺ T细胞TNF-α的分泌水平；

图10 ELISA检测CD8⁺ T细胞GrB的分泌水平；

图11 TRFIA检测CD8⁺ T细胞的杀伤活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，所有计量资料结果用±s表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较各组间细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌水平的差异，方差不齐时用Welch校正，采用LSD法进行各组间两两比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3法校正。检验水准α=0.05，双侧检验。采用SPSS17.0 for windows统计软件包进行数据分析。

实施例

1．筛选结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)双特异的TCR

1.1 密度梯度离心法分离纯化PBMC

(1) 在15ml刻度无菌离心管加入适量Ficoll淋巴细胞分离液；

(2) 取肝素抗凝的外周静脉血与等量RPMI 1640液充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取2倍体积的抗凝血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持界面完整。18~20°C，1800~2000rpm/min水平离心20~30min；

(3) 离心后管内液体分为四层，上层为血浆和稀释液，管底主要为红细胞和粒细胞层。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的灰白色云雾层；

(4) 用吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的RPMI 1640液，18~20°C，1500rpm/min离心10min，洗涤细胞两次去除大部分混杂的血小板后为PBMC；

(5) 细胞计数及细胞活力检测：PBMC悬液与1/10体积的0.4 %台酚蓝染液混合，于血球计数板上计数板上角上四个大方格总细胞数，总细胞数的四分之一数乘以10⁴即为每毫升浓度；死细胞可着色台盼蓝，活的不着色，计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率［活细胞率%=（活细胞数/总细胞数）×100%］。

1.2 制备Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)和HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)双特异T细胞克隆：

(1) 计数PBMC，调整PBMC数目为1×10⁶/孔，分别加入含结核肽Ag85B_199–207（KLVANNTRL）、HIV肽Env_120-128 50ng/ml的10% FBS-1640培养基2ml；

(2) 37°C、5% CO₂条件下培养2h后，加入IL-2 25U/ml；

(3) 第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2 100U/ml，之后以此浓度继续培养11天。

1.3 免疫磁珠（德国美天旎生物公司）分选CD8⁺ T细胞。

1.4 总RNA提取试剂盒（OMEGA）提取上述收集到的细胞沉淀的总RNA。

1.5 逆转录（RT）试剂盒（Fermentas）合成cDNA。

1.6 PCR扩增34 个TCR Vα基因家族CDR3片段：

利用34个TCR Vα家族特异性上游引物和共用下游Cα外、内侧引物（参照文献：XIN-SHENG等，2006，Analysis of the CDR3 region of alpha/beta T-cell receptors (TCRs) and TCR BD gene double-stranded recombination signal sequence breaks end in peripheral blood mononuclear cells of T-lineage acute lymphoblastic leukemia. Clinical & Laboratory Haematology. Clinical & Laboratory Haematology, 28: 405-415. doi: 10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x）做半巢式PCR：

第一轮PCR：每样本做34个PCR反应管，第1~34管分别加入TCR Vα1至Vα34家族上游引物，每管加下游共用Cα外侧引物1μl，各引物浓度均为10μM。每PCR反应管体积为25μl，含cDNA模板1.0μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U。PCR反应条件：95°C预变性3min；95°C 30s，60°C 30s，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。                 

第二轮PCR：反应总体积为25μl，含第一轮PCR产物2μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U，TCR Vα 34个家族上游引物1μl，下游FAM标记内侧Cα引物1μl，各引物浓度均为10μM。PCR反应条件：95°C 2min；60°C 2min，72°C 10min，4个循环。

1.7 PCR扩增24个TCR Vβ基因家族CDR3片段（参照文献：XIN-SHENG等，2006，Clinical & Laboratory Haematology, 28: 405–415. doi: 10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x）：

每样本做24个PCR反应管，每管加入TCR Cβ-FAM下游引物0.8μl，第1至第24管分别加入TCR Vβ1至TCR Vβ24上游引物0.8μl，各引物浓度均为10μM。PCR反应体积为25μl，含cDNA模板1μl，10mmol/L dNTP 0.5μl， 10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U。PCR反应条件：94°C变性3min；94°C 1min，55°C 1min，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。 

1.8 琼脂糖凝胶电泳

取34个TCR Vα和24个TCR Vβ基因家族PCR产物各8μl，2%琼脂糖凝胶电泳，100V，20min，采用凝胶成像系统照相。剩余PCR产物-20°C保存备用。

1.9 CDR3谱型分析

取34个Vα、24个Vβ基因家族FAM荧光标记PCR产物2μl，在373DNA序列分析仪（ABI，Perkin Elmer）上进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集电泳过程中不同时间出现的不同强度的荧光信号，GeneScan 672软件自动分析收集的数据，转换为不同位置、高度和形态的峰，代表各TCR家族CDR3成员出现的频率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有单峰分布的TCR家族即是抗原特异性单克隆增生的TCR家族。

CDR3谱型分析结果显示，结核肽Ag85B_199-207 (KLVANNTRL)或HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)刺激CD8⁺ T细胞后，部分TCR基因家族谱型发生改变，由原来的8个或多于8个峰型的高斯分布变为少于8个峰的单寡峰分布，表明这些家族是由于Ag85B_199-207或Env_120-128持续刺激引起的寡克隆或单克隆增生。比较刺激前后CDR3谱型的变化，找出两种肽刺激前为多克隆，刺激后均呈单克隆扩增的Vα17、Vβ15基因家族（见图1）。

测序结果显示，TCR α17、β15基因CDR3区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示，这两条CDR3序列编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示。

2．构建重组逆转录病毒载体（构建示意图见图2）

2.1 合成引物

依据GeneBank报道的Vα17、Vβ15基因家族V区序列特点，设计全长基因上、下游引物，依据9个关键氨基酸突变后的C区序列（即mCα与mCβ）分别设计上、下游引物，依据P2A肽连接序列设计引物，全部引物由Invitrogen上海英骏生物技术有限公司合成，引物名称和序列（5’ to 3’）如下：

 

2.2 重组PCR扩增hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合全长基因

(1) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P1和P2，PCR扩增hVβ15hCβ全长基因序列（核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示）。

 (2) 以hVβ15hCβ全长基因序列（SEQ ID NO: 5）为模板，利用引物P1和P3，PCR扩增hVβ15区及mCβ上突变位点之前的序列（S1：hVβ15-5’端mCβ区）。

(3) 以含本实验室已经构建好的最小鼠源化C区（mC）的质粒pMX-mmTCRβ8-P2A-mmTCRα3-IRES-GFP (具体序列与构建方法参见文献：Luo W.et al. J Mol Med. 2011,89(9):903-13)为模板，利用引物P4和P5，PCR扩增3’端hVβ15序列、mCβ区、GSG及5’端P2A（S2：3’端hVβ15-mCβ-GSG-5’端P2A区）。

(4) 以步骤(2)得到的S1和步骤(3)得到的S2作为模板，利用引物P1和P5，重组PCR扩增hVβ15mCβ及5’端P2A区（S3：hVβ15mCβ-5’端P2A区）（其中hVβ15mCβ段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示）。

(5) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P6和P7，PCR扩增hVα17hCα全长基因序列（核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示）。

(6) 以hVα17hCα全长基因序列（SEQ ID NO: 9）为模板，利用引物P8和P9，PCR扩增3’端P2A、hVα17区及5’端mCα的序列（S4：3’端P2A -hVα17-5’端mCα区）。

(7) 以含本实验室已经构建好的最小鼠源化C区（mC）的质粒pMX-mmTCRβ8-P2A-mmTCRα3-IRES-GFP为模板，利用引物P10和P7，PCR扩增3’端hVα17的序列及mCα区（S5：3’端hVα17-mCα区）。

(8) 以步骤(6)得到的S4和步骤(7)得到的S5作为模板，利用引物P8和P7，重组PCR扩增3’端P2A 及hVα17mCα区（S6：3’端P2A-hVα17mCα区）（其中hVα17mCα段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示）。

 (9) 以步骤(4)得到的S3和步骤(8)得到的S6作为模板，利用引物P1和P7，重组PCR扩增hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因全长序列（SEQ ID NO：13）。

以上常规PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，模板DNA 0.8μl。PCR反应条件：95°C变性5min；95°C 1min，72°C 2min，35个循环；72°C延伸10min。

重组PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，两种PCR产物模板各1μl。PCR反应条件：95°C变性5min；95°C 1min，52°C 45s，72°C 2min，3个循环；95°C 1min，72°C 2min，32个循环；72°C延伸10min。

2.3 构建含hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因的克隆载体

(1) 用胶回收试剂盒（Omega）回收hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因片段；

(2) 用DNA A-Tailing试剂盒（TaKaRa）在上述基因片段末尾加A；

(3) 将hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因片段接入pGEM-T载体中，连接反应体系10ml：pGEM-T载体1ml、10′ligation Buffer 1ml、T4 DNA 连接酶1ml、0.2pmol已加A纯化的PCR产物，16°C连接过夜。

(4) 常规方法将连接正确的质粒转化 E.coli DH5α感受态菌。然后将菌涂布在含4ml 200mg/ml IPTG、40ml 20 mg/ml X-gal的氨苄青霉素平板上；培养过夜，重组质粒转化的菌落呈为白色，而空质粒转化的菌落呈蓝色。选择平板上白色菌落，转到装有3ml Amp⁺ LB培养液的试管中，37°C，160rpm振摇12-16h。

(5) 用质粒抽提试剂盒（Omega）提取质粒，用相应的限制性内切酶对初筛阳性重组质粒进行鉴定，并以重组质粒为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。最后将初筛阳性质粒送Invitrogen上海英骏生物技术有限公司进行测序。测序结果表明，该重组质粒所含外源基因序列与预测序列完全一致。

2.4 重组逆转录病毒载体的构建

(1) 用限制性内切酶BamH I、Xho I酶切含hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因的T载体与pMX-IRES-GFP空质粒，分别胶回收hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因片段与载体基因片段（方法同步骤2.3）；

(2) 将hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因连接入pMX-IRES-GFP载体（方法同步骤2.3）后，转化感受态细菌XL-10，涂布于含氨苄青霉素的固体培养基培养12-16h后，挑选单个菌落，摇菌过夜；

(3) 抽提质粒，酶切鉴定结果显示，基因片段插入正确（见图3）；

(4) 选择阳性菌落进行扩增培养，大量抽提质粒DNA。

2.5 逆转录病毒重组载体的包装

重组质粒与包膜蛋白质粒VSV-G以1:1的比例混合，采用磷酸钙转染法转染GP2-293细胞，包装逆转录病毒，实验按磷酸钙法细胞转染试剂盒（碧云天）说明操作。

2.6 重组逆转录病毒的浓缩纯化

(1) 收集病毒上清，10000g，4°C离心10min； 

(2) 回收病毒上清，50000g，4°C离心2h； 

(3) 1%-3%原体积的TNE重悬，病毒完全溶解后，分装，-80°C贮存；；

2.7 流式细胞术测定病毒滴度

(1) 预先将NIH3T3细胞（2×10⁵/孔）接种培养24h；

(2) 加入聚凝胺（PB）至终浓度8mg/L，加入10μl待测滴度的病毒上清；

(3) 感染24h后，更换新鲜培养液，去除假病毒颗粒； 

(4) 37°C继续培养3d后，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达；

(5) 37°C继续培养5d后，胰酶消化、PBS洗涤3次后，用200～300μl PBS重悬，制备密度为1～5×10⁶/ml的单细胞悬液，流式细胞仪检测其GFP表达阳性率，按下列公式计算病毒滴度：病毒滴度（GFU/ml）=NIH3T3细胞数×阳性率/转染病毒上清量（ml）。

荧光显微镜下观察，pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP逆转录病毒感染的NIH3T3细胞表达绿色荧光，表明GFP在细胞中的表达（图4）。经流式细胞术检测，计算得重组病毒的滴度为1.93×10⁷ IU/ml（见图5）。

3．鉴定重组逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞的抗结核/HIV活性

3.1 重组病毒感染CD8⁺ T细胞

(1) 将CD8⁺ T细胞感染前一天以 5×10⁵个/孔接种于24孔板；

(2) 转染当日弃细胞培养旧液，按MOI为13加入病毒贮存液，加入PB至终浓度为8mg/L，37°C培养4h；

(3) 加入培养基，稀释PB至2mg/L，继续培养5天；

(4) 离心收集细胞，PBS洗涤2次，2%多聚甲醛固定；

(5) 流式细胞仪分析CD8⁺ T细胞GFP表达阳性率为23.2%（图6、7）。

3.2 ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）测定CD8⁺ T细胞的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌水平  

实验对照组设置：① Td+DC组：TCR基因修饰CD8⁺ T细胞 + 不负载抗原肽的DC；② UnTd+Ag85B_199-207组：未转染CD8⁺ T细胞 + 负载结核肽Ag85B_199-207 的DC；③ UnTd+ Env_120-128组：未转染CD8⁺ T细胞 + 负载HIV肽Env_120-128 的DC；④ EmTd+Ag85B_199-207组：空载体转染CD8⁺ T细胞 + 负载结核肽Ag85B_199-207 的DC；⑤ EmTd+Env_120-128组：空载体转染CD8⁺ T细胞 +负载HIV肽Env_120-128 的DC；⑥ Td+pp65_495-503组：TCR基因修饰CD8⁺ T细胞 + 负载CMV pp65_495-503的DC；⑦ Td+Ag85B_199-207组：TCR基因修饰CD8⁺ T细胞 + 负载结核肽Ag85B_199-207 的DC；⑧ Td+Env_120-128组：TCR基因修饰CD8⁺ T细胞 + 负载HIV肽Env_120-128 的DC。以下实验对照设置均同此。实验重复3次，方法如下：

(1) 以5×10³个/孔接种负载或不负载抗原肽的DC于96孔板，分别按照一定效靶比（E:T）值（测IFN-γ的分泌水平时E:T=7、测TNF-α、GrB的分泌水平时E:T=20）加入抗原特异TCR基因修饰CD8⁺ T细胞，与DC进行共培养，每组设两个复孔；

(2) 共培养一定时间（测IFN-γ时混合培养18h，测TNF-α与GrB时混合培养24h）后，收集各孔培养上清，按试剂盒说明书进行操作。

ELISA结果显示：

① 在E:T=7，与负载结核肽Ag85B_199-207或HIV肽Env_120-128的DC混合培养18h时，结核肽/HIV肽双特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞IFN-γ分泌水平分别达到最高值598.532±3.621pg/mL和323.585±6.870pg/mL，显著高于未转染、空转染的CD8⁺ T细胞和与未负载抗原肽或负载其它非特异抗原肽的DC共培养的TCR基因修饰的CD8⁺  T细胞（P<0.001），见图8；

② 在E:T=20，与负载结核肽Ag85B_199-207或HIV肽Env_120-128的DC混合培养24h时，结核肽/HIV肽双特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞TNF-α分泌水平达到最高值863.806±27.104pg/mL和566.531±19.548pg/mL，显著高于未转染、空转染的CD8⁺ T细胞和与未负载抗原肽或负载其它非特异抗原肽的DC共培养的TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞（P<0.001），见图9。

③ 在E:T=20，与负载结核肽Ag85B_199-207或HIV肽Env_120-128的DC混合培养24h时，结核肽/HIV肽双特异TCR基因修饰组GrB分泌量（分别为2861.904±67.676pg/mL和2855.089±16.780pg/mL）显著高于未转染、空转染的CD8⁺ T细胞和与未负载抗原肽或负载其它非特异抗原肽的DC共培养的TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞（P<0.001），见图10。

3.3 时间分辨荧光免疫分析试剂盒（Perkin Elmer）测定CD8⁺ T细胞的杀伤活性

时间分辨免疫荧光检测结果显示：在E:T=30，与负载结核肽Ag85B_199-207或HIV肽Env_120-128的DC混合培养2h时，TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞杀伤活性最高，分别达到70.29%和65.70%，显著高于未转染、空转染的CD8⁺ T细胞和与未负载抗原肽或负载其它非特异抗原肽的DC共培养的TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞的杀伤水平（P<0.001），见图11。

上述的实验结果显示：携带结核肽/HIV肽双特异TCR基因的逆转录病毒转染的CD8⁺细胞可成功表达外源性TCR基因，同时特异性识别结核肽Ag85B_199-207和HIV肽Env_120-128并介导IFN-γ、TNF-α、GrB细胞因子分泌和细胞毒活性，具有结核/HIV共感染疾病基因治疗的应用价值，可为结核/HIV共感染的过继细胞免疫治疗开辟新径。

<110>  南方医科大学

<120>  一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用

<130> 

<160>  23   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  69

<212>  DNA

<213>  human

 

<400>  1

ccctattcag gaggaggtgc tgacggactc acctttggca aagggactca tctaatcatc       60

cagccctat                                                               69

 

<210>  2

<211>  52

<212>  DNA

<213>  human

<400>  2

cgggacagct tccgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca ca               52

 

<210>  3

<211>  23

<212>  PRT

<213>  human

<400>  3

Pro Tyr Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr

1               5                   10                  15     

His Leu Ile Ile Gln Pro Tyr

            20             

<210>  4

<211>  17

<212>  PRT

<213>  human

<400>  4

Arg Asp Ser Phe Arg Ala Val Leu Arg Ala Gly His Gln Ala His Gly

1               5                   10                  15     

His   

 

<210>  5

<211>  933

<212>  DNA

<213>  human

<400>  5

gccaggatgg cctccctgct cttcttctgt ggggcctttt atctcctggg aacagggtcc       60

atggatgctg atgttaccca gaccccaagg aataggatca caaagacagg aaagaggatt      120

atgctggaat gttctcagac taagggtcat gatagaatgt actggtatcg acaagaccca      180

ggactgggcc tacggttgat ctattactcc tttgatgtca aagatataaa caaaggagag      240

atctctgatg gatacagtgt ctctcgacag gcacaggcta aattctccct gtccctagag      300

tctgccatcc ccaaccagac agctctttac ttctgtgcca ccagtgacgg gacagcttcc      360

gagcagtact tcgggccggg caccaggctc acggtcacag aggacctgaa caaggtgttc      420

ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc      480

acactggtgt gcctggccac aggcttcttc cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg      540

aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc      600

gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg      660

cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac      720

gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt      780

agagcagact gtggctttac ctcggtgtcc taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc      840

ctctatgaga tcctgctagg gaaggccacc ctgtatgctg tgctggtcag cgcccttgtg      900

ttgatggcca tggtcaagag aaaggatttc tga                                   933

 

<210>  6

<211>  308

<212>  PRT

<213>  human

<400>  6

Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr

1               5                   10                  15     

Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr

            20                  25                  30         

Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His

        35                  40                  45             

Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu

    50                  55                  60                 

Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser

65                  70                  75                  80 

Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser

                85                  90                  95     

Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr

            100                 105                 110        

Ser Asp Gly Thr Ala Ser Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

        115                 120                 125            

Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

    130                 135                 140                

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

145                 150                 155                 160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

                165                 170                 175    

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

            180                 185                 190         

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser

        195                 200                 205            

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

    210                 215                 220                 

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

225                 230                 235                 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

                245                 250                 255    

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly

            260                 265                 270        

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

        275                 280                 285            

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys

    290                 295                 300                

Arg Lys Asp Phe

305            

 

<210>  7

<211>  927

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

atggcctccc tgctcttctt ctgtggggcc ttttatctcc tgggaacagg gtccatggat       60

gctgatgtta cccagacccc aaggaatagg atcacaaaga caggaaagag gattatgctg      120

gaatgttctc agactaaggg tcatgataga atgtactggt atcgacaaga cccaggactg      180

ggcctacggt tgatctatta ctcctttgat gtcaaagata taaacaaagg agagatctct      240

gatggataca gtgtctctcg acaggcacag gctaaattct ccctgtccct agagtctgcc      300

atccccaacc agacagctct ttacttctgt gccaccagtg acgggacagc ttccgagcag      360

tacttcgggc cgggcaccag gctcacggtc acagaggacc tgaacaaggt gttcccaccc      420

gaggtcgctg tgtttgagcc atcaaaagca gagatcgcac acacccaaaa ggccacactg      480

gtgtgcctgg ccacaggctt cttccctgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg      540

aaggaggtgc acagtggggt cagcacggac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc      600

aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac      660

ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg      720

acccaggata gggccaaacc cgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca      780

gactgtggca ttacctcggc atcctaccac caaggggtcc tgtctgccac catcctctat      840

gagatcctgc tagggaaggc caccctgtat gctgtgctgg tcagcgccct tgtgttgatg      900

gccatggtca agagaaagga tttctga                                          927

 

<210>  8

<211>  308

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  8

Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr

1               5                   10                  15     

Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr

            20                  25                  30          

Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His

        35                  40                  45             

Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu

    50                  55                  60                  

Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser

65                  70                  75                  80 

Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser

                85                  90                  95     

Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr

            100                 105                 110        

Ser Asp Gly Thr Ala Ser Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

        115                 120                 125            

Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

    130                 135                 140                

Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

145                 150                 155                 160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

                165                 170                 175    

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

            180                 185                 190        

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser

        195                 200                 205            

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

    210                 215                 220                

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

225                 230                 235                 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

                245                 250                 255    

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly

            260                 265                 270        

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

        275                 280                 285            

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys

    290                 295                 300                

Arg Lys Asp Phe

305            

 

<210>  9

<211>  831

<212>  DNA

<213>  human

<400>  9

atgaagacat ttgctggatt ttcgttcctg tttttgtggc tgcagctgga ctgtatgagt       60

agaggagagg atgtggagca gagtcttttc ctgagtgtcc gagagggaga cagctccgtt      120

ataaactgca cttacacaga cagctcctcc acctacttat actggtataa gcaagaacct      180

ggagcaggtc tccagttgct gacgtatatt ttttcaaata tggacatgaa acaagaccaa      240

agactcactg ttctattgaa taaaaaggat aaacatctgt ctctgcgcat tgcagacacc      300

cagactgggg actcagctat ctacttctgt gcagagagtc cctattcagg aggaggtgct      360

gacggactca cctttggcaa agggactcat ctaatcatcc agccctatat ccagaaccct      420

gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc      480

accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca      540

gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg      600

agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac      660

accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa      720

acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg      780

aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a               831

 

<210>  10

<211>  276

<212>  PRT

<213>  human

<400>  10

Met Lys Thr Phe Ala Gly Phe Ser Phe Leu Phe Leu Trp Leu Gln Leu

1               5                   10                  15     

Asp Cys Met Ser Arg Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser

            20                  25                  30         

Val Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser

        35                  40                  45             

Ser Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu

    50                  55                  60                 

Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln

65                  70                  75                  80 

Arg Leu Thr Val Leu Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg

                85                  90                  95     

Ile Ala Asp Thr Gln Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu

            100                 105                 110        

Ser Pro Tyr Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly

        115                 120                 125            

Thr His Leu Ile Ile Gln Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val

    130                 135                 140                

Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe

145                 150                 155                 160

Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp

                165                 170                 175    

Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe

            180                 185                 190        

Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys

        195                 200                 205            

Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro

    210                 215                 220                

Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu

225                 230                 235                 240

Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

                245                 250                 255    

Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

            260                 265                 270        

Leu Trp Ser Ser

        275    

 

<210>  11

<211>  831

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

atgaagacat ttgctggatt ttcgttcctg tttttgtggc tgcagctgga ctgtatgagt       60

agaggagagg atgtggagca gagtcttttc ctgagtgtcc gagagggaga cagctccgtt      120

ataaactgca cttacacaga cagctcctcc acctacttat actggtataa gcaagaacct      180

ggagcaggtc tccagttgct gacgtatatt ttttcaaata tggacatgaa acaagaccaa      240

agactcactg ttctattgaa taaaaaggat aaacatctgt ctctgcgcat tgcagacacc      300

cagactgggg actcagctat ctacttctgt gcagagagtc cctattcagg aggaggtgct      360

gacggactca cctttggcaa agggactcat ctaatcatcc agccctatat ccagaaccct      420

gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc      480

accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca      540

gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg      600

agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac      660

accttcttcc ccagctcaga cgttccctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa      720

acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg      780

aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a               831

 

<210>  12

<211>  276

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  12

Met Lys Thr Phe Ala Gly Phe Ser Phe Leu Phe Leu Trp Leu Gln Leu

1               5                   10                  15     

Asp Cys Met Ser Arg Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser

            20                  25                  30         

Val Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser

        35                  40                  45             

Ser Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu

    50                  55                  60                 

Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln

65                  70                  75                  80 

Arg Leu Thr Val Leu Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg

                85                  90                  95     

Ile Ala Asp Thr Gln Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu

            100                 105                 110        

Ser Pro Tyr Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly

        115                 120                 125            

Thr His Leu Ile Ile Gln Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val

    130                 135                 140                

Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe

145                 150                 155                 160

Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp

                165                 170                 175    

Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe

            180                 185                 190        

Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys

        195                 200                 205            

Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro

    210                 215                 220                

Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu

225                 230                 235                 240

Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

                245                 250                 255    

Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

            260                 265                 270         

Leu Trp Ser Ser

        275    

 

<210>  13

<211>  1821

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  13

atggcctccc tgctcttctt ctgcggggcc ttttatctcc tgggaacagg gtccatggat       60

gctgatgtta cccagacccc aaggaatagg atcacaaaga caggaaagag gattatgctg      120

gaatgttctc agactaaggg tcatgataga atgtactggt atcgacaaga cccaggactg      180

ggcctacggt tgatctatta ctcctttgat gtcaaagata taaacaaagg agagatctct      240

gatggataca gtgtctctcg acaggcacag gctaaattct ccctgtccct agagtctgcc      300

atccccaacc agacagctct ttacttctgt gccaccagtg acgggacagc ttccgagcag      360

tacttcgggc cgggcaccag gctcacggtc acagaggacc tgaacaaggt gttcccaccc      420

gaggtcgctg tgtttgagcc atcaaaagca gagatcgcac acacccaaaa ggccacactg      480

gtgtgcctgg ccacaggctt cttccctgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg      540

aaggaggtgc acagtggggt cagcacggac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc      600

aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac      660

ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg      720

acccaggata gggccaaacc cgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca      780

gactgtggca ttacctcggc atcctaccac caaggggtcc tgtctgccac catcctctat      840

gagatcctgc tagggaaggc caccctgtat gctgtgctgg tcagcgccct tgtgttgatg      900

gccatggtca agagaaagga tttcggctcc ggagccacga acttctctct gttaaagcaa      960

gcaggagacg tggaagaaaa ccccggtccc atgaagacat ttgctggatt ttcgttcctg     1020

tttttgtggc tgcagctgga ctgtatgagt agaggagagg atgtggagca gagtcttttc     1080

ctgagtgtcc gagagggaga cagctccgtt ataaactgca cttacacaga cagctcctcc     1140

acctacttat actggtataa gcaagaacct ggagcaggtc tccagttgct gacgtatatt     1200

ttttcaaata tggacatgaa acaagaccaa agactcactg ttctattgaa taaaaaggat     1260

aaacatctgt ctctgcgcat tgcagacacc cagactgggg actcagctat ctacttctgt     1320

gcagagagtc cctattcagg aggaggtgct gacggactca cctttggcaa agggactcat     1380

ctaatcatcc agccctatat ccagaaccct gaccctgccg tgtaccagct gagagactct     1440

aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc accgattttg attctcaaac aaatgtgtca     1500

caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg     1560

gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac     1620

gccttcaaca acagcattat tccagaagac accttcttcc ccagctcaga cgttccctgt     1680

gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa acagatacga acctaaactt tcaaaacctg     1740

tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg     1800

ctgcggctgt ggtccagctg a                                               1821

 

<210>  14

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  14

cgggatccgc caggatggcc tccctgctct tcttctgcg                              39

 

<210>  15

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  15

ccgctcgagt cagaaatcct ttctcttgac catggccatc aacac                       45

 

<210>  16

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  16

ccttgttcag gtcctctgtg accgtgagcc tggtgcc                                37

 

<210>  17

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  17

aggctcacgg tcacagagga cctgaacaag gtgttcccac                             40

 

<210>  18

<211>  79

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  18

cttccacgtc tcctgcttgc tttaacagag agaagttcgt ggctccggag ccgaaatcct       60

ttctcttgac catggccat                                                    79

 

<210>  19

<211>  46

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  19

catgccatgg atgaagacat ttgctggatt ttcgttcctg tttttg                      46

 

<210>  20

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  20

ccgctcgagt cagctggacc acagccgcag cgtcatgagc ag                          42

 

<210>  21

<211>  79

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  21

cgaacttctc tctgttaaag caagcaggag acgtggaaga aaaccccggt cccatgaaga       60

catttgctgg attttcgtt                                                    79

 

<210>  22

<211>  43

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  22

gcagggtcag ggttctggat atagggctgg atgattagat gag                         43

 

<210>  23

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  23

cagccctata tccagaaccc tgaccctgcc gtgt                                   34