棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼的一种工厂化杂交育种方法

摘要

本发明是棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼的一种工厂化杂交育种方法，选择鞍带石斑鱼亲鱼和棕点石斑鱼亲鱼进行亲鱼培育，人工调控鞍带石斑鱼培育水温从23℃到20℃再到30℃，棕点石斑鱼亲鱼培育水温从23℃到20℃再到28℃，次年5-6月份取鞍带石斑鱼成熟精液备用。挑选腹部明显膨胀，卵巢发育至Ⅳ期的雌鱼，注射催产剂，36小时效应期后，捞取棕点石斑雌鱼进行人工挤卵，然后将收集的棕点石斑鱼卵与采集好的鞍带石斑精液按照体积比1000:1混合，加入海水完成受精，将受精卵放在孵化槽内，经过20小时左右，收集上浮发眼卵，采用浓度0.3-0.5ppm的臭氧进行消毒。实现了棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼杂交育种。

说明书

  

技术领域  

本发明涉及棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼的一种杂交育种方法。

    背景技术  

棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)又称褐点石斑鱼,俗称老虎斑、虎头斑,为暖水性岛礁性鱼类，在我国主要分布于东海和南海,资源量比较稀少。由于其肉味鲜美、生长快、市场潜力大,养殖前景看好。鞍带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus），俗名龙胆石斑，又称紫石斑，为暖水性海洋底层鱼类，是石斑鱼类中体型最大的种类之一，有斑王之称，主要产地是东南亚、澳洲水域以及我国南海（南沙群岛）、台湾附近海域。鞍带石斑鱼种苗来源稀少，市场售价昂贵，而且该种鱼生长迅速、抗病力强。

棕点石斑鱼肉质鲜美，生长速度和抗病能能力并不突出，而鞍带石斑鱼生长速度快、抗病力强，但肉质不及棕点石斑鱼。根据遗传学特性，品种间的杂交技术可以实现两种鱼优势性状的集成。 

目前国内已有开展棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼的一种工厂化杂交育种方法的研究，但国内人工繁殖操作技术并不完善，苗种成活率低，产量不稳定，成为养殖产业发展的瓶颈。 

发明内容

本发明的目的在于提供棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼的一种工厂化杂交育种方法，所要解决的技术问题：一是构建工厂化环境下棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼亲鱼人工促熟技术，以调节棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼性成熟时间，解决棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼发育受外界环境限制问题；二是构建棕点石斑鱼精子超低温冷冻技术，保存鞍带石斑鱼精液，解决因棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼因性成熟时间不一致，受精困难的问题；三是构建受精卵臭氧消毒技术，进行臭氧消毒，有效切断细菌、病毒性疾病从受精卵到苗种的垂直传播。 

本发明的技术方案如下： 

棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼的一种工厂化杂交育种方法，其特征在于：

1）、亲本筛选：杂交育种选择6~10龄鞍带石斑鱼作为雄性亲本，4~5龄棕点石斑鱼作为雌性亲本；

2）、亲本培育：将雌雄亲本分别放养于不同亲鱼培育池内，每池放养5~10尾；棕点石斑鱼养殖水温保持在20~38℃，鞍带石斑鱼养殖水温保持在20~30摄氏度；亲本饵料为鲐鱼、鲅鱼的任一种或者两种的任意比例混合投喂，水温≥24℃时2天投喂1次，20~23℃时每周投喂2次，每次投喂量占鱼体体重的1%；

3）、人工促熟技术：通过调控亲鱼培育的水温度，控制育苗时间在每年6月份，措施为：从第一年的12月份开始，亲鱼培育水温从23℃逐步降低至20℃再逐步升温至25℃不再升高，升温和降温频率控制在每20天升高或降低1℃；至第二年5月份准备繁殖时，鞍带石斑鱼亲鱼从25℃升温至30℃不再升高，升温频率每3天升高1℃；棕点石斑鱼从25℃升温至28℃不再升高，升温频率每3天升高1℃；

4）、营养强化：营养强化选择在第二年2月份进行，强化时间选择亲鱼培育水温由最低值开始上升的过程中进行，营养强化包括增加鱿鱼、维生素C、维生素E、裂壶藻；

5）、精子超低温冷冻保存：第二年5~6月份开始进行鞍带石斑鱼精子超低温冷冻保存，通过镜检的方式确定雄鱼发育及精子质量情况，选择发育成熟、成活率达到95%以上的精子进行超低温冷冻保存；按照精子与冷冻稀释液体积比1:1将精子加入到冷冻稀释液中，一并置于液氮中保存备用；其中冷冻稀释液的配比是：每升葡萄糖24g，氯化钠8g，碳酸氢钠0.08g，二甲基亚砜10mL，胎牛血清10mL，余量为去离子水；

6）、雌性亲本催产：第二年5月份开始对棕点石斑鱼雌鱼进行镜检，挑选腹部明显膨胀，卵巢发育至Ⅳ期的雌鱼放养在培育池内，水温维持28℃；对棕点石斑鱼雌鱼进行药物注射催产，注射所用催产剂配置方法：取400 ~800IU/kg鱼体重的HCG和2~3ug/kg鱼体重的LRH- A3，混合后加0.9%的生理盐水2ml/条鱼溶解；将催产剂一次性进行鱼体注射，注射部位为背部肌肉。注射后效应时间约为36小时；

7）、人工授精：对催产后腹部柔软轻压有透明卵流出的棕点石斑雌鱼，进行人工挤卵，使用玻璃或塑料容器接收；将鞍带石斑鱼冷冻精液在37℃水浴中快速复温解冻，按照精、卵数量比1：1000的比例混合均匀，干法授精，将受精卵放在孵化槽内，孵化20小时左右，收集上浮发眼卵。

所述的棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼的一种工厂化杂交育种方法，其特征在于还包括以下步骤：采用臭氧消毒方式对上浮发眼卵进行消毒，水温应控制在25~26℃，水体臭氧浓度0.3~0.5ppm，每次网袋放入约1000ml受精卵，消毒时间1分钟，消毒时受精卵须充分浸入溶有臭氧的消毒水中。 

本发明的积极效果在于：采用人工促熟技术，对棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼亲鱼发育进行人工调控，实现了北方春季育苗的工厂化实施；采用鞍带石斑鱼精子超低温冷冻保存技术，突破了鞍带石斑鱼雄鱼与棕点石斑鱼雌鱼亲本性成熟时间不一致的瓶颈，实现工厂化杂交育种；采用了受精卵臭氧消毒技术，降低了细菌、病毒性疾病从受精卵到苗种的垂直传播的几率，使杂交品种仔稚鱼成活率提高到40%。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步说明本发明： 

1、亲本筛选

杂交育种选择鞍带石斑鱼作为雄性亲本，棕点石斑鱼作为雌性亲本。鞍带石斑鱼选择6~10龄亲鱼，棕点石斑鱼选择4~5龄亲鱼；亲本应选择选择体表光滑、无伤、无疾病的健康个体。

2、亲本培育 

将雌雄亲本分别放养于不同亲鱼培育池内，养殖池尺寸6m×6m×3m，每池放养5~10尾，棕点石斑鱼养殖水温保持在20~38℃（不同时期对于温度的要求不同），鞍带石斑鱼养殖水温保持在20~30摄氏度（不同时期对于温度的要求不同）；亲本饵料为鲐鱼、鲅鱼的任一种或者两种的任意比例混合投喂，投喂量根据水温变化而定，水温≥24℃时2天投喂1次，20~23℃时每周投喂2次，每次投喂量占鱼体体重的1%。

3、人工促熟技术：本发明的人工促熟技术主要采用控温的方式，通过调控亲鱼培育的水温度，从而控制育苗时间在每年6月份。具体措施为：一般从第一年的12月份开始，亲鱼培育水温从23℃逐步降低至20℃再逐步升温至25℃不再升高，升温（降温）频率控制在每20天升高（降低）1℃。至第二年5月份准备繁殖时，鞍带石斑鱼亲鱼从25℃升温至30℃不再升高，升温频率每3天升高1℃；棕点石斑鱼从25℃升温至28℃不再升高，升温频率每3天升高1℃。 

4、营养强化：营养强化选择在第二年2月份进行，强化时间选择亲鱼培育水温由最低值开始上升的过程中进行，营养强化主要增加鱿鱼、维生素C、维生素E、裂壶藻等。 

5、精子超低温冷冻保存：第二年5~6月份开始进行鞍带石斑鱼精子超低温冷冻保存。通过镜检的方式确定雄鱼发育及精子质量情况，选择发育成熟、成活率达到95%以上的精子进行超低温冷冻保存。按照精子与冷冻稀释液体积比1:1将精子加入到冷冻稀释液中，一并置于液氮中保存备用。其中冷冻稀释液的配比是：以1L溶液为例，需葡萄糖24g，氯化钠8g，碳酸氢钠0.08g，二甲基亚砜（DMSO）10mL，胎牛血清（FBS）10mL，用去离子水定容至1L。 

6、雌性亲本催产：第二年5月份开始对棕点石斑鱼雌鱼进行镜检，挑选腹部明显膨胀，卵巢发育至Ⅳ期（Ⅳ期特征：卵巢呈青灰色稍带棕黄色，卵粒明显，放置固定液中可游离脱落。）的雌鱼放养在尺寸6m×6m×3m的培育池内，水温维持28℃。对棕点石斑鱼雌鱼进行药物注射催产。注射所用催产剂配置方法：取人绒毛膜促性腺激素（HCG）400 ~800IU/kg鱼体重和促排卵素3号（LRH- A3）（促排卵素3号属于促黄体生成素释放激素类似物）2~3ug/kg鱼体重，混合后0.9%的生理盐水2ml/条鱼溶解，配置成催产剂。将催产剂一次性进行鱼体注射，注射部位为背部肌肉。注射后效应时间约为36小时，可进行人工挤卵。间隔3天后可重复进行催产。 

7、人工授精：对催产后腹部柔软轻压有透明卵流出的棕点石斑雌鱼，进行人工挤卵，使用玻璃或塑料容器接收；将鞍带石斑鱼冷冻精液在37℃水浴中快速复温解冻，按照精、卵数量比1：1000的比例混合均匀，干法授精，将受精卵放在孵化槽内，孵化20小时左右，收集上浮发眼卵。 

8、受精卵消毒：采用臭氧消毒方式对上浮发眼卵进行消毒，采用20L消毒槽，水温应控制在25~26℃，水体臭氧浓度0.3~0.5ppm，每次网袋放入约1000ml受精卵，消毒时间1分钟，消毒时受精卵须充分浸入溶有臭氧的消毒水中。