一株具有完全反硝化酶系的兼性厌氧反硝化细菌及其用途

摘要

本发明为一株具有完全反硝化酶系的兼性厌氧反硝化细菌，该菌株命名为Pseudomonassp.XP-2，属于假单胞菌属，保藏编号为CCTCC M 2011431。最佳脱氮温度在10-30℃。该菌株适应的pH值在6～9之间，具有高效的反硝化活性。当C/N(mol/mol)比值大于等于3时，该菌株的脱氮率达90%以上。该菌株在微溶氧的环境条件下，脱氮活性最高。反硝化的终产物气体为氮气，说明该菌株具有完全的反硝化能力，能够将水体中硝氮、亚硝氮等无机氮直接还原为无害的氮气排出水体。该菌株具有广泛的碳源谱，能够利用多种碳源。通过对此菌株的性能检测可以看出，使用其处理含氮废水工艺简单，处理效果高效稳定，节约运行成本，且不会产生NO、N

说明书

技术领域

本发明涉及一株具有完全反硝化酶系的兼性厌氧反硝化细菌及其用途，属于环境微生物领域。 

背景技术

随着工农业生产的发展和人们生活水平的提高，我国含氮污染物的排放量迅速增加，大小水体成为这些污染物的“收容所”，水体质量急剧恶化。目前，全国各地已经建立起了一大批废水生物处理工程，有效地遏制了水质污染持续恶化的势头。但是，污水二级处理后的排放水含氮量依然较高，俨然成为一个严重的环境污染源。在二级生化处理后出水中氨氮和硝态氮是氮的主要存在形式。氮素污染会对水环境以及人们的生产生活造成严重的的危害，主要表现在：（1）加速水体的富营养化；（2）增加给水处理的困难；（3）消耗水体中的溶解氧；（4）对水生生物有毒害作用。因此，必须加大对污水中氮素的治理。 

对于氮素污染的治理，生物脱氮是最经济有效的治理技术。生物脱氮技术通常由硝化工艺和反硝化工艺组成。硝化工艺以去除氨氮为主，虽然能够把氨氮转化为硝酸盐，但是不能彻底将氮素从水体中除去；反硝化工艺则能从根本上消除水体氮素对环境的污染。反硝化作用是反硝化细菌以硝态氮或亚硝态氮为终端电子受体，在反硝化酶系的作用下通过电子传递，将硝态氮或亚硝态氮逐步还原为氮气的过程。从NO3^-还原到N2的脱氮反应通常由以下四步 

组成：NO₃^-→NO₂^-→NO→N₂O→N₂

一般在缺氧的情况下，兼性厌氧反硝化菌首选硝酸盐进行其呼吸作用，将NO₃^--N还原为N₂，生化反应式为： 

NO₃^-+6H⁺+5e^-=1/2N₂(g)+3H₂O 

反硝化细菌是反硝化作用发生的主体，探明反硝化细菌的种属及特性，搞清它们的营养条件和环境条件，将有助于废水生物脱氮工艺的研究、开发和应用。 

细菌的反硝化是在各种还原酶的催化作用下完成的，各反应酶系的活性高低受温度、pH值、溶解氧、C/N比等条件的影响。理论上讲，反硝化作用要求C/N为4.6（质量比），但由于细胞的生长繁殖也会消耗溶解性有机碳，实际情况下，要求C/N>4.6。因此，多数情况下，可溶性有机碳成为水环境中反硝化作用的限制因子。pH值也是影响反硝化速率和反硝化终产物的一个重要的环境因子。对反硝化细菌的生长来说，最佳pH值为6.5～7.5。在此pH范围内，反硝化速率最大，当pH值不在最佳范围时，反硝化速率降低。废水生物处理中的反应 温度，对微生物的生长、繁殖关系密切，温度支配着酶反应动力学、微生物生长速度以及化合物的溶解度等，因而对污染物的降解转化起着关键作用，溶解氧（DO）的存在对反硝化过程有很大影响。如果反应器的溶解氧过多，将会对反硝化菌的异化作用发生抑制作用。因此考察温度、pH、溶解氧、C/N比等因素对反硝化菌株发挥高效反硝化活性的影响，进而获得高效反硝化菌株，实现废水高效经济脱氮，对解决日益严重的水环境氮素污染问题具有重要意义。 

许多细菌具有将硝酸盐还原为亚硝酸盐的酶，可实现第一步转化，但要完成彻底脱氮，则要求细菌必须具有完整的反硝化酶系。探明反硝化细菌是否具有完整又高效的反硝化酶系是采用生物反硝化工艺脱氮的先决条件。研究发现本发明细菌具有完整的反硝化酶系，能够高效去除水体中的氮素，将硝态氮还原为氮气排出体外，实现废水高效脱氮，为解决日益严重的含氮废水对环境的污染问题作出贡献。 

发明内容

针对以上问题，本发明的目的是提供一株具有完整反硝化酶系的高效兼性厌氧反硝化细菌。该细菌具有完全的反硝化酶系，能够彻底脱除水体中的氮素，不产生NO、N₂O等有害气体。 

本发明的另一个目的是提供一种培养条件，使该细菌能够表现出更强的异养反硝化活性。 

本发明的另一个目的是提供一种培养条件，使该细菌表现出完全的反硝化活性。 

本发明可以通过以下技术方案实现： 

本发明中的菌种是一株兼性厌氧反硝化细菌，该菌株命名为施氏假单胞菌xp-2，Pseudomonas stutzeri xp-2，属于施氏假单胞菌，已于2011年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011431。其菌学特征为：细胞呈短杆状，革兰氏阴性菌，菌落圆形、浅黄色、中凹、有光泽、边缘整齐。该菌株能够利用多种碳源，其中以乙酸钠为最适碳源。适宜温度在10～30℃的微氧条件下进行脱氮，最佳C/N（mol/mol）为3，适合的pH值范围为6.0～9.0。在此条件下脱氮，无亚硝酸盐积累。 

该菌株能够有效脱除水体中的氮元素，适用于较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理，该菌株具有广泛的适应性。其最佳脱氮条件为：温度10～30℃，pH 6.0～9.0，最佳C/N为3，溶解氧为微溶氧条件（＜0.5mg/L）。 

具体应用时，使用方法为： 

（1）使用前用LB培养基活化菌株：将斜面培养基上保存的施氏假单胞菌XP-2用接种环刮取1环菌苔，接种入装有100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，30℃摇床震荡培养培 养12h，即可获得菌液。 

（2）将活化后的菌液接种于待处理的含氮废水中，投加量为受处理废水体积的10%，pH值范围在7.0～9.0之间，室温静置培养，定时取样检测水样中硝氮去除情况及亚硝酸盐的积累情况。 

（3）检测方法 

CODcr：重铬酸钾法； 

TN：过硫酸钾氧化-紫外分光光度法； 

NO₃^--N：紫外分光光度法； 

NO₂^--N：N-（1-萘基）-乙二胺光度法。 

OD值：采用UV-2450紫外分光光度计(Shimadzu)，在波长600nm下测定培养液的OD值。 

本发明的菌株是从南四湖香蒲植物根际土壤中筛选得到的一种具有高效脱氮活性的反硝化细菌，可以通过反硝化作用脱除水体中的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。该菌株具有完全的反硝化能力，能够将硝态氮逐步还原为氮气排出水体，适用于较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理，该菌株具有广泛的碳源谱，能够利用多种碳源，具有广泛的适用性。使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮彻底，效果稳定，节约运行成本。 

本发明中的脱氮是指水体中无机氮的去除，无机氮是指NH₄⁺、NO₃^--N和NO₂^--N。 

本发明中的C/N比是指碳元素与氮元素的物质的量之比。 

本发明中的微溶氧条件是指废水在静置且接触空气的条件下，溶解氧浓度在0.5mg/L以下。 

本发明的菌株具有以下优点： 

（1）本发明菌株具有完全的反硝化酶系，能够将硝态氮直接还原为氮气，实现彻底脱氮且不污染空气。 

（2）本发明菌株具有非常高的反硝化活性，可用于处理较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水。 

（3）本发明菌株具有广泛的碳源谱，能够利用多种碳源，具有很好的适应性。 

附图说明

本发明的菌株命名为施氏假单胞菌xp-2 Pseudomonas stutzeri xp-2，属于施氏假单胞菌，已于2011年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011431。 

图1：假单胞菌XP-2菌体的扫描电镜照片。 

图2：假单胞菌XP-2的生长曲线和总氮去除率。 

具体实施方式

实施例1 本发明菌株的分离鉴定： 

（1）培养基： 

A、菌株分离、纯化、保藏培养基（/L）： 

CH₃COONa，2g；蛋白胨，15g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；琼脂，12g；KNO₃，1.5g；pH控制在7.0～7.2。 

B、菌株筛选、脱氮培养基（DM：Denitrifying Medium）（/L）： 

CH₃COONa，2g；KH₂PO₄，0.4g；MgSO₄·7H₂O，0.6g；CaCl₂·2H₂O，0.07g；KNO₃，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。 

C、LB培养基（/L）： 

蛋白胨，10g；酵母膏，5g；氯化钠，10g；pH控制在7.5。 

（2）假单胞菌XP-2菌株的分离、纯化： 

称取10g香蒲植物根际土壤样品置于250mL三角瓶中，加100mL无菌水及几粒玻璃珠，摇床振荡15min使土样分散均匀。待土样分散后，静置5min后，吸取1mL土壤悬液至9mL稀释液（无菌水），得到10^-2稀释度悬液，依次按10倍稀释法稀释至10^-7，由此制得各稀释度土壤悬液。 

分别吸取各稀释度悬液0.1mL至反硝化细菌分离用固体培养基上（已放置过夜，无杂菌生长），用玻璃刮刀将土壤悬液涂布均匀。之后将平板倒置，放入30℃恒温培养箱，培养至长出明显菌落。 

挑取单菌株，在平板上多次划线纯化本发明中的假单胞菌XP-2，直至显微镜下观察显示无杂菌为止，此时可认为菌株已纯化完毕。分离出的菌株在含有硝酸盐的固体培养基上生长良好，具有潜在的反硝化特性，接种至斜面培养基保存备用。 

（3）假单胞菌XP-2的硝酸盐还原产气试验 

为了解本发明菌株的反硝化能力和特性，对本发明菌株进行硝酸盐还原产气试验。 

接种：于小试管（规格：15mm×100mm）中加入10mL灭菌的反硝化液体培养基，用接种环挑取纯化后的菌落1环至小试管中，搅拌混匀。之后加入1mL的灭菌后的液体石蜡封口。以未接种菌株的试管作为空白对照。制作完毕后将所有试管一同置入30℃恒温培养箱静置培养。培养一段时间后，观察发现石蜡与培养基之间有气泡生成，证明本发明菌株具有反硝化能力。 

（4）假单胞菌XP-2的菌落形态特征： 

在培养基A上培养2天后，长出圆形菌落、浅黄色、中凹、有光泽、边缘整齐。 

（5）假单胞菌XP-2的菌体形态特征： 

扫描电镜观察表明菌体呈短杆状，550nm～640nm×1100nm～2000nm。 

（6）16S rDNA的PCR扩增与测序： 

实验仪器：小型离心机（Eppendorf，转速>12000r/min）；电泳仪（北京六一仪器厂）；PCR热循环扩增仪（Eppendorf）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。 

实验方法：从菌株XP-2的新鲜斜面上直接挑取菌体，加入至含100μL双蒸水的离心管中，旋涡混匀后，热裂解菌悬液，以基因组DNA为模板扩增16S rDNA，扩增引物为一对通用引物。 

正向引物为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’； 

反向引物为1492R：5’-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。 

PCR反应在50μL体系中进行。反应体系的组成为：模板DNA(50ng/μL)2μL；dNTP混合物4μL；TaqDNA聚合酶0.25μL；正向引物2μL；反向引物2μL；双蒸水34.75μL。 

PCR扩增条件：95℃变性5min；95℃ 30s,55℃ 45s,72℃ 1min 30s，循环30次；72℃延伸10min，4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶对菌株的16S rDNA扩增产物做电泳检测，验证后切下胶条，用DNA凝胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司）纯化PCR产物。回收后的PCR扩增产物委托山东省农科院高新技术中心进行测序。 

（7）16S rDNA序列分析与系统发育分析： 

测序后得到XP-2菌株的16S rDNA长度为1430bp的序列，提交到Genbank与其他菌株进行比对，发现菌株XP-2与Pseudomonas sp.的进化距离最为接近，确定其属于假单胞菌属，命名为施氏假单胞菌xp-2 Pseudomonas stutzeri xp-2。 

实施例2 本发明菌株的培养 

（1）所使用的培养基 

A、菌株保藏培养基（/L）：蛋白胨，5g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；琼脂，12g；KNO₃，1.5g；pH控制在7.0～7.2。 

B、菌株反硝化培养基（DM：Denitrifying Medium）（/L）：CH3COONa，2g；KH₂PO₄，0.4g；MgSO₄·7H₂O，0.6g；CaCl₂·2H₂O，0.07g；KNO₃，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。 

上述培养基使用前，121℃，灭菌20分钟。 

（2）培养条件 

将在保藏培养基斜面上保存的假单胞菌XP-2用接种环刮取1环菌苔，接种入装有100mL已灭菌的LB培养基的250mL锥形瓶中，30℃恒温振荡培养12h，即可获得种子液。实验时，按10%的接种量将种子液接种于反硝化培养基或是废水中。 

实施例3 本发明菌株的最佳脱氮条件 

将100mL已灭菌的反硝化培养基装入250mL三角瓶中，按照10%的接种量接入种子菌液，静置培养。在10～30℃范围内，假单胞菌XP-2能够去除80%以上的总氮，在25℃时总氮去除率最高，达95%。本发明菌株适应的pH值在6～9之间，能够将约140mg/L的总氮降到10mg/L以下，且没有亚硝酸盐积累。本发明菌株的最适C/N(mol/mol)比为3，当C/N≥3时，总氮的去除率能达90%以上。静置培养的微溶解氧环境最适合于本发明菌株反硝化活性的发挥。 

实施例4 本发明菌株具有完全的反硝化酶系 

在1L的三角瓶中装满接种了10%种子液的反硝化培养基，密封瓶口，室温下静置培养。用气体收集袋收集实验过程中释放的气体，然后通过气象色谱质谱联用分析仪(GC-MS)分析气体成分。结果显示该气体分子量为28，且与氮气的相似度最高，推断该气体为N₂，无其他气体。证明本发明菌株具有完全的反硝化酶系，能够将硝态氮直接还原为N₂，能够发挥完全的反硝化活性，没有NO、N₂O等有毒有害中间产物气体的生成。因此，本菌株适宜于工程应用。