一株生产自絮凝物质的斜生栅藻及其在微藻采收中的应用

摘要

一株生产自絮凝物质的斜生栅藻及其在微藻采收中的应用，属于微生物应用技术领域，该藻株分类命名为斜生栅藻（Scenedesmus obliquus），藻株的登记入册编号为CGMCC No.6567，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年9月14日。该栅藻AS-6-1生产的絮凝物质可快速絮凝采收非絮凝藻株淡水栅藻FSP-3，淡水小球藻CNW-11以及海水小球藻DUT01，在微藻采收方面具有广阔的应用前景。上述的絮凝物质从自絮凝栅藻AS-6-1细胞壁中分离纯化得到，是一种水溶性多糖，用0.6mg/L该絮凝物质处理非絮凝栅藻FSP-3，絮凝效率可达到80%；最适宜pH值7.0，最适宜温度30℃，絮凝活性不需要金属离子，具有省时、高效的特点，并具有良好的pH稳定性和热稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及一株生产自絮凝物质的斜生栅藻及其在微藻采收中的应用，属 于微生物应用技术领域。

背景技术

近年来，随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上 升，化石能源短缺危机已迫在眉睫，对生物质能等可再生能源的关注渐成热点。 在众多的非粮生物质中，藻类具有分布广泛、环境适应能力强、光合效率高（太 阳能的利用率可达3-8%）、生长周期短（一般代时为1-10天）、油脂含量高（油 脂含量可达干重的40-86%）、产量高（每年每公顷可产油58,700L，是其他产 油作物的1-2倍）等特点，利用藻类生产生物燃料具有广阔的发展前景。此外， 微藻还可以生产色素、脂肪酸及药物等高附加值产品，因此具有重要的应用价 值。

由于微藻细胞个体小（约为5到50μm），培养密度低含水量大（为15到 108g/L），细胞表面带有负电荷等特点，微藻的采收比较困难，现有微藻的采收 方法主要有离心法、过滤法、气浮法及化学絮凝法。但离心法耗能大成本高； 过滤法依赖于藻细胞大小，不适用大规模微藻收集；而气浮法成本高操作复杂； 相比之下化学絮凝虽能达到较好的微藻收集效果，但是大量金属离子以及难降 解高聚合物的添加无疑增加了下游处理的工作难度，并对环境具有一定毒性。 因此，开发微藻低成本的高效采收方法是进行微藻生物炼制及大规模工业化生 产微藻能源的重要保证。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是针对上面所述的现有技术，提供一种絮凝效 果明显、环境友好、生物安全的采收方法—通过藻细胞自絮凝进行微藻的采收。

本发明的目的在于提供一株具有天然自絮凝能力的斜生栅藻生长情况及细 胞组成，提供自絮凝物质的鉴定，提供一种分离纯化上述自絮凝物质的方法， 提供自絮凝物质的絮凝性能及应用。

本发明采用的技术方案是：一株生产自絮凝物质的斜生栅藻（Scenedesmus  obliquus）的登记入册编号为CGMCC No.6567，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年9月14日。

所述斜生栅藻包括绿藻门、绿球藻目、真集结亚目、栅藻科和栅藻属。

所述斜生栅藻中分离纯化得到絮凝物质应用在微藻采收中。所述絮凝物质是 一种高分子多糖，其分子量为1.279×105Da；0.6mg/L絮凝物质处理非絮凝栅藻 FSP-3藻株20min，絮凝效率即可达到80%；pH4-9时絮凝活性良好，最适宜 pH值7.0；温度在30℃时絮凝活性良好，121℃高温处理20min后絮凝活性仍 保持在50%以上，具有良好的热稳定性。

上述的斜生栅藻是从台湾南部淡水中筛选到的一株具有天然自絮凝能力的 藻株。经23S rDNA序列比对，其与Scenedesmus obliquus具有较高相似性(96 %)，结合生理形态鉴定，确定该藻株为斜生栅藻。该藻株在优化的DM液体培 养基中，28℃培养4-5天即可见藻细胞聚集在一起，颗粒大小肉眼可见；将13 天的培养液静止静置过夜，藻细胞聚集在一起沉降到锥形瓶底部，上清液清澈 可见。

本发明进一步分离鉴定了导致斜生栅藻产生自絮凝现象的物质。分离纯化 得到的絮凝物质是一种高分子多糖，同时具有省时，高效以及较好的pH稳定性 和热稳定性等特性。0.6mg/L絮凝物质处理非絮凝栅藻FSP-320min，絮凝效率 即可达到80%；在pH5-9范围内絮凝活性良好，均在40%以上，最适宜pH值 7.0；在20-60℃温度范围内絮凝活性良好，均在66%以上，121℃高温处理20min 后絮凝活性仍保持在50%以上；此外，絮凝活性不依赖于金属离子，虽然高价 的Al³⁺、Fe³⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对絮凝物质絮凝活性有一定的促进作用，但促进效果 不明显。目前，这种天然自絮凝微藻的絮凝物质还未曾有报道。

本发明中自絮凝斜生栅藻所生产絮凝物质可对多种非絮凝微藻包括淡水栅 藻FSP-3，淡水小球藻CNW-11以及海水微拟球藻DUT-01有良好的絮凝作用， 其中对淡水栅藻FSP-3的絮凝效果最佳。

本发明的有益效果是：这种斜生栅藻生产的絮凝物质可快速絮凝采收非絮 凝藻株：淡水栅藻FSP-3、淡水小球藻CNW-11以及海水小球藻DUT01，在微 藻采收方面具有广阔的应用前景。上述的絮凝物质从自絮凝斜生栅藻细胞壁中 分离纯化得到，是一种水溶性多糖，用0.6mg/L该絮凝物质处理非絮凝栅藻 FSP-3，絮凝效率可达到80%；最适宜pH值7.0，最适宜温度30℃，絮凝活性 不需要金属离子，具有省时、高效的特点，并具有良好的pH稳定性和热稳定性。

附图说明

图1为自絮凝斜生栅藻的生长及絮凝情况。

图2为自絮凝斜生栅藻生长状态。

图3为自絮凝斜生栅藻培养液中絮凝活性的分布情况。

图4为自絮凝斜生栅藻絮凝物质原位显色反应结果。

图中：A.苯胺-邻苯二甲胺反应；B：茚三酮反应；C：磷钼酸反应。1.标准 物质：A1：葡萄糖、B1：组氨酸、C1：卵磷脂；2.对照；3、4.自絮凝微藻絮 凝物质。

图5为自絮凝斜生栅藻絮凝物质的红外图谱。

图6为自絮凝斜生栅藻絮凝物质高效性结果。

图7为自絮凝斜生栅藻絮凝物质处理时间结果。

图8为自絮凝斜生栅藻絮凝物质pH稳定性结果。

图9为自絮凝斜生栅藻絮凝物质热稳定性结果。

具体实施方式

实验材料和试剂

1.菌株

斜生栅藻从台湾南部淡水中分离获得。

2.生化试剂

D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、葡萄糖醛酸AR，Sigma公司；L-岩藻糖、 L-鼠李糖，AR，Treechem公司；其它试剂均为国产分析纯。

3.培养基

优化的DM培养基：ddH₂O,1L;Ca(NO₃)₂·4H₂O,1.00g;KH₂PO₄,0.26g; MgSO₄·7H₂O,0.55g;KCl,0.25g;FeSO₄·7H₂O,0.02g;EDTA·2Na,0.2g;H₃BO₃, 0.0029g;ZnCl₂,0.00011g;MnCl₂·4H₂O,0.00181g;(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O,0.000018 g;CuSO₄·5H₂O,0.00008g，pH6.0-6.2。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，参照《分子克隆实 验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，生化实验方法，参 照《生物化学原理和方法》（第一版）李建武等一书所列的具体方法进行或者按 照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：本发明自絮凝斜生栅藻的培养。

本发明自絮凝斜生栅藻来源于台湾南部的淡水水体，最适宜培养条件如下： 初始培养基的pH 6.0-6.2；起始浓度约在O.D.685nm 0.05-0.1；培养温度为28℃； 光强60μmol m^-2s^-1；光照周期：16h光照培养，8h黑暗培养。在优化的DM液 体培养基中培养至4-5天时，该藻细胞多呈聚集状态，聚集体大小肉眼可见，将 13天的培养液静止静置过夜，藻细胞聚集在一起沉降到锥形瓶底部，上清液清 澈可见。电镜下观察发现藻细胞外有膜状物质将细胞包裹粘附在一起（图1）。 实施例2：提取自絮凝斜生栅藻基因组，以及其23S rDNA的获得。

1.提取自絮凝斜生栅藻基因组DNA

将自絮凝斜生栅藻接种于500mL的DM液体培养基中，在28℃下培养11天，此 时正处于对数生长期。8000r/min离心5min，收集藻体，洗涤液清洗藻体，离心 后重复一次清洗。采用试剂盒Qiagen DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen,Valencia, CA)提取得到自絮凝斜生栅藻基因组DNA。

2.23SrDNA序列的获得

23S rDNA PCR引物如下：

P1：5’-GGA CAG AAA AAC CCT ATG-3’

P2：5’-CCT TTT CC CTA GAG TAAC-3’

PCR反应条件如表1所示：

表1 PCR反应条件

PCR反应体系如表2所示：

表2 PCR反应体系

PCR产物送宝生物公司测序，其23S rDNA序列见序列表。

实施例3：自絮凝斜生栅藻的生长情况及生物质含量的测定

自絮凝斜生栅藻接种于优化的DM液体培养基，培养至5-13天时，藻快速 生长，藻细胞数目迅速增加，氮含量明显降低，在整个培养过程中pH变化不大， 最高值不超过8，且未见无机沉淀物（图2）。培养16天后自絮凝藻生物质中蛋 白质含量可达干重的28.4±1.3%，碳水化合物占25.3±1.0%，脂类占22.9±1.1 %，叶绿素高达13.0±0.6%，表明本发明藻株具有广泛的应用前景。

实施例4：自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的分离纯化

1.絮凝效率的测定

将絮凝物质粗提物或纯化物溶于蒸馏水，制成1mg/mL溶液，加到上10mL 非絮凝微藻中，震荡混匀30s，立即测各藻液此时在680nm下测吸光度OD680 (t₀)；静置20min后，取同样液面高度的藻液测其在680nm下测吸光度OD680 (t₁)；按照如下计算公式[1]进行计算得絮凝活性。

式中OD680(t₀)：藻与絮凝粗提物溶液混合后立即测定的680nm的吸光度； OD680(t₁)：藻与絮凝物溶液混合后，静置20min的吸光度。

2.本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的分离

量取500mL自絮凝斜生栅藻培养液进行离心，分离得藻体和上清。上清液 40-50℃旋转蒸发浓缩，浓缩后的藻液37℃以终浓度5mg/mL的Pronase E酶 解1h，上清液加入三倍体积95%乙醇4℃醇沉过夜，次日离心，沉淀物进行 真空冷冻干燥，所得即为白色胞外絮凝物质粗提物；藻体经细胞破碎法后，采 用如上清所述的方法进行处理，即可得到胞壁絮凝物质的粗提物。将分离得到 的物质进行絮凝活性测试，结果如图3所表明絮凝活性主要存在于细胞壁。

将细胞壁絮凝物质粗体物，经超滤浓缩、乙醇沉淀、丙酮洗涤、冷冻干燥 后，得到白色粉末，膨松、无嗅无味、易溶于水、略溶于低浓度乙醇，不溶于 高浓度乙醇、丙酮等有机溶剂的絮凝物质粗体物。

3.自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的纯化

（1）透析

将絮凝粗提物复溶于同等体积藻液体积的蒸馏水中，装入透析袋（透过分 子量8000）自来水流水透析48h后，蒸馏水透析24h。

（2）离子交换柱层析

将透析过的絮凝物质，上Tris缓冲液预平衡好的DE52纤维素离子交换柱。 先用蒸馏水洗脱，然后用0-2.0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1.0mL/min， 每管5mL分部收集，采取如前所述的絮凝活性测定方法，将对非絮凝微藻具有 良好絮凝作用的组分合并相。

（3）絮凝粗提物的凝胶过滤柱层析

将离子交换收集到的具有絮凝活性的组分经Sephacryl S-400柱层析进一步 纯化，0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.2mL/min，以5mL/管的量自动收集， 检测方法同上，收集、合并絮凝活性组分的洗脱液，真空浓缩，流水透析48h， 蒸馏水透析48h，冷冻干燥后得白色絮凝物质纯品。

实施例5：本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质相关理化性质

将实施例4中纯化得到的絮凝物质，利用多种方法进行理化性质分析。

1.本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的定性分析

（1）本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的原位显色反应

将分离纯化得到的絮凝物质通过薄层原位显色反应鉴定其性质。测试结果 如图4，发现絮凝物质仅与苯酚-邻苯二甲胺试剂反应成有色物质，而与茚三酮 反应、磷钼酸反应均为阴性，实验结果证明该絮凝物质中含有多糖。

（2）本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的紫外光谱分析

将分离纯化的本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质制成浓度为1mg/mL溶 液，以蒸馏水做空白对照，用紫外分光光度计UV5500于波长220-400nm范围 进行连续扫描，以吸光度为纵坐标，波长为横坐标作图。结果显示从220nm到 400nm吸光值呈下降趋势，没有出现核酸(260nm)和蛋白质(280nm)的特征吸收 峰，这说明该絮凝物质中不含有核酸和蛋白质组分。

（3）本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质红外图谱结构解析

取分离纯化的本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质1mg，加入20mg溴化 钾于研钵内，红外线灯下研磨呈细面状，在压片器中压成薄片，用 NICOLET560(美国)型红外光谱仪在4000-500cm^-1波长范围内扫描得到的红外 光谱。如图5所示本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质在此区均具有多糖类物 质的一般特征吸收峰。在3200cm^-1-3600cm^-1附近出现一种强吸收峰，为糖分子 中-H的伸缩振动峰，表明多糖中存在分子内和分子间的氢键；在2800cm^-1-3000 cm^-1(2920cm^-1附近)的吸收峰是C-H的伸缩振动峰，这一区域的吸收峰是糖类 的特征吸收峰；1730cm^-1-1600cm^-1之间(1630cm^-1处)的中强吸收峰是-CHO的 C=O伸缩振动造成的；1455cm^-1附近的吸收峰可能是糖醛酸中COOH伸缩振动 的特征峰；1775cm^-1-1735cm^-1之间无吸收峰，说明无乙酰酯；1000cm^-1-1200cm^-1间比较大的吸收峰是由两种C-O伸缩振动所引起的，其中一种是属于C-O-H的， 另一种是糖环的C-O-C；1047cm^-1附近的强吸收峰证明其中的单糖以吡喃糖苷 的形式存在；890cm^-1附近无吸收峰，说明多糖含α-糖苷键，不含β-糖苷键；600 cm^-1附近的无吸收峰，说明不含有C-X(卤素)的伸缩振动峰（表1）。

表1.自絮凝斜生栅藻絮凝物质红外图谱解析结果

（4）元素分析

准确称取本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质10mg，105℃烘干处理30min 后用PE-2400型元素分析仪进行元素分析，结果见表2。根据表中C,H,O的原 子个数比，可以计算出C:H:O=1:2:1，基本上符合糖的通式Cn(H₂O)n，与之前的 分析结果一致，进一步确定纯化的絮凝物质是糖类化合物。另外在该糖中含有 少量的氮和硫元素。红外谱分析在1623cm^-1的吸收峰，可以确定是一种粘多糖； 在该糖中含有氨基和硫酸根。

表2.自絮凝斜生栅藻絮凝物质元素分析结果

2.本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的定性分析

（1）本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的糖分分析

用蒽酮显色法及咔唑硫酸法Elson-Morgan法测定絮凝物质中中性糖，糖醛 酸及氨基糖成分。将蒽酮-硫酸试剂加入到该絮凝物质样品溶液中，反应后溶液 呈蓝绿色，证明该絮凝物质含有中性糖；咔唑硫酸法试剂加入到样品溶液中， 反应后溶液呈紫红色，证明该絮凝物质含有糖醛酸；经三氟乙酸水解后的絮凝 物质通过Elson-Morgan反应溶液呈红色，证明其中含有氨基糖。综上结果絮凝 物质中含有多糖，其中中性糖、酸性糖和氨基糖的含量（质量分数比）比为16: 9:1。

将本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质经三氟乙酸水解后经皂化及乙酰化 后，采用GC-MS分析单糖组分，程序升温起始温度为170℃，保持2min，再 以2℃/min升至240℃，氦气为载气，流速1mL/min，离子源200℃。结果表 明，该絮凝物质由葡糖糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖及果糖组成，其摩尔比为8： 5：3：2：1。

（2）分子量测定

将本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质及各种标准多糖分别制成浓度为0.2 %（W/V）的水溶液，16000r/min离心3min，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤， 采用满环进样方式。测试条件：采用凝胶排阻色谱柱：TSK-G4000PW（7.5×300） 和TSK-G5000PW（7.5×300）；柱温40℃；流动相：二次纯净水；流速：0.5mL/min； RI示差检测器。GPC实验结果表明分离得到的絮凝物质为纯品，其分子量为 1.279×10⁵Da。

实施例6：本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的絮凝性能及应用

1.自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的活性测定

将实例4中纯化得到的絮凝物质制成水溶液测定其对不同非絮凝微藻的絮 凝活性。取10mL OD0.6的非絮凝栅藻FSP-3，非絮凝淡水小球藻CMW-11，非 絮凝海水微拟球藻DUT01，分别加入终浓度为0.6mg/L的絮凝物质，在25℃处 理30min的絮凝物质按照同样的方法，进行絮凝活性测定。结果表明，本发明 自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质对三种藻都有絮凝作用，其中对非絮凝栅藻FSP-3 的絮凝效果最好，处理5min后絮凝效率即可达到85%。

2.自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的最适宜剂量测定

将实例4中纯化得到的絮凝物质制成不同浓度的水溶液絮凝非絮凝栅藻 FSP-3以测定其最适宜浓度。在10mL OD 0.6的非絮凝栅藻FSP-3中分别加入 终浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，1.0mg/L的絮凝物质，震荡混匀30s， 立即测各藻液此时在680nm下测吸光度OD680(t₀)；静置20min后，取同样液 面高度的藻液测其在680nm下测吸光度OD680(t₁)；按照公式[1]进行计算得絮 凝活性。本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质不同剂量测定结果（图6）所示， 絮凝剂浓度为0.5mg/L时，絮凝效率在75%，絮凝剂浓度为絮凝剂浓度为0.6 mg/L时，絮凝效率可达88%，絮凝剂浓度继续增加，絮凝效率没有显著的增加， 因此其最适宜剂量为0.6mg/L。

3.自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的最适宜处理时间测定

将实例4中纯化得到的絮凝物质制成水溶液处理测定为在不同时间点絮凝 非絮凝栅藻FSP-3的效率以测定其最适宜处理时间。在10mL OD680值为0.6 的非絮凝栅藻FSP-3中加入终浓度为0.6mg/L的絮凝物质，震荡混匀30s，立 即测各藻液此时在680nm下测吸光度OD680(t₀)；随后分别在1,3,5,10，20,30， 45,60min同样方法取样测吸光度OD680(t₁)；按照公式[1]进行分别计算各时间 点的絮凝活性。本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质不同处理时间测定结果（图 7）所示，处理10min时，絮凝效率为56%，处理20min时，絮凝效率为72%， 处理30min时，絮凝效率为79%，处理时间继续延长，絮凝效率没有显著的增 加，因此其最适宜处理为20min。

4.自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的最适宜pH测定

将实例4中纯化得到的絮凝物质制成水溶液在不同的pH下进行絮凝非絮凝 栅藻FSP-3以测定其最适宜pH。在10mL OD0.6的非絮凝栅藻FSP-3中加入终 浓度为0.6mg/L的絮凝物质，分别调节pH 4.0-11.0，按照上述的方法测定其在 不同的pH下进行絮凝非絮凝栅藻FSP-3的絮凝效率，以确定其最适宜pH。结 果（图8）表明，本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的最适宜pH为7.0，此 时的絮凝效率可达83%，在pH5-8的范围内，絮凝活性均稳持在50%以上。

5.自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的最适宜温度测定

将实例4中纯化得到的絮凝物质制成水溶液在不同的温度下进行絮凝非絮 凝栅藻FSP-3以测定其最适宜温度。在10mL OD680值为0.6的非絮凝栅藻 FSP-3中加入终浓度为0.6mg/L的絮凝物质，分别调节温度20-60℃，另外在 121℃处理20min的絮凝物质按照同样的方法，进行絮凝活性测定。结果（图9） 表明，本发明自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质的适宜温度广泛，在20-60℃的范围 内，絮凝活性均稳持在65%以上；且具有良好的热稳定性，在121℃处理20min 后，絮凝活性仍可达到46%。

6.不同金属离子对自絮凝斜生栅藻所产絮凝物质絮凝效率的影响

将实例4中纯化得到的絮凝物质制成水溶液进行絮凝非絮凝栅藻FSP-3，在 絮凝反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子，研究其对絮凝活性的影响。 在10mL OD680值为0.6的非絮凝栅藻FSP-3中加入终浓度为0.6mg/L的絮凝 物质，分别加入Al³⁺、Fe³⁺、Ca²⁺和Mg²⁺，各种物质终浓度为50mmol/L，测定 絮凝活性。结果表明，高价的Al³⁺、Fe³⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对絮凝物质絮凝活性有一 定的促进作用，但差别不明显。