一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法

摘要

本发明涉及一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，介孔材料固定化蛋白，装入色谱柱，制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型，将对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂溶于缓冲液作为流动相，每隔固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分，固定次数后将流动相换成不含抑制剂的缓冲液，每隔固定时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分，所述馏分分别冷冻干燥，溶于水，用分析型色谱柱分离底物和产物，纪录产物的峰面积；绘制固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线，对模型进行验证，再采用制备的模型将待筛选中药水提物溶于缓冲液中作为流动相。根据产物的峰面积判断中药是否有抑制作用以及抑制的过程、类型。该方法具有可靠性高、在线等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选中药活性成分的方法，尤其涉及一种纳米介孔材料 固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法。

背景技术

药物筛选是现代药物开发过程中测试和获取特定生理活性化合物的一 个步骤,是通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一 特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程。药物靶点包括基因位点、受体、 酶、离子通道、核酸等生物大分子，近年的研究表明，酶作为药物靶点具有 很多优势，且已获得了很多重要的研究成果。

但是，传统利用靶蛋白为靶点进行中药筛选，一般都采用将靶蛋白与 底物/中药水溶液混合孵育一段时间，利用紫外分光光度计测吸光值，从而 进行抑制剂的筛选，这种方法酶容易失活，而且筛选结果可靠度不高，且无 法判断抑制类型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选 中药活性成分的方法，克服现有技术中采用将靶蛋白与底物/中药水溶液混 合孵育一段时间，再利用紫外分光光度计测吸光值，进行抑制剂的筛选，这 种方法靶蛋白容易失活，且筛选结果可靠度不高，无法判断抑制类型的缺陷。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种纳米介孔材料固定靶蛋 白筛选中药活性成分的方法，包括以下步骤：

步骤A：制备固定化靶蛋白：采用物理吸附法，将靶蛋白溶于的最适pH 的缓冲液中，加入介孔材料，冰浴条件下搅拌孵育；

步骤B：制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型：以水为流动相，将步骤A 所述固定化靶蛋白装入色谱柱中，形成固定化靶蛋白抑制剂模型；

步骤C：验证步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型的有效果性；

首先，选择对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂；再将步骤B制备 的靶蛋白抑制剂模型连接液相色谱仪，将一定量的靶蛋白抑制剂溶于与步骤 A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第一流动相；

其次，开启液相色谱仪，用所述第一流动相平衡柱子，每隔固定时间进 样靶靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻的出峰第一馏分；进 样靶靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数后，将所述的第一流动相换成不含固 定化靶酶抑制剂的与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液，每隔固定时间 进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻的出峰第二馏分；

最后，收集的不同时刻出峰第一馏分和不同时刻出峰第二馏分分别冷冻 干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第一馏分产物 及不同时刻出峰第二馏分产物的峰面积。

步骤D：重复步骤A和步骤B的步骤，将步骤B制备的固定化靶酶抑制 剂模型连接液相色谱仪，将与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为 第二流动相；开启液相色谱仪，用所述的第二流动相平衡柱子，固定时间进 样靶蛋白的饱和浓度的底物，收集不同时刻出峰第三馏分，将不同时刻的出 峰第三馏分冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录的出峰第三 馏分产物峰面积；所述出峰第三馏分产物为靶蛋白与底物未受抑制剂影响反 应后的产物；

步骤E：固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线：以时间为横坐标，以靶蛋白 的残余活力为纵坐标，制作随时间改变，靶蛋白经历活性被抑制和活性恢复 的过程曲线；所述残余活力为不同时刻的出峰第一馏分产物峰面积或不同时 刻的出峰第二馏分产物峰面积与所述不同时刻的出峰第三馏分产物面积之 比；

步骤F：参照上述步骤A至步骤E中的方法，将方法中的固定化靶蛋白 抑制剂换成天然药物，筛选天然药物中活性成分，考察其对靶蛋白的抑制作 用及抑制类型。

根据试验数据绘制靶蛋白活性被抑制和活性恢复的过程曲线图的可以 得知，在该浓度下，抑制剂对靶蛋白的最大抑制率；同时根据最终靶蛋白活 性恢复的结果，可以得知该抑制剂是可逆抑制剂还是不可逆抑制剂。

本发明的有益效果是：本发明利用具有无毒无害、孔径可调、柱压低等 优势的介孔材料固定化靶蛋白，装入色谱柱，利用对靶蛋白具有代表性抑制 作用的靶蛋白抑制剂对模型进行验证后，在利用验证模型的方法将天然产物 溶于缓冲液中作为流动相，每隔固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰 馏分，收集出峰馏分固定次数后将流动性换成不含天然产物的缓冲液，每隔 固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分。通过改变流动相使靶蛋白 经历抑制和活性恢复的过程。之后将收集的馏分用色谱柱分析，根据产物的 峰面积判断中药是否有抑制作用以及抑制的类型。该方法具有可靠性高、在 线等优点。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述介孔材料为羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料。

进一步，所述步骤A所述介孔材料通过以下步骤制备得到：

步骤A1：以三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（P123）为模板 剂，1,3,5-三甲基苯（TMB）为扩孔剂，1,2-双-三乙氧基硅基乙烷（BTESE） 为前导物，添加2-氰基丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅基乙烷的羧基 或氨基偶联剂；

步骤A2：调节P123和TMB的比例，制备羧基或氨基修饰的有机介孔 氧化硅材料（-COOH-PMOs或-NH₂-PMOs）。

进一步，步骤A1所述三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯和 1,3,5-三甲基苯的比例为4:0到4:4。

进一步，步骤A2所述羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料的孔径为 8～30nm。

进一步，步骤A所述冰浴条件下搅拌孵育时间为7小时。

进一步，步骤C所述第一流动相平衡柱子15分钟后，每隔固定时间为 20分钟进样靶蛋白的饱和浓度的底物8至12次，收集不同时刻的出峰第一 馏分。

进一步，步骤C所述第一流动相换成不含固定化靶蛋白抑制剂的与步骤 A中所述缓冲液pH相同的缓冲液，每隔固定时间为20分钟进样靶蛋白的饱 和浓度的底物8至12次，收集不同时刻的出峰第二馏分。

进一步，步骤C所述固定时间进样的出峰第一馏分、出峰第二馏分及步 骤D所述固定时间进样的出峰第三馏分分别冷冻干燥后溶于300ul的水溶液 中，再用C18分析型色谱柱分离底物和产物。

以上步骤所述的靶蛋白可以为糖尿病、心血管疾病、肿瘤和病毒的靶蛋 白。

附图说明

图1为本发明一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法中 制备的固定化酶模型筛选五倍子水提物抑制及酶活恢复过程曲线图；

图2为本发明一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法中 制备的固定化酶模型筛选红景天水溶性部位抑制及酶活恢复过程曲线图；

图3为本发明一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法中 固定化α-葡萄糖苷酶模型验证过程采用6mM阿卡波糖抑制固定化α-葡萄糖 苷酶及酶活恢复过程曲线图；

图4为本发明一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法中 制备的固定化酶模型筛选麦冬水提物抑制及酶活恢复过程曲线图；

图5为本发明一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法中 制备的固定化酶模型筛选射干水溶性部位抑制及酶活恢复过程曲线图；

图6为一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法中固定化 醛糖还原酶模型验证过程采用4mM依帕司抑制固定化醛糖还原酶及酶活恢复 过程曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：

以糖尿病靶酶α-葡萄糖苷酶为例，其底物为4-硝基苯-α-D-吡喃糖苷， 典型的抑制剂为阿卡波糖。

本实施例的具体过程和步骤如下：

1、介孔材料的制备：用P123为模板剂，TMB为扩孔剂，BTESE为前导 物，CETES为-COOH偶联剂，通过确定P123/TMB=4/3的比例，制备孔径为 13.38nm的羧基化有机介孔氧化硅材料（-COOH-PMOs）；

2、α-葡萄糖苷酶的固定：利用物理吸附法，将α-葡萄糖苷酶溶于pH4.5 的醋酸缓冲液，加入上述-COOH-PMOs材料，冰浴条件下搅拌孵育7h；

3、制备固定化α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型：以水为流动相，用装柱 机将上述固定化α-葡萄糖苷酶装入规格为4.6*50mm的色谱柱中，于4℃保 存；

4、固定化α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型有效性验证：

室温下，pH4.5的醋酸缓冲液为流动相，流速为0.1ml/min，检测波长 为315nm，用具有代表性的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖进行筛选模型有效 性验证。将装好的色谱柱接上液相色谱仪，含6mM阿卡波糖的pH4.5的醋酸 缓冲液作为第一流动相。先用第一流动相平衡柱子15min后，每隔20min 进样100μL的20mM的α-葡萄糖苷酶的底物4-硝基苯-α-D-吡喃糖苷，共 进样8～12次，收集每隔20分钟的出峰第一馏分。之后，将第一流动相换 成不含阿卡波糖的pH4.5的醋酸缓冲液，每隔20min进样100μL的20mM的 α-葡萄糖苷酶的底物4-硝基苯-α-D-吡喃糖苷，共进样8～12次，收集每 隔20分钟的出峰第二馏分。将收集的不同时刻的出峰第一及第二馏分冷冻 干燥，溶于300μL的水溶液，再用C18色谱柱进行分离底物和产物，其分 离条件为0.3ml/min水：0.5ml/min的乙腈，记录出峰第一馏分及出峰第二 馏分产物的峰面积。

5、重复步骤1和步骤2和3的步骤，将步骤3制备的固定化α-葡萄糖 苷酶抑制剂模型连接液相色谱仪，将与步骤2中所述缓冲液pH相同的缓冲 液中作为第二流动相；开启液相色谱仪，用所述的第二流动相平衡柱子，固 定时间进样固定化α-葡萄糖苷酶的饱和浓度的底物4-硝基苯-α-D-吡喃糖 苷，收集出峰第三馏分，所述出峰第三馏分冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分 离底物和产物，纪录的出峰第三馏分产物峰面积；所述出峰第三馏分产物为 固定化α-葡萄糖苷酶与底物未受抑制剂影响反应后的产物；

6、抑制剂的抑制曲线：以时间为横坐标，以酶的残余活力为纵坐标（该 时刻产物峰面积/最初产物峰面积），制作随时间改变，酶经历活性被抑制 和活性恢复的过程曲线。根据该图可以得知，在该浓度下，抑制剂对酶的最 大抑制率（为最大酶活性减去最小的酶的残余活力）；同时根据最终酶活性 恢复的结果，可以得知该抑制剂是可逆抑制剂还是不可逆抑制剂。

7、用步骤3的制备的模型并采用验证模型的方法进行中药五倍子水溶 性部位（1mg/ml）对α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，其最终的抑制过程结果 如图1所示。

如表1所示的实验数据绘制的图1。如图1所示，在时间轴上165分钟 前流动相含有五倍子水提物，在时间轴165分钟后流动相不含五倍子水提物； 由此可以看出五倍子水提物对α-葡萄糖苷酶具有明显的抑制作用，1mg/ml 的浓度下，其最大抑制率约为78%；且五倍子水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制 是部分可逆的竞争抑制作用，随着时间的延长，酶的活性能恢复到最初酶活 的80%左右。

如表1：采用验证模型的方法进行中药五倍子水溶性部位（1mg/ml）对 α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选实验结果

注：0时刻为出峰第三馏分产物峰面积及初始酶活数据；15分钟至165 分钟每隔20分钟收集的出峰第一馏分的产物纪录的峰面积及酶活数据；165 分钟至355分钟每隔20分钟收集的出峰第二馏分的产物纪录的峰面积及酶 活数据；最大抑制率为初始酶活减去最小酶残余活力。

对中药红景天水溶性部位的醛糖还原酶抑制活性筛选，步骤1至5所述 方法与实施例1相同，采用步骤3的制备模型并采用验证模型的方法进行中 药红景天水溶性部位（1mg/ml）对α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，其最终的 抑制过程结果如图2所示。也可以采用步骤3的制备模型对其他中药成分的 抑制效果和类型测定。

如表2所示的实验数据绘制的图2。如图2所示，在时间轴上265分钟 前流动相含有红景天水提物，在时间轴265分钟后流动相不含红景天水提物； 由此可以看红景天水提物对α-葡萄糖苷酶具有明显的激活作用，1mg/ml的 浓度下，其最大激活率约为100%；随着时间的延长，酶的活性能恢复到最初 酶活的80%左右。

如表2：采用验证模型的方法进行红景天水提物（1mg/ml）对α-葡萄糖 苷酶抑制活性筛选实验结果

注：0时刻为出峰第三馏分产物峰面积及初始酶活数据；15分钟至265 分钟每隔30分钟收集的出峰第一馏分的产物纪录的峰面积及酶活力数据； 265分钟至425分钟每隔30分钟收集的出峰第二馏分的产物纪录的峰面积及 酶活数据；最大激活率为最大酶残余活力减去初始酶活。

另外，作为参考，用具有代表性的α-葡萄糖苷酶抑制剂的阿卡波糖进行 模型验证所得的抑制过程曲线如图3所示。

如表3所示的实验数据绘制的图3。如图3所示，在时间轴上195分钟 前流动相含有阿卡波糖，在时间轴195分钟后流动相不含阿卡波糖；由此可 以看6mM阿卡波糖能完全抑制α-葡萄糖苷酶的活性，而且能100%恢复酶的 活性，即表明阿卡波糖是α-葡萄糖苷酶的可逆竞争性抑制剂。

如表3：采用验证模型的方法进行α-葡萄糖苷酶具有代表性的抑制剂阿 卡波糖（1mg/ml）对α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选实验结果

注：0时刻为出峰第三馏分产物峰面积及初始酶活数据；15分钟至265 分钟每隔20分钟收集的出峰第一馏分的产物纪录的峰面积及酶活数据；265 分钟至435分钟每隔20分钟收集的出峰第二馏分的产物纪录的峰面积及酶 活数据；最大抑制率为初始酶活减去最小酶残余活力。

实施例2

以糖尿病并发症靶酶醛糖还原酶为例，其辅酶为NADPH，底物为DL-甘 油醛，典型的抑制剂为依帕司他。

本实施例的具体过程和步骤如下：

1、介孔材料的制备：用P123为模板剂，TMB为扩孔剂，BTESE为前导 物，加入-NH₂偶联剂，通过确定P123/TMB=4/2的比例，制备孔径为10.66nm 的氨基化有机介孔氧化硅材料（-NH₂-PMOs）；

2、醛糖还原酶的固定：利用物理吸附法，将醛糖还原酶溶于pH6.2的 磷酸缓冲液，加入上述-NH₂-PMOs材料，冰浴条件下搅拌孵育7h；

3、制备固定化醛糖还原酶抑制剂筛选模型：以水为流动相，用装柱机 将上述固定化醛糖还原酶装入规格为4.6*50mm的色谱柱中，于4℃保存；

4、固定化醛糖还原酶抑制剂筛选模型有效性验证：

室温下，pH6.2的磷酸缓冲液为流动相，流速为0.1ml/min，检测波长 为260nm，用具有代表性的醛糖还原酶抑制剂依帕司他进行筛选模型有效性 验证。将装好的色谱柱接上液相色谱仪，含4mM依帕司他的pH6.2的磷酸缓 冲液作为流动相。先用流动相平衡柱子15min后，每隔20min进样100μL 的10mM的醛糖还原酶的底物DL-甘油醛和0.25mM的NADPH混合液，共进样 8～12次，收集每次出峰的馏分。之后，将流动相换成不含依帕司他的pH6.2 的磷酸缓冲液，每隔20min进样100μL的10mM的醛糖还原酶的底物DL-甘 油醛和0.5mM的NADPH混合液，共进样8～12次，收集每次出峰的馏分。将 收集的馏分冷冻干燥，溶于300μL的水溶液，收集每次出峰的馏分。将收 集的馏分冷冻干燥，溶于300μL的水溶液，再用C18色谱柱进行分离底物 和产物，其分离条件为0.3ml/min水：0.5ml/min的乙腈，记录产物的峰面 积。

5、重复步骤1和步骤2和3的步骤，将步骤3制备的固定化醛糖还原 酶抑制剂模型连接液相色谱仪，将与步骤2中所述缓冲液pH相同的缓冲液 中作为第二流动相；开启液相色谱仪，用所述的第二流动相平衡柱子，固定 时间进样固定化醛糖还原酶的饱和浓度的底物DL甘油醛和NADPH的混合 物，收集出峰第三馏分，所述出峰第三馏分冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分 离底物和产物，纪录的出峰第三馏分产物峰面积；所述出峰第三馏分产物为 固定化醛糖还原酶与底物未受抑制剂影响反应后的产物；

6、抑制剂的抑制曲线绘制：以时间为横坐标，以酶的残余活力为纵坐 标（固定时间收集的出峰第一产物峰面积或固定时间收集的出峰第二产物峰 面积/最初产物峰面积，即未受到抑制剂影响的酶与底物反应产物的峰面 积），制作随时间改变，酶经历活性被抑制和活性恢复的过程曲线。根据该 图可以得知，在该浓度下，抑制剂对酶的最大抑制率；同时根据最终酶活性 恢复的结果，可以得知该抑制剂是可逆抑制剂还是不可逆抑制剂。

6、用步骤3的制备模型并采用验证模型的方法进行中药麦冬水溶性部 位（1mg/ml）的醛糖还原酶抑制活性筛选，其最终的抑制过程结果如图4所 示。

如表4所示的实验数据绘制的图4。如图4所示，在时间轴上165分钟 前流动相含有麦冬水提物，在时间轴165分钟后流动相不含麦冬水提物；由 此可以看麦冬水提物对醛糖还原酶具有明显的抑制作用，1mg/ml的浓度下， 其最大抑制率约为65%；且麦冬水提物对醛糖还原酶的抑制是部分可逆的竞 争抑制作用，随着时间的延长，酶的活性能恢复到最初酶活的85%左右。

如表4：采用验证模型的方法进行麦冬水提物（1mg/ml）对醛糖还原酶 抑制活性筛选实验结果

注：0时刻为出峰第三馏分产物峰面积及初始酶活数据；15分钟至165 分钟每隔20分钟收集的出峰第一馏分的产物纪录的峰面积及酶活数据；165 分钟至355分钟每隔20分钟收集的出峰第二馏分的产物纪录的峰面积及酶 活数据；最大抑制率为初始酶活减去最小酶残余活力。

对中药射干水溶性部位的醛糖还原酶抑制活性筛选，步骤1至5所述方 法与实施例2相同，用步骤3的制备模型并采用步骤5、6的方法进行中药 射干水溶性部位（1mg/ml）的醛糖还原酶抑制活性筛选，其最终的抑制过程 结果如图5所示。

如表5所示的实验数据绘制的图5。如图5所示，在时间轴上195分钟 前流动相含有射干水提物，在时间轴195分钟后流动相不含射干水提物；由 此图可以看射干水提物对醛糖还原酶先表现出30%的抑制作用,之后对醛糖 还原酶表现出弱的激活作用；随着时间的延长，酶的活性能恢复到最初酶活 的75%左右。

表5：采用验证模型的方法进行射干水提物（1mg/ml）对醛糖还原酶抑 制活性筛选实验结果

注：0时刻为出峰第三馏分产物峰面积及初始酶活数据；15分钟至195 分钟每隔30分钟收集的出峰第一馏分的产物纪录的峰面积及酶活数据；195 分钟至435分钟每隔30分钟收集的出峰第二馏分的产物纪录的峰面积及酶 活数据；最大激活率最大酶残余活力为减去初始酶活。

另外，作为参考，用具有代表性的醛糖还原酶抑制剂的依帕司他进行模 证的所得的抑制过程如6所示。

如表6所示的实验数据绘制的图6。如图6所示，在时间轴上195分钟 前流动相含有依帕司他，在时间轴195分钟后流动相不含依帕司他；由此可 以看4mM依帕司他能约能抑制醛糖还原酶95%的活性，而且能100%恢复酶的 活性，即表明依帕司他是醛糖还原酶的可逆竞争性抑制剂。

表6：采用验证模型的方法进行醛糖还原酶代表性抑制剂依帕司他 （1mg/ml）对醛糖还原酶抑制活性筛选实验结果

注：0时刻为出峰第三馏分产物峰面积及初始酶活数据；15分钟至195 分钟每隔20分钟收集的出峰第一馏分的产物纪录的峰面积及酶活数据；195 分钟至435分钟每隔20分钟收集的出峰第二馏分的产物纪录的峰面积及酶 活数据；最大抑制率为初始酶活减去最小酶残余活力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。