一种韭菜籽中的多糖提取物及其提取方法

摘要

本发明公开了一种韭菜籽中的多糖提取物及其提取方法，利用超声波萃取韭菜籽多糖的提取工艺，采用分光光度比色法测韭菜籽多糖含量，通过正交实验对超声波辅助水浸提韭菜籽多糖的提取工艺进行了系统研究，确定了最佳工艺，即：在50％KW，1∶30的料水比，浸泡2h，超声波提取25min，得多糖最高提取率；再用醇沉法得到韭菜籽多糖的粗品。亦为韭菜籽的深入开发及临床应用提供一定的科学依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种韭菜籽中的提取物，具体为一种韭菜籽中的多糖提取物及其提取方法。 

背景技术

韭菜籽收载于2005年版《中国药典》，其来源为百合科植物韭菜Allium tuberosum Rottl.的干燥成熟种子…。该药材始载于《名医别录》，列为中品，苏颂谓：“案许宋说文，韭字象叶出地上形，一种而久生，故谓之韭，一岁三、四割，其根不伤，至冬壅培之，先春复生”。李时珍谓：“韭从生丰本，长叶青翠，可以根分，可以子种。……八月开花成丛，……九月收子，其子黑色耳扁，须风处阴干”。根据描述和附图，现今所用韭菜与历代本草所载相同”。的历史。韭为百合科葱属多年生草本植物，其具有一种特殊而且强烈的韭香气味，其叶子俗称韭菜，又名起阳草、长生韭、壮阳草、草钟乳，主要以叶片、假茎供食，作为我国特有的一种蔬菜。韭菜中除含有蛋白质、脂肪、碳水化合物，还有丰富的胡萝卜素、VC、以及微量元素，其中Fe、Mn、Zn含量较高。而韭菜籽原产亚洲东南部，我国各地均有栽培或野生”，以河北、山西、吉林、江苏、山东、安徽、河南等地产量较大。市场上对韭菜籽的需求量也在日益增加，且韭菜籽的资源广泛，吉林省产量较大，如能对其进行系统深入的研究，必将会产生广阔的经济前景。现代医学研究表明，韭菜含有丰富的纤维素，能增进胃肠消化功能。药理分析还发现，韭菜中的挥发性含硫化合物具有降低血脂的作用，对治疗冠心病及高血压也有一定的疗效。而目前，关于韭菜籽的研究多集中在药理作用方面，其性温，味微甘，具有补肾阳、暖腰膝、壮阳固精之功效，临床上主治阳痿遗精、腰膝酸软、冷痛、遗尿、尿频、白浊带下等症”。由于其 疗效显著，在临床上被广泛应用。而关于其化学成分研究则较少，仅在脂肪酸、氨基酸和微量元素方面有所研究，尤其是对其药效物质基础(有效成分)的研究尚未见报道，国家药典也没有相关的质量评价标准。 

多糖是有单糖链接而成的多聚物，生物学中关于多糖的定义为：20个以上的单糖通过糖苷键链接形成的聚合物，多糖连可以是线性的或带有分支的。多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。其广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，而因此生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖三大类。 

而近三十年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖及其复合物分子具有及其重要的生物功能，它与机体免疫功能的调节、细胞与细胞间物质的传输、癌症的诊断与治疗的关系引起了国内外的高度重视，国际科学界甚至提出21世纪是多糖的世纪。其中植物多糖是重中之重。 

目前对于韭菜籽化学成分的研究较少，仅在脂肪酸、氨基酸和微量元素方面有所涉及，而在已知的文献和报道中没有关于韭菜籽多糖的研究。因此，提供一种韭菜籽中的多糖提取物及提取方法，让更多的多糖类化合物为人类造福，已经是一个值得研究的问题。 

发明内容

为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供了一种韭菜籽中的多糖提取物及其提取方法。 

本发明的目的是这样实现的： 

一种韭菜籽中的多糖提取物，通过以下步骤提取得到：韭菜籽→粉碎→脱脂→超声波前的浸泡→超声波萃取→过滤→醇沉→抽滤→干燥→得韭菜籽多糖粗品→测定。 

所述的韭菜籽中的多糖提取物，其具体提取方法如下： 

a、韭菜籽的韭粉碎：用电子天平称取一定量的干燥的韭菜籽在粉碎机中粉碎，粉碎至50％能通过100目的筛子，之后对过筛后的韭菜籽粉进行称重，记录数值； 

b、脱脂：用石油醚按1∶3的料液比在60℃的恒温水浴锅当中脱脂，持续半个小时，倒掉上清液，再次加石油醚重复上次步骤直至上清液为青绿色； 

c、超声波前的浸泡：把b步中经过脱脂的韭菜籽粉在自然条件下风干后，进行浸泡； 

d、将c步中浸泡过的韭菜籽用超声波进行浸提； 

e、过滤：用布氏漏斗和2层滤纸过滤，分离残渣和滤液； 

f、醇沉：通过e步中过滤得到的浓缩液冷却至室温后，边搅拌边向浓缩液中加入5倍体积的95％的乙醇，进行醇沉，然后于冰箱中低温静置10h； 

g、分离多糖：利用真空抽虑，将醇沉的韭菜籽多糖和乙醇分离。 

h：干燥：将g步中得到的韭菜籽多糖挥干溶剂后放入60℃干燥箱中，直到恒重为止； 

i、韭菜籽多糖的测定，采用硫酸-苯酚法对h步中得到的韭菜籽多糖含量就行测定。 

所述的超声波浸提的萃取条件为：萃取时间为25min、超声波萃取前的浸泡时间2.5h、料液比为1∶30。 

积极有益效果：多糖作为一类重要的天然活性物质，其最大优点是毒副作用小，来源广泛。目前已有香菇多糖、猪苓多糖、云芝多糖、灰树花多糖、裂隙葡多糖、牛膝多糖等应用于临床，它们在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗溃疡、降血糖等方面的作用使多糖类药物显示了诱人的前景。我国多糖资源丰富， 尤其是来源于中草药的植物多糖具有较大的开发力。随着多糖的分离纯化、结构、合成、药理及临床研究的不断深入，多糖类药物将具有更广阔的应用前景。本发明提供了一种对韭菜籽的多糖进行提取的方法，希望更多的人能关注韭菜，深入的研究其本身活性物质，必将产生广阔的场景。 

附图说明

图1为葡萄糖标准曲线； 

图2为影响因素与多糖得率之间的直观分析图。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步的说明： 

一种韭菜籽中的多糖提取物，通过以下步骤提取得到：韭菜籽→粉碎→脱脂→超声波前的浸泡→超声波萃取→过滤→醇沉→抽滤→干燥→得韭菜籽多糖粗品→测定。 

所述的韭菜籽中的多糖提取物，其具体提取方法如下： 

a、韭菜籽的韭粉碎：用电子天平称取一定量的干燥的韭菜籽在粉碎机中粉碎，粉碎至50％能通过100目的筛子，之后对过筛后的韭菜籽粉进行称重，记录数值； 

b、脱脂：用石油醚按1∶3的料液比在60℃的恒温水浴锅当中脱脂，持续半个小时，倒掉上清液，再次加石油醚重复上次步骤直至上清液为青绿色； 

c、超声波前的浸泡：把b步中经过脱脂的韭菜籽粉在自然条件下风干后，进行浸泡； 

d、将c步中浸泡过的韭菜籽用超声波进行浸提； 

e、过滤：用布氏漏斗和2层滤纸过滤，分离残渣和滤液； 

f、醇沉：通过e步中过滤得到的浓缩液冷却至室温后，边搅拌边向浓缩液中加入5倍体积的95％的乙醇，进行醇沉，然后于冰箱中低温静置10h； 

g、分离多糖：利用真空抽虑，将醇沉的韭菜籽多糖和乙醇分离。 

h：干燥：将g步中得到的韭菜籽多糖挥干溶剂后放入60℃干燥箱中，直到 恒重为止； 

i、韭菜籽多糖的测定，采用硫酸-苯酚法对h步中得到的韭菜籽多糖含量就行测定。 

所述的超声波浸提的萃取条件为：萃取时间为25min、超声波萃取前的浸泡时间2.5h、料液比为1∶30。 

超声波辅助水浸提： 

以不同的超声波萃取的时间、功率、超声波萃取前的浸泡时间、料液比等四个因素探讨对于韭菜籽多糖提取率的影响。见表1。 

表1超声波辅助水浸提因素水平表 

过滤：用布氏漏斗和2层滤纸过滤，分离残渣和滤液。 

醇沉：基于多糖是极性大分子化合物，可溶于水而不溶于醇的特点。待浓缩液冷却至室温后，边搅拌边向浓缩液中加入5倍体积的95％的乙醇，进行醇沉，于冰箱中低温静置10h。 

分离多糖：利用真空抽虑，将醇沉的韭菜籽多糖和乙醇分离。 

干燥：将韭菜籽多糖挥干溶剂后放入60℃干燥箱中，直到恒重为止。 

正交实验 

采用四因素三水平的正交实验，见表2，确定最优的萃取工艺条件： 

表2超声波萃取韭菜籽多糖正交实验表 

韭菜籽多糖的测定(硫酸-苯酚法) 

标准曲线的制备 

吸取葡萄糖标准溶液0、20、40、60、80、100ul，分别置于试管中，各加蒸馏水使体积为2ml，再加苯酚试液1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温。于490nm处测吸光度，绘制标准曲线，得葡萄糖浓度(c)与吸光度A曲线。 

样品液中多糖含量的计算 

对超声后的样品进行过滤，取滤液按照正交表的步骤共要做九组实验，每组实验的滤液都用容量瓶定容到100ml。吸取100ul的样品液，按“标准曲线制作”的方法测吸光度。代入标准曲线方程得到样品液中多糖浓度，进而计算其含量。 

实验结果 

葡萄糖标准曲线绘制结果 

硫酸-苯酚法测定得到的标准曲线方程所测得的葡萄糖含量c与吸光度A的数据记录见表3，标准曲线方程为：A＝0.0045c-0.0193，其中R²＝0.9913 

表3葡萄糖含量C与吸光度 

正交实验结果 

根据正交实验表，得到测定结果，见表4及多糖得率和影响因素之间的关系，见图2。 

表4超声波萃取韭菜籽多糖正交实验的直观结果 

通过表4可以得到韭菜籽多糖得率的影响因素主次顺序依次为： 

D(萃取功率)-C(料液比)-A(萃取时间)-B(浸泡时间) 

从表4还可以看出，以第9号实验的多糖得率最好，其处理组合为A₃B₃C₂D₁。影响因素与多糖得率之间的趋势可见图2。 

由图2可得，超声波萃取韭菜籽多糖的理论最优提取条件为：A₃B₃C₂D₁即超声波中的萃取时间为25min、超声波前的浸泡时间2.5h、料液比为1∶30、萃取功率为50℃时的萃取率最好，通过实验测定，理论最优的萃取条件与本实验的实际的最优萃取的条件是一致的。即最高的得率为1.33％。 

韭菜籽多糖的测定 

目前，采用特定单糖(如葡萄糖)的总量来表征多糖含量，是使用最为广泛的多糖定量检测方法，但是其选择性很差，既不能有效的鉴别出多糖制品中的一些掺假品，如麦芽糖、淀粉等；也不能准确定量杂多糖的含量，如银耳多糖、香菇多糖等；而HPCE、SEC、GCP等方法虽然在选择性和准确性上有很大提高，但也只是以特定分子量范围的葡聚糖或右旋糖酐来表征，也不能准确定量杂多糖的含量，更不能准确的指证特定多糖的含量，如具有看肿瘤活性的香菇多糖中的lentinan；同时复合多糖被证实是比单一多糖具有更好的免疫调节活性，因此使用某种单一多糖作为标准品来测定复合多糖含量是不准确的。 

正交的选择 

我们知道如果有很多的因素变化制约着一个事件的变化，那么为了弄明白哪些因素重要，哪些不重要，什么样的因素搭配会产生极值，必须通过做实验验证，如果因素很多，而且每种因素又有多种变化(专业称法是：水平)，那么实验量会非常的大，显然是不可能每一个实验都做的。能够大幅度减少实验次数而且并不会降低实验可行度的方法就是使用正交实验法。首先需要选择一张和实验因素水平相对应的正交表，已经有数学家制好了很多相应的表，你只需找到对应你需要的就可以了。所谓正交表，也就是一套经过周密计算得出的现成的实验方案，他告诉你每次实验时，用那几个水平互相匹配进行实验，这套方案的总实验次数是远小于每种情况都考虑后的实验次数的。比如3水平4因素表就只有9行，远小于遍历实验的81次；我们同理可推算出如果因素水平越多，实验的精简程度会越高。 

建立好实验表后，根据表格做实验，然后就是数据处理了。由于实验次数大大减少，使得实验数据处理非常重要。首先可以从所有的实验数据中找到最优的一个数据，当然，这个数据肯定不是最佳匹配数据，但是肯定是最接近最佳的了。这是你能得到一组因素，这是最直观的一组最佳因素。接下来将各个因素当中同水平的实验值加和(注：正交表的一个特点就是每个水平在整个实验中出现的次数是相同的)，就得到了各个水平的实验结果表，从这个表当中又可以得到一组最优的因素，通过比较前一个因素，可以获得因素变化的趋势，指导更进一步的实验。各个因素中不同水平实验值之间也可以进行如极差、方差等计算，可以获知这个因素的敏感度，还有很多处理数据的方法。然后再根据统计数据，确定下一步的实验，这次实验的范围就很小了，目的就是确定最终的最优值。当然，如果因素水平很多，这种寻优过程可能不止一次。在生产和科研中，为了研制新产品，改革生产工艺，寻找优良的生产条件，需要做许多 多因素的实验。在方差分析中对于一个或两个因素的实验，我们可以对不同因素的所有可能的水平组合做实验，这叫做全面实验。当因素较多时，虽然理论上仍可采用前面的方法进行全面实验后再做相应的方差分析，但是在实际中有时会遇到实验次数太多的问题。例如，生产化工产品，需要提高收率(产品的实际产量与理论上投入的最大产量之比)，认为反应温度的高低、加碱量的多少、催化剂种类等多种因素，都是造成收率不稳的主要原因。根据以往经验，选择温度的三个水平：80℃、85℃、90℃；加碱量的三个水平：35、48、55(kg)；催化剂的三个水平：甲、乙、丙三种。如果做全面实验，则需3×3×3＝27次。如果有3个因素，每个因素选取4个实验水平的问题，在每一种组合下只进行一次实验，所有不同水平的4×4×4＝64种，如果6个因素，5个实验水平，全面实验的次数是5×5×5×5×5×5＝15，625次。对于这样一些问题，设计全面的实验往往耗时、费力，往往很难做到。因此，如何设计多因素实验方案，选择合理的实验设计方法，使之既能减少实验次数，又能收到较好的效果。“正交实验法”就是研究与处理多因素实验的一种科学有效的方法。 

正交实验法在西方发达国家已经得到广泛的应用，对促进经济的发展起到了很好的作用。在我国，正交实验法的理论研究工作已有了很大的进展，在工农业生产中也正在被广泛推广和应用，使这种科学的方法能够为经济发展服务。 

韭菜籽多糖的提取方法 

多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提 取法、强化提取法等。 

溶剂法 

水提醇沉法 

水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70％左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高。 

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法但由于水的极性大，容易把蛋白质苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。 

酸提法 

为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。任初杰等研究了花生粕多糖的酸提法：花生粕1g→盐酸溶液提取→10000r/min离心15min→取上清液+3倍95％乙醇沉淀→过夜→10000r/min离心15min→沉淀用0.1mol/L盐酸溶液溶解。 

由于H+的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 

碱提法 

多糖在碱性溶液中稳定，例如粘多糖的提取多采用碱提取法。张兰杰等在70℃条件下，将五味子用稀NaOH溶液调pH＝8，水溶液提取3次，滤液浓缩、醇析、Savage法脱蛋白、脱脂、脱色、DATE纤维素柱洗脱等步骤，分离出两种多糖组分，质量分数分别为0.387％和0.061％。田龙以豆渣为原料，在碱性条件下脱蛋白，再用质量分数为30％氢氧化钠溶液在45℃提取90min，以干豆渣计算，水溶性大豆多糖提取率为48％。 

碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。 

酶解法 

单一酶解法 

单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术其中经常使用的酶有蛋白酶纤维素酶等蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。谢红旗等采用中性蛋白酶解法提取香菇多糖，和直接水提法比较，结果表明在pH 4.8，温度50℃，处理时间60min，多糖得率增大40％，杂质蛋白质减少50％。 

复合酶解法 

复合酶解法采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶，主要利用纤维素酶和果胶酶水解纤维素和果胶，使植物组织细胞的细胞壁破裂，释放细胞壁内的活性多糖，多糖释放的多少和复合酶的加入量、酶解温度、酶解时间、酶解、pH值有直接的关系。侯轩等研究了复合酶(纤维素酶和果胶酶)提取白术多糖的最佳工艺条件。分别比较了酶解温度、酶解、pH、酶解时间以及酶量 对多糖提取率的影响，并采用正交设计优化提取条件，确定最佳提取工艺：酶解温度50℃，酶解pH 5.0，酶解时间50min，复合酶量为0.7％，在最佳提取工艺下，多糖的得率为43.0％。 

酶解法提取的实质是通过酶解反应强化传质过程。此法具有条件温和杂质易除和得率高等优点。 

物理强化法 

微波辅助提取法 

微波萃取是高频电磁波穿透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。邓永智等利用微波辅助提取法通过正交实验从海水小球藻中提取多糖，在70℃，功率为600W，提取时间为30min的条件下，多糖有较好的提取效果。 

微波辅助提取多糖和其他的萃取方法比较，微波萃取效率高，操作简单，且不会引入杂质，多糖纯度高，能耗小，操作费用低，符合环境保护要求，是很好的多糖提取方法。 

超声波辅助提取法 

超声波提取是利用超声波的机械效应空化效应及热效应机械效应可增大介质的运动速度及穿透力，能有效的破碎生物细胞和组织，从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中；空化效应使整个生物体破裂，整个破裂过程在瞬间完成，有利于有效成分的溶出；热效应增大了有效成分的溶解速度，这种热效应是瞬间的，可使被提取成分的生物活性尽量保持不变；此外，许多次级效应也能促进提取材料中有效成分的溶解，提高了提取率。钟丹等采用超声波提取牛蒡菊 糖，结果表明，其最佳提取条件为：料液质量比1∶15提取时间15min提取温度60℃超声波功率420W，此条件下菊糖的提取率为32.3％。 

超声波提取与水煮法醇沉法相比，萃取充分，提取时间短；与浸泡法相比，提取率高。而且多糖分子量较大，溶出困难，超声处理过程中可以加速多糖的溶解，降低多糖溶出阻力，加速提取进度和提高提取得率。这对保证多糖结构与功能的完整性有着重要的意义，值得推广应用。 

综上所述根据以上的多糖的提取方法的优缺点及实际中实验室的基本条件，最优选择为超声波萃取法。 

以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围之内。