免疫亲和沉淀法纯化抗体

摘要

本发明公开了一种免疫亲和沉淀法用于纯化抗体，其过程为：采用丙烯酰胺和丙烯酸为单体的共聚物固相微球作为固相载体，通过偶联剂——1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)将抗原连接到固相载体上形成免疫吸附剂，将待纯化的抗体原液与免疫吸附剂混合，充分反应后形成抗体-免疫吸附剂结合物，通过离心洗涤除去未结合的其他混合物，得到单一的抗体-免疫吸附剂结合物，再降低体系中的pH值，则抗体被解离到溶液中，通过离心分离上清后对上清透析，即得到纯化的抗体。本发明建立了一种操作简便、适合大量生产、制备纯度达到免疫亲和层析级别抗体的方法。

说明书

技术领域

本发明是一种免疫化学方面的抗体纯化新方法，主要涉及免疫化学的研究 和医药卫生的生产领域。

背景技术

在许多免疫化学的研究和医药卫生的生产过程中，常常需要免疫亲和层析 级别的纯化抗体。为了得到亲和力好、特异性强、纯度高的抗体，现在常用的 纯化方法是免疫亲和层析法。免疫亲和层析法的过程是：一般情况下，先用偶 联剂溴化氰(CNBr，有剧毒，操作时需要防护)将抗原连接到固相载体——琼 脂糖凝胶(Sepharose 4B或6B)上作为免疫吸附剂，然后将免疫吸附剂装入层 析柱中，用淋洗液洗去未被连接的抗原和连接剂后，即可上样待纯化的抗体混 合物，当混合物中的抗体与免疫吸附剂上连接的抗原靠近时，抗原抗体会产生 特异性结合，形成抗体-免疫吸附剂结合物，从而将需要纯化的抗体暂时地特异 固定在免疫吸附剂上，混合液中的其他组份则游离在液相中，充分反应后，淋 洗除去未结合的其他混合物，淋洗完的层析柱上只留下单一的抗体-免疫吸附剂 结合物，最后，再通过改变pH值，解离抗原和抗体的结合，从而洗脱下亲和力 好、特异性强、纯度高的抗体。

免疫亲和层析法用于纯化抗体时存在的缺点：①制备免疫吸附剂时，要使 用偶联剂溴化氰，该化合物有剧毒，操作时要特殊防护；②经活化的琼脂糖凝 胶比较昂贵，生产制备时购置成本高。

发明内容

本发明采用免疫亲和沉淀法纯化抗体：首先，采用以丙烯酰胺和丙烯酸为 单体的共聚物固相微球(该微球是圆球状，直径为2～5μm，可悬浮于水溶液中) 作为固相载体，这种固相载体上含有羧基(-COOH)，将含有氨基(-NH₂)的抗 原与固相载体混合，再加入偶联剂——1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚 胺(EDC)，室温震荡反应过夜，EDC能使羧基和氨基脱水形成酰胺键，从而将 抗原连接到固相载体上，形成了抗原-固相载体的免疫吸附剂。通过离心洗涤， 除去未被连接上的抗原和其他混合物后，得到单一的免疫吸附剂。然后，将待 纯化的抗体原液与免疫吸附剂混合，2～8℃放置过夜，抗原抗体产生特异性结合， 形成抗体-免疫吸附剂结合物，通过离心洗涤，除去未结合的其他混合物，得到 单一的抗体-免疫吸附剂结合物，再降低体系中的pH值，则抗体就会被解离到 溶液中，通过离心分离上清后立即用碱性溶液调整上清液的pH值到中性，此上 清经透析后即为纯化的抗体溶液。免疫吸附剂通过离心洗涤后悬浮于免疫吸附 剂保存液中，2～8℃放置，可重复用于纯化抗体。免疫吸附剂保存液的组份为： 0.02M PB(磷酸盐缓冲溶液，pH7.4)、0.9％NaCl、0.1％NaN₃。

本发明所用的固相载体制备成本低。抗原和固相载体的偶联剂是碳二亚胺 (EDC)，无毒性。连接过程为室温震荡过夜，非常简便。抗体的纯化过程，采 用的是最常用的离心方法，一次可大批量制备。而且，免疫吸附剂经纯化抗体 后，还可重复使用，2～8℃下也可长期保存。所以，本发明建立了一种操作简便、 不操作剧毒物、制备成本低廉、适合大量生产、可用于制备纯度达到免疫亲和 层析级别抗体的方法。

本发明操作步骤如下：

1、抗原的准备：用于本发明的抗原需要有氨基(-NH₂)，一般的蛋白质 抗原都有氨基，经过纯化后即可使用。

2、固相载体的准备：固相载体在偶联前，一般需要先用0.01MPB (pH7.4)的缓冲液离心洗涤3次，用以除去悬浮液中的杂物。本发明中 的通用离心条件为：离心机转速要求不小于每分钟3500转，离心时间不 小于10分钟，洗涤时每次用不小于10倍固相载体体积的0.01MPB (pH7.4)的缓冲液。

3、固相载体与抗原的连接：将固相载体和抗原(加入前测抗原的浓度) 共同混合于0.01MPB(pH7.4)的缓冲液中，再加入EDC的水溶液，于室 温下震荡反应过夜。因为固相载体上含有羧基，羧基在EDC的作用下可 与抗原上的氨基共价连接，从而使得固相载体和抗原产生稳定的共价连接 形成了免疫吸附剂。固相载体与抗原连接后，离心，测上清抗原浓度，从 而可计算免疫吸附剂上连接的抗原量。然后，再对免疫吸附剂离心洗涤至 上清A_280nm(溶液在280nm紫外光下的光吸收值)＜0.02。洗涤完后，免 疫吸附剂用等体积左右的0.01MPB(pH7.4)的缓冲液悬浮。

4、免疫吸附剂与抗体的结合：取一定体积的待纯化抗体原液直接加入到 免疫吸附剂悬浮液中，2～8℃放置过夜。次日，离心，沉淀物即为抗体- 免疫吸附剂，除去上清，将抗体-免疫吸附剂离心洗涤至上清A_280nm＜0.02。

5、抗体-免疫吸附剂的解离：取抗体-免疫吸附剂沉淀物，加入pH值为 2～3的甘氨酸-盐酸缓冲液，混匀，放置5分钟后离心，分离出上清后立即 用氢氧化钠溶液调整上清的pH值到7.0左右。此解离的上清即为纯化的 抗体溶液。

6、抗体纯化后的处理：将解离的上清用透析袋对0.01MPB(pH7.4)的 缓冲液透析，透析后用紫外分光光度仪测蛋白浓度。

7、免疫吸附剂的保存和重复使用：将纯化抗体后的免疫吸附剂离心洗涤 至上清A_280nm＜0.02，然后悬浮于免疫吸附剂保存液中，2～8℃保存，可重 复用于纯化抗体。

8、纯化抗体的检验：将纯化的抗体标记上¹²⁵I，再取少量¹²⁵I-抗体同含 过量抗原的免疫吸附剂混合反应足够时间，通过计算同一次实验中被结合 的¹²⁵I-抗体量占实验体系中加入的总¹²⁵I-抗体量的比率可间接得出纯化的 抗体中有活性的抗体量占纯化抗体总蛋白量的比率。

具体实施方式

实例：用免疫亲和沉淀法纯化兔IgG的抗体。

①兔IgG的纯化(此时兔IgG被当作抗原，对应的抗体为：兔IgG的抗体)： 取10ml兔血清，用硫酸铵沉淀法粗提，并对0.01MPB(pH7.4)的缓冲液透析， 4500ml/次，共更换三次透析液，得浓度为13.54mg/ml的兔IgG13.3ml。

②固相载体与兔IgG的连接：取1g固相载体用0.01MPB(pH7.4)的缓冲 液离心(3500r/min)洗涤3次，离心时间10分钟，每次用400ml 0.01MPB(pH7.4) 的缓冲液，固相载体离心后沉淀的体积大约为19ml。固相载体用19ml0.01MPB (pH7.4)的缓冲液复悬，取100μl此未连接兔IgG的固相载体悬浮液留样，再 加入上步粗提的兔IgG10ml，即135.4mg，及300mg EDC(上午11:00加完)， 室温震荡反应，下午15:00再补加200mg EDC，继续震荡反应过夜。次日离心， 分离出上清为30ml，测上清蛋白浓度为2.37mg/ml，则上清中含有71.1mg未被 连接的兔IgG，而固相载体上连接有64.3mg兔IgG。用400ml 0.01MPB(pH7.4) 的缓冲液离心(3500r/min)洗涤连接有兔IgG的免疫吸附剂，每次离心10分钟， 共离心洗涤3次后，测得上清A_280nm＝0.011。

③沉淀用20ml 0.01MPB(pH7.4)的缓冲液悬浮，取100μl此免疫吸附剂悬 浮液留样，再加40ml兔IgG的抗体血清，混合后2～8℃放置过夜。

④次日，3500r/min离心10分钟，分离上清，取沉淀；用400ml 0.01MPB (pH7.4)离心洗涤，每次离心10分钟，重复3次，测上清A_280nm＝0.017；取沉 淀，加入0.1M pH2.4甘氨酸-盐酸缓冲液30ml，混匀，5分钟后离心，分离出上 清，上清立即用2M NaOH溶液调整pH到7.0左右，并对0.01MPB(pH7.4) 的缓冲液透析，4500ml/次，共换三次透析液。最后，将免疫吸附剂离心洗涤至 上清A_280nm＜0.02后放于免疫吸附剂保存液中悬浮，2～8℃保存。

⑤用紫外分光光度仪测纯化的兔IgG的抗体蛋白浓度为2.04mg/ml(见表1)， 总体积有31ml，所以共收到63.24mg的纯化抗体。

⑥重复一次纯化抗体：将纯化抗体后的免疫吸附剂悬浮液离心取沉淀，再 重复③～⑤的操作步骤(第③步中，不需要再取100μl免疫吸附剂悬浮液留样)， 第二次操作得到纯化的兔IgG的抗体31ml，浓度为1.92mg/ml(见表1)，共 59.52mg。将两次纯化的抗体混合，得兔IgG的抗体62ml，浓度为1.98mg/ml， 共122.76mg。

表1纯化抗体的浓度检测表

注：蛋白浓度(mg/ml)＝1.45A_280nm-0.74A_260nm

⑦纯化抗体的检验：

(1)¹²⁵I-兔IgG的抗体的制备：取19.8μg/10μl纯化的兔IgG的抗体，加200μl 0.2MPB(pH7.4)、500μCi Na¹²⁵I溶液，混匀；加入15μg/30μl氯胺-T水溶液， 室温震荡反应1.5分钟；再加入30μg/30μl偏重亚硫酸钠水溶液，室温震荡反应 1.5分钟；将反应液上葡聚糖凝胶G-25分离柱，用0.01MPB(pH7.4)的缓冲液 淋洗，用γ-射线检测仪监测流出液的¹²⁵I放射性计数，流出液有两个放射性计 数峰，第一个峰即为¹²⁵I-兔IgG的抗体产品峰，收此产品峰约3ml共280μCi， 取20μl收到的¹²⁵I-兔IgG的抗体浓溶液加入到50ml实验缓冲液中，该实验缓 冲液组份为：0.02MPB(pH7.4)、0.5％BSA(牛血清白蛋白)、0.1％NaN₃。混匀， 此配好的溶液即为¹²⁵I-兔IgG的抗体标记物。如果收到的产品峰回收了80％投 入的兔IgG的抗体，则500μl¹²⁵I-兔IgG的抗体标记物中大约含¹²⁵I-兔IgG的 抗体量如下：

19.8μg×0.8÷3000×20÷50000×500≈1.1ng

(2)过量兔IgG-免疫吸附剂与¹²⁵I-兔IgG的抗体标记物的结合：用实验缓 冲液将留样的未连接兔IgG的固相载体悬浮液(用于做对照实验)和连接了兔 IgG的免疫吸附剂悬浮液分别按1∶50、1∶100、1∶200稀释，则每100μl 1∶ 200的免疫吸附剂悬浮液中含有兔IgG的量为：64.3mg÷(19+20)×0.1÷ 200≈0.8μg，1∶50和1∶100稀释度的免疫吸附剂中含有兔IgG的量则更多。将 各稀释度均做如下实验(见表2)：

表2兔IgG-免疫吸附剂与纯化抗体结合实验操作表

(3)数据处理：

以上每个滴度的实验管中，免疫吸附剂上的兔IgG的量都绝对过量于¹²⁵I -兔IgG的抗体量，同时反应时间也足够长(达到18～24小时)，因此两者的结 合应当能达到100％，如果不能达到100％，那么，不能被结合的¹²⁵I-标记物就 是少量失活的兔IgG的抗体及其他杂蛋白，所以：

结合率＝(结合管计数-对照管计数)÷(总计数管计数-对照管计数)

      ＝有活性的兔IgG的抗体÷(有活性的兔IgG的抗体+失活的兔IgG

        的抗体+其他杂蛋白)

结合率越高，则有活性的兔IgG的抗体量占纯化抗体总蛋白量的比率越大， 纯化的效果越好。结果如下：

表3兔IgG-免疫吸附剂与纯化抗体结合实验结果表

计算平均结合率为92.8％，说明有活性的兔IgG的抗体量占纯化抗体总蛋白 量的比率很高，纯化效果好。