应用于软硬组织修复与再生的生物医学材料

摘要

本发明的一实施例，提供一种生物医学材料，包括：生物相容性材料；以及载体，分布于该生物相容性材料的表面，其中该生物相容性材料与该载体两者均不带电荷、其中之一带电荷或两者均带电荷但为相异电性，其中该载体与该生物相容性材料的重量比为1∶100,000～1∶100，最优选为1∶10,000～1∶1,000。本发明的生物医学材料可作为牙科、骨科、伤口愈合或医学美容的用途及应用于各种软硬组织的修复与再生。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种生物医学材料(biomedical material)，特别是涉及一种长 效释放控制并可有效保护生物活性物质的生物医学材料。

【背景技术】

目前，牙(骨)缺损修复医材主要以Cotton-Gauze-based(第一代)及例如β- 磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石(hydroxyapatite)、生物活性玻璃(bioactive glass) 或胶原蛋白(collagen-based)等的第二代材料为主流，而现阶段牙缺损修复产 品的国际大厂(例如Nobel Biocare、Straumann、Biomet 3i、Zimmer Dental、 Dentsply Friadent)已进入第三代材料的研发，开发具有抗菌、抗发炎及活性 治疗(active therapy)功能的产品，但上述产品仍会有填补物逆流及牙骨再生 不良的情况发生，因此，如何有效包覆生物活性物质及包覆材料如何产生有 效成骨细胞结合生成反应(osteoblast migration and binding)是目前临床治疗 上众所期待解决的问题。

尽管目前已有开发生物医学载体内包含生长因子(growth factor，GF)的 活性治疗技术，例如：Medtronic infuse；吸附rhBMP-2蛋白的第一型牛胶原 蛋白载体(bovine collagen carrier)(包括海绵状胶原蛋白(collagen sponge)与颗 粒状胶原蛋白(collagen particles))，但包覆效果不佳，临床治疗上无法确定海 绵状胶原蛋白实际吸附BMP-2(其价格非常昂贵：10μg/300US)的量，故实际 使用量通常需高出理论用量，且海绵状胶原蛋白吸附的BMP-2进入体内后 极易在短时间内大量释放，且保存期限(shelf life)太短。此外，生长因子(GF) 本身即是一种蛋白质，在酸、碱及有机溶剂的作用下皆易变性(denature)与降 解(degradation)，在临床使用上亦会快速流失。对此，许多市面上产品改以 高浓度含量来避免流失，然而这种做法易造成诸多副作用。因此，开发一种 适合且具生物相容性的包覆材料与传输材料是相当急迫的研究。

【发明内容】

本发明的一实施例，提供一种生物医学材料，包括：生物相容性材料； 以及分布于该生物相容性材料的表面的载体，其中该生物相容性材料与该载 体两者均不带电荷、其中之一带电荷或两者均带电荷但为相异电性，其中该 载体与该生物相容性材料的重量比为1∶100,000～1∶100或1∶10,000～1∶1,000。 本发明生物医学材料可作为牙科、骨科、伤口愈合或医学美容的用途及应用 于各种软硬组织的修复与再生。

本发明以不含电荷或含正/负电荷的纳米载体(nanocarrier)作为包覆生物 活性物质的材料，可通过调整载体本身的配方组成来提高生物活性物质的功 效及包覆率，例如以磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)/维生素作为载体材 料时，可进一步提高人类骨形成蛋白(BMP-2)所产生碱性磷酸酶(alkaline  phosphatase，ALP)的活性。后续可利用正、负电荷吸引的方式，将载体吸附 固定于生物医学级材料(例如生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、骨 水泥(bone cement)等)的表面及孔隙内，或可使用造粒或压锭等方式，使至少 一种不带电荷的生物相容性材料与纳米载体两者相结合。本发明的生物医学 材料(本发明称之为Agglomer)外层进一步包覆生物医学级医材原料(例如同 时带有正电荷与负电荷的多糖体(polysaccharide)、胶原蛋白)(此技术称为层- 层包覆(layer by layer coating))，以达成长效释放控制并可有效保护生物活性 物质。本发明Agglomer的尺寸大小可通过上述作为核心结构的生物医学级 材料(例如生物活性玻璃陶瓷、骨水泥等)的大小加以控制，而Agglomer外层 所包覆的厚度则可通过组装层数与组装条件加以控制。本发明生物医学材料 所形成的微粒(microsphere)在临床上易操作使用，可作为广效、即时性的骨 再生填充修补物，弥补现阶段的产品缺陷，有利于发展成新一代骨科(牙科) 修复医材产品。

本发明纳米载体包覆技术，配合生物医学材料(即Agglomer)的技术开发 可达到骨传导(osteoconduction)与骨诱发(osteoinduction)之间的整合，使骨生 长获得支撑，符合生物力学需求，并进一步达到长效释放控制、准确定量生 物活性物质浓度以及避免生物活性物质变性(denature)等功效。

本发明制备纳米载体的过程中，以磷脂酰胆碱(PC)为主的脂质体 (liposome)原料经减压蒸馏后形成薄膜，再将例如富含血小板血浆(PRP)、人 类骨形成蛋白(BMP-2)或欲包覆的生物活性物质，利用低温超声波震荡进行 包覆。可利用不同脂质体配方组成调控载体带电性及界面稳定性，以利于后 续与生物医学材料(即Agglomer)的结合。

本发明以上述纳米载体、微粒(microsphere)并结合各种生物医学材料作 为骨科/牙科的修复材料。各种生物医学材料包括生物活性玻璃陶瓷、骨水 泥、胶原蛋白等。实际应用方式应视使用目的及用途而加以选择。本发明以 具备便利、简易使用的压锭技术为例作说明，但实际应用方式并不以此压锭 技术为限。首先，将各种生物医学骨材(例如生物活性玻璃陶瓷、羟基磷灰 石-磷酸三钙(HATCP)、β-磷酸三钙(β-TCP)、硫酸钙(Ca₂SO₄)、明胶(gelatin)、 聚乳酸-甘醇酸(PLGA)等)的粉体或颗粒结合包覆例如BMP-2等活性因子的 纳米载体/微粒，接着，即直接、快速地以压锭机压锭制作骨材。此外，可 使用不同形状的模具以适应各部位需求，并可依据不同需求进行配方设计 (例如加入粘合剂、崩解剂(disintegrant)、润滑剂或崩解抑制剂等)，以达缓释、 加强硬度等效果。压锭技术的优点包括：1.可正确控制剂量，2.可依据配方 设计控制药物解离速率，3.易于大量生产，成本低廉，以及4.运输保存及给 药方便。

为让本发明的上述目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举一优选实 施例，作详细说明如下：

【附图说明】

图1系根据本发明的一实施例，一种生物医学材料；

图2系根据本发明的一实施例，一种生物医学材料；

图3系根据本发明的一实施例，一种生物医学材料；

图4系根据本发明的一实施例，一种生物医学材料胶囊；

图5系根据本发明的一实施例，包覆生物活性物质(BMP-2)的纳米载体 (磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇)对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响；

图6系根据本发明的一实施例，包覆生物活性物质(BMP-2)的纳米载体 (磷脂酰胆碱(PC)/维生素)对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响；

图7系根据本发明的一实施例，包覆生物活性物质(BMP-2)的纳米载体 (磷脂酰胆碱(PC)/维生素A)对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响；

图8系根据本发明的一实施例，富含血小板血浆(PRP)中TGF-β1含量 随时间的变化；

图9系根据本发明的一实施例，富含血小板血浆(PRP)中PDGF-AB含 量随时间的变化；

图10系根据本发明的一实施例，生物医学材料(Agglomer)的释放控制 曲线；

图11系根据本发明的一实施例，生物医学材料(Agglomer)对碱性磷酸 酶(ALP)活性的影响；

图12A～12E系根据本发明的一实施例，生物医学材料(Agglomer)与其他 对照组对骨修复的效果；

图13系根据本发明的一实施例，生物医学材料(Agglomer)与其他对照 组对骨体积增加的效果。

【主要附图标记说明】

10～生物医学材料；

12～多孔性生物相容性材料；

14～载体；

16～多糖体层；

18～胶原蛋白层；

20～胶囊；

22～抗微生物剂。

【具体实施方式】

根据本发明的一实施例，披露了一种生物医学材料，如图1所示。生物 医学材料10包括生物相容性材料12以及载体14。载体14分布于生物相容 性材料12的表面。值得注意的是，生物相容性材料12与载体14可两者均 不带电荷、其中之一带电荷或两者均带电荷但为相异电性。载体14的电性 可根据生物相容性材料12的电性加以调整，以使载体14与生物相容性材料 12的电性相异。在一实施例中，可通过官能基化调整原中性载体的电性为 负电性或正电性。在一实施例中，载体14与生物相容性材料12的重量比大 体为1∶100,000～1∶100，亦可为1∶10,000～1∶1,000。

在一实施例中，生物相容性材料12可为多孔性生物相容性材料。在此 实施例中，载体14可分布于多孔性生物相容性材料12的表面或孔隙中，如 图1所示，或包覆于多孔性生物相容性材料12中。生物相容性材料12可包 括羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatite tricalcium phosphate，HATCP)、β-磷酸 三钙(β-tricalcium phosphate，β-TCP)、α-磷酸三钙(α-tricalcium phosphate， α-TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、硫酸钙、骨水泥(bone  cement)、明胶(gelatin)、胶原蛋白(collagen)、聚乳酸-甘醇酸 (poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚己内酯多元醇(polycaprolactone，PCL) 或弹性蛋白(elastin)。

载体14可由油脂所构成。构成载体14的油脂可包括例如双亚麻酰基磷 脂酰胆碱(dilinoleoyl phosphatidylcholine，DLPC)、二油酰基磷酯酰胆碱 (dioleoyl phosphatidylcholine，DOPC)或二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoyl  phosphatidylcholine，DSPC)的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、例如二硬 脂酰基磷脂酰乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine，DSPE)或二油酰基 磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine，DOPE)的磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine，PE)、1，2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷 (1，2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane，DOTAP)、2，3-二油酰氧基丙 基-三甲基氯化铵(2，3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium chloride， DOTMA)、例如二油酰基磷脂酸(dioleoyl phosphatidic acid，DOPA)的磷脂酸 (phosphatidic acid，PA)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)、例如二油酰 基磷脂酰甘油(dioleoyl phosphatidylglycerol，DOPG)的磷脂酰甘油 (phosphatidylglycerol，PG)、3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇 (3β-[N-(N′，N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol，DC-CHOL)、双十六 烷基磷酸盐(dihexadecyl phosphate，DHDP)或其衍生物。载体14中，油脂的 重量份大体为0.1～30重量份，优选为1～15重量份，均以载体14为100重 量份计。载体14可还包括维生素A、C、D、E、K、B1、B3、B6、B7、B12、 叶酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)或其衍生物等各种生理必须维生素，或是 钾、钙、铁、镁、锌、铜、锰、钼、镍、硅、铬、磷、硫或氯等各种生理必 须元素或矿物质。

生物医学材料10还可包括生物活性物质(未图示)，包覆于载体14内。 生物活性物质可包括各种生长因子(growth factor，GF)、蛋白质、多肽 (polypeptide)、DNA、RNA、细胞激素(cytokines)、细胞外基质(extracellular  matrix，ECM)、细胞附着分子(cell adhesion molecules，CAM)、富含血小板血 浆(platelets rich plasma，PRP)、粒细胞(granulocytes)或干细胞(stem cells)等。 上述生物活性物质的尺寸大小大体为2～10,000nm。

生物医学材料10外部还可包覆有多糖体层16，如图2所示。多糖体层 16可同时具有正电荷与负电荷。在一实施例中，多糖体层16可由例如负电 荷的藻酸盐(alginate)与例如正电荷的壳聚糖(chitosan)所构成。在一实施例 中，在多糖体层16外层，还可包覆有胶原蛋白(collagen)层18，如图3所示。

生物医学材料10可为单一颗粒状结构，其粒径大体为10～500μm。在 一实施例中，上述呈颗粒状结构的生物医学材料10亦可通过使用例如生物 粘着剂的生物粘着技术使多个颗粒状结构彼此聚集粘着而形成聚集体，该聚 集体尺寸大小可大于50μm，或大于1,000μm。

生物医学材料10与外层的多糖体层16及胶原蛋白(collagen)层18可进 一步制备形成胶囊20，如图4所示，例如软壳胶囊或硬壳胶囊。图中22所 指为抗微生物剂。

生物医学材料10与外层的多糖体层16及胶原蛋白(collagen)层18所共 同形成的微粒(microsphere)结构可广泛应用于牙科、骨科、伤口愈合或医学 美容及应用于各种软硬组织的修复与再生，例如应用于牙缺损(dental  defects)、植牙伤口(extraction wounds)、牙科复合式伤口(combined wounds)、 全身骨缺损(small or large bone defects)、颅颜整形外科(craniofacial plastic  surgery)、医疗美容(health beauty)或组织修复(tissue repair)等医疗领域。

根据本发明的一实施例，披露一种生物医学材料的制备方法，仍请参阅 图1。首先，提供生物相容性材料12与载体14。之后，混合生物相容性材 料12与载体14。值得注意的是，当生物相容性材料12与载体14两者均不 带电荷或其中之一带电荷时，可通过造粒或压锭制程，使生物相容性材料 12与载体14结合，而当生物相容性材料12与载体14两者均带电荷但为相 异电性时，则通过生物相容性材料12与载体14的相异电性，使载体14吸 附至生物相容性材料12的表面。

在一实施例中，生物相容性材料12可为多孔性生物相容性材料。在此 实施例中，当多孔性生物相容性材料12与载体14两者均不带电荷或其中之 一带电荷时，可通过造粒或压锭制程，使多孔性生物相容性材料12与载体 14结合，而当多孔性生物相容性材料12与载体14两者均带电荷但为相异 电性时，则通过多孔性生物相容性材料12与载体14的相异电性，使载体 14吸附至多孔性生物相容性材料12的表面或孔隙中，如图1所示。生物相 容性材料12可包括羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatite tricalcium phosphate， HATCP)、β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate，β-TCP)、α-磷酸三钙(α-tricalcium  phosphate，α-TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、硫酸钙、骨 水泥(bone cement)、明胶(gelatin)、胶原蛋白(collagen)、聚乳酸-甘醇酸 (poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚己内酯多元醇(polycaprolactone，PCL) 或弹性蛋白(elastin)。

载体14可由油脂所构成。构成载体14的油脂可包括例如双亚麻酰基磷 脂酰胆碱(dilinoleoyl phosphatidylcholine，DLPC)、二油酰基磷酯酰胆碱 (dioleoyl phosphatidylcholine，DOPC)或二硬脂酰基二硬脂酰基磷脂酰胆碱 (distearoyl phosphatidylcholine，DSPC)的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine， PC)、例如二硬脂酰基二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(distearoyl  phosphatidylethanolamine，DSPE)或二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoyl  phosphatidylethanolamine，DOPE)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine， PE)、1，2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷 (1，2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane，DOTAP)、2，3-二油酰氧基丙 基-三甲基氯化铵(2，3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium chloride， DOTMA)、例如二油酰基磷脂酸(dioleoyl phosphatidic acid，DOPA)的磷脂酸 (phosphatidic acid，PA)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)、例如二油酰 基磷脂酰甘油(dioleoyl phosphatidylglycerol，DOPG)的磷脂酰甘油 (phosphatidylglycerol，PG)、3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇 (3β-[N-(N′，N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol，DC-CHOL)、双十六 烷基磷酸盐(dihexadecyl phosphate，DHDP)或其衍生物。载体14中，油脂的 重量份大体为0.1～30重量份，优选为1～15重量份，均以载体14为100重 量份计。载体14可还包括维生素A、C、D、E、K、B1、B3、B6、B7、B12、 叶酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)或其衍生物等各种生理必须维生素，或是 钾、钙、铁、镁、锌、铜、锰、钼、镍、硅、铬、磷、硫或氯等各种生理必 须元素或矿物质。

本发明生物医学材料的制备方法还包括包覆生物活性物质(未图示)于 载体14内。载体14所包覆的生物活性物质可包括各种生长因子(growth  factor，GF)、蛋白质、多肽、DNA、RNA、细胞激素(cytokines)、细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)、细胞附着分子(cell adhesion molecules，CAM)、富 含血小板血浆(platelets rich plasma，PRP)、粒细胞(granulocytes)或干细胞(stem  cells)等。上述生物活性物质的尺寸大小大体为2～10,000nm。

在一实施例中，当生物医学材料10保存于-70℃～26℃的环境时，生物 活性物质的活性至少可维持35天。

于生物医学材料10外部，可还包括形成多糖体层16，如图2所示。多 糖体层16可同时具有正电荷与负电荷。在一实施例中，多糖体层16可由例 如负电荷的藻酸盐(alginate)与例如正电荷的壳聚糖(chitosan)所构成。在一实 施例中，在多糖体层16外层，可还包括形成胶原蛋白(collagen)层18，如图 3所示。

本发明以不含电荷或含正/负电荷的纳米载体(nanocarrier)作为包覆生物 活性物质的材料，可通过调整载体本身的配方组成来提高生物活性物质的功 效及包覆率，例如以磷脂酰胆碱(PC)/维生素作为载体材料时，可进一步提高 人类骨形成蛋白(BMP-2)所产生碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活 性。后续可利用正、负电荷吸引的方式，将载体吸附固定于生物医学级材料 (例如生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、骨水泥(bone cement)等)的 表面及孔隙内，或可使用造粒或压锭等方式，使至少之一不带电荷的生物相 容性材料与纳米载体两者相结合。本发明的生物医学材料(本发明称之为 Agglomer)外层进一步包覆生物医学级医材原料(例如同时带有正电荷与负电 荷的多糖体、胶原蛋白)(此技术称为层-层包覆(layer by layer coating))，以达 成长效释放控制并可有效保护生物活性物质。本发明Agglomer的尺寸大小 可通过上述作为核心结构的生物医学级材料(例如生物活性玻璃陶瓷、骨水 泥等)的大小加以控制，而Agglomer外层所包覆的厚度则可通过组装层数与 组装条件加以控制。本发明生物医学材料所形成的微粒(microsphere)于临床 上易操作使用，可作为广效、即时性的骨再生填充修补物，弥补现阶段的产 品缺陷，有利发展成新一代骨科(牙科)修复医材产品。

本发明纳米载体包覆技术，配合生物医学材料(即Agglomer)的技术开发 可达到骨传导(osteoconduction)与骨诱发(osteoinduction)之间的整合，使骨生 长获得支撑，符合生物力学需求，并进一步达到长效释放控制、准确定量生 物活性物质浓度以及避免生物活性物质变性等功效。

本发明制备纳米载体的过程中，以磷脂酰胆碱(PC)为主的脂质体 (liposome)原料经减压蒸馏后形成薄膜，再将例如富含血小板血浆(PRP)、人 类骨形成蛋白(BMP-2)或欲包覆的生物活性物质，利用低温超声波震荡进行 包覆。可利用不同脂质体配方组成调控载体带电性及界面稳定性，以利后续 与生物医学材料(即Agglomer)的结合。

本发明以上述纳米载体(nanocarrier)、微粒(microsphere)并结合各种生物 医学材料作为骨科/牙科的修复材料。各种生物医学材料包括生物活性玻璃 陶瓷、骨水泥、胶原蛋白等。实际应用方式应视使用目的及用途而加以选择。 本发明以具有便利、简易使用性的压锭技术为例作说明，但实际应用方式并 不以此压锭技术为限。首先，将各种生物医学骨材(例如生物活性玻璃陶瓷、 羟基磷灰石-磷酸三钙(HATCP)、β-磷酸三钙(β-TCP)、硫酸钙(Ca₂SO₄)、明胶、 聚乳酸-甘醇酸(PLGA)等)的粉体或颗粒结合包覆例如BMP-2等活性因子的 纳米载体/微粒，接着，即直接、快速地以压锭机压锭制作骨材。此外，可 使用不同形状的模具以适应各部位需求，并可依据不同需求进行配方设计 (例如加入粘合剂、崩解剂、润滑剂或崩解抑制剂等)，以达缓释、加强硬度 等效果。压锭技术的优点包括：1.可正确控制剂量，2.可依据配方设计控制 药物解离速率，3.易于大量生产，成本低廉，以及4.运输保存及给药方便。

【实施例1】

本发明维生素A衍生物的合成

(1)维生素A酯的制备

首先，将100mg维生素A醇溶于2ml三乙基胺。之后，加入等当量脂 肪酸酰氯(fatty-acid chloride)如乙基酰氯(acetyl chloride)等或脂肪酸 酐(fatty acid anhydride)如醋酸酐(acetic anhydride)等，于常温避光下 静置。反应过程以薄层分析。待维生素A醇完全消失后，将反应液倾倒入 水中并以乙酸乙酯萃取的。将乙酸乙酯分离并以无水硫酸钠进行脱水、干燥， 再经减压抽干后，以管柱进行产物纯化。

(2)烷基维生素A酯的制备

首先，将350mg维生素A酸溶于20ml乙酸乙酯。之后，加入等当量碳 酸钾及2当量烷基碘化物(alkyl iodide compound)如甲基碘 (iodomethane)加热回流2小时。将反应液冷却加入水中并进行水洗三次。 将乙酸乙酯分离并以无水硫酸钠进行脱水、干燥，再经减压浓缩后，以管柱 进行产物纯化。

将维生素A或维生素A衍生物以混掺形成离子键结的方式或利用接枝 技术导入纳米载体。

【实施例2】

本发明包覆生物活性物质(BMP-2)的纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇 /维生素A)的制备

(1)本实施例采用薄膜水合/超声波震荡法(thin-film hydration/sonication  method)进行纳米载体对人类骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2， BMP-2)的包覆。首先，将磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)为主的脂质体 (liposome)原料(其余组成包含胆固醇、双十六烷基磷酸盐(DHDP)、1，2-二油 酰氧基-3-三甲基氨基丙烷(DOTAP))进行减压蒸馏以形成薄膜。之后，利用 低温(-10～4℃)超声波震荡，进行对人类骨形成蛋白(BMP-2)的包覆。包覆人 类骨形成蛋白(BMP-2)后的纳米载体粒径大约小于200nm。不同纳米载体的 油脂重量比例组成如下表1所示。本实施例利用不同纳米载体的配方组成以 调控纳米载体的带电荷度与界面稳定性，以利后续与Agglomer的结合。

表1

(2)参考表1配方11的重量比例，进一步将磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholine，PC)搭配其它油脂如磷脂酸(phosphatidic acid，PA)、磷脂 酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)或1，2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙 烷(1，2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane，DOTAP)与维生素A形成脂 质体来包覆生长因子，结果如表2所示，包覆人类骨形成蛋白(BMP-2)后的 纳米载体粒径大部分小于100nm。

表2

【实施例3】

本发明包覆生物活性物质(BMP-2)的纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇) 对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响

C₂C₁₂细胞培养

C₂C₁₂细胞购自BCRC生物资源保存与研究中心，培养于5％CO₂细胞 培养箱中，并冷冻保存于液态氮桶中。细胞培养及继代使用DMEM(10％胎 牛血清(Fetal bovine serum，FBS))及1％盘尼西林/链霉素(streptomycin))的培 养基，当细胞培养至90％聚满(confluence)时以1∶10的稀释比例继代培养。

ALP测试方法

取C₂C₁₂细胞调整细胞浓度为4×10⁴个细胞/ml，在24-井细胞培养盘中 置入0.5ml，放入5％CO₂细胞培养箱中静置18小时，使细胞均匀贴附于细 胞培养盘内。将贴附完成的细胞培养盘中的培养基更换成DMEM(2％FBS)， 并加入实施例2表2编号4的样品。BMP-2的包覆量为10μg/mL～100μg/mL。 在细胞培养箱中静置72小时，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer  saline)(PBS Buffer)清洗细胞后，加入溶解缓冲液(lysis buffer)后，以离心取 得上清液进行双辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)测定检测蛋白质浓度，及 使用对-硝基苯基棕榈酸盐(p-nitrophenyl palmitate，pNPP)基质测试ALP活 性。

请参阅图5，结果显示：经本实施例纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇) 包覆后的人类骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2，BMP-2)比未 经纳米载体包覆的人类骨形成蛋白(BMP-2)可提升碱性磷酸酶(alkaline  phosphatase，ALP)的活性大约1.5～1.7倍。

【实施例4】

本发明包覆生物活性物质(BMP-2)的纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇 /维生素)对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响

ALP测试方法

取C₂C₁₂细胞调整细胞浓度为4×10⁴个细胞/ml，在24-井细胞培养盘中 置入0.5ml，放入5％CO₂细胞培养箱中静置18小时，使细胞均匀贴附于细 胞培养盘内。将贴附完成的细胞培养盘中的培养基更换成DMEM(2％FBS)， 并加入实施例2表2编号3的样品。其余加入的纳米载体包覆不同维生素。 在细胞培养箱中静置72小时，以PBS清洗细胞后，加入溶解缓冲液(lysis  buffer)后，以离心取得上清液进行双辛可宁酸测定(BCA assay)检测蛋白质浓 度，及使用对-硝基苯基棕榈酸盐基质(pNPP substrate)测试ALP活性。

请参阅图6，结果显示：经本实施例纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇/ 维生素A)包覆后的人类骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2， BMP-2)比未经纳米载体包覆的人类骨形成蛋白(BMP-2)可大幅提升碱性磷 酸酶的活性大约3倍之多(由3.1提升至9.9)，且比未经纳米载体包覆的2倍 (100μg/ml)人类骨形成蛋白(BMP-2)所产生的碱性磷酸酶(ALP)活性(5.1)还 高。

【实施例5】

本发明包覆生物活性物质(BMP-2)的纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇 /维生素A)对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响

ALP测试方法

取C₂C₁₂细胞调整细胞浓度为4×10⁴个细胞/ml，在24-井细胞培养盘中 置入0.5ml，放入5％CO₂细胞培养箱中静置18小时，使细胞均匀贴附于细 胞培养盘内。将贴附完成的细胞培养盘中的培养基更换成DMEM(2％FBS)， 并加入实施例2表2编号3的样品。样品包覆0.03μmol/mL～0.3μmol/mL剂 量维生素A。在细胞培养箱中静置72小时，以PBS清洗细胞后，加入溶解 缓冲液(lysis buffer)后，以离心取得上清液进行双辛可宁酸测定(BCA assay) 检测蛋白质浓度，及使用对-硝基苯基棕榈酸盐基质(pNPP substrate)测试ALP 活性。

请参阅图7，结果显示：经本实施例纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇/ 维生素A(高剂量0.26μmol/mL))包覆后的人类骨形成蛋白(human bone  morphogenetic protein 2，BMP-2)比未经纳米载体包覆的人类骨形成蛋白 (BMP-2)可大幅提升碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性大约19倍 之多(由0.65提升至11.3)，且比未经纳米载体包覆的4倍(200μg/ml)人类骨 形成蛋白(BMP-2)所产生的碱性磷酸酶(ALP)活性(1.7)还高。显而易见，当提 高纳米载体维生素A的剂量时，将使碱性磷酸酶(ALP)的活性显著攀升。

【实施例6】

本发明纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/胆固醇)包覆的生物活性物质(PRP) 的活性随时间的变化

将实施例2表2编号2的负电纳米载体与编号4的正电纳米载体包覆 PRP后(如包覆BMP-2的方法)，保存于4℃环境下，分别于8天与35天时 取样，利用ELISA kit分析TGF-β1、PDGF-AB含量，并比较和观察含量变 化。

富含血小板血浆(platelets rich plasma，PRP)含多种活性生长因子，例如 VEGF、PDGF、TGF-β、FGF等，属于自体(autologous)浓缩血小板，可利用 离心机分离纯化浓缩获得。

请参阅图8～9，图8为经本发明负电与正电纳米载体包覆的PRP，其 TGF-β1含量随时间的变化，图9为经本发明负电与正电纳米载体包覆的 PRP，其PDGF-AB含量随时间的变化。结果显示：本实施例纳米载体(磷脂 酰胆碱(PC)/胆固醇)可有效保存富含血小板血浆(PRP)，使其活性在4℃环境 下仍可维持至少35天，传统血库的血液细胞保存只有7天，通常使用时间 约3～5天，过期即抛弃，而本发明建立了长效保存PRP的方法。

【实施例7】

本发明生物医学材料(Agglomer)的制备

首先，将生物医学玻璃(bioglass)、HATCP或硫酸钙等生物医学材料以 不同筛目(mesh)进行过筛，取100～600筛目的生物医学材料。之后，将上述 100～600筛目的生物医学材料与实施例2表2编号1～4的纳米载体进行混掺。 纳米载体与生物医学材料的混掺比例为1∶20,000。

【实施例8】

本发明生物活性支架(壳聚糖/胶原蛋白)的制备

首先，将1％(w/w)的醋酸溶液配制成1％～3％的壳聚糖(chitosan)溶液。 之后，将壳聚糖溶液与胶原蛋白(collagen)溶液以7∶1～1∶7的比例进行混合， 以形成混合液，此阶段操作于4℃的反应槽内进行。接着，在上述混合液中 加入0.02％～3％浓度的戊二醛或栀子素(genipin)进行交联反应。之后，将此 混合液注入模具中，以慢速冷冻至-20℃达24小时冻干。最后，以酒精清洗 数次，再以水清洗后冻干，即完成本实施例生物活性支架(壳聚糖/胶原蛋白) 的制作。

【实施例9】

本发明微粒(microsphere)的制备

首先，取50mg多孔性HATCP作为核心结构，将1ml实施例2表2所 制备带正电荷的纳米载体(nanocarrier)大量吸附于多孔生物医学玻璃中，如实 施例7混掺比例。之后，将此生物医学材料涂布1％～5％正电荷的壳聚糖 (chitosan)，再涂布1％～5％负电荷的藻酸盐(alginate)，形成相斥电荷吸附的 多糖体层(polysaccharide shell)。最后，再涂布1％～5％胶原蛋白(collagen)或 明胶(gelatin)，以完成本实施例多层微粒(microsphere)结构的制备。

【实施例10】

本发明生物医学材料(Agglomer)的控制释放

将实施例7所制备的Agglomer置于水溶性缓冲溶液中观察其控制释放 情形。取样时间分别为起始点、1小时、3小时、8小时、1天、2天、4天、 8天、12天与14天。取样后以ELISA进行分析，结果如图10所示。

结果显示：Agglomer置于水溶液时，就会有部份释放，至4天后开始 有较明显释出。而于12天后开始大量释放。此即表示Agglomer对BMP-2 的释放可达14天以上。理论值OD₄₅₀＝1.48时，释放率为100％。

【实施例11】

本发明生物医学材料(Agglomer)对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响

取C₂C₁₂细胞调整细胞浓度为4×10⁴个细胞/ml，在12-井细胞培养盘中 置入1.0ml，放入5％CO₂细胞培养箱中静置18小时，使细胞均匀贴附于细 胞培养盘内。将贴附完成的细胞培养盘中的培养基更换成DMEM(2％FBS)， 放入8.0μm孔径的transwell，将生物医学材料(Agglomer)如实施例7样品置 放其中再加入培养基覆盖样品。在细胞培养箱中静置72小时，以PBS清洗 细胞后，加入溶解缓冲液(lysis buffer)后，以离心取得上清液进行双辛可宁酸 测定(BCA assay)检测蛋白质浓度，及使用对-硝基苯基棕榈酸盐基质(pNPP substrate)测试ALP活性。

请参阅图11，结果显示：含实施例5所制备的纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/ 胆固醇/维生素A(高剂量0.26μmol/mL))的Agglomer，其人类骨形成蛋白 (human bone morphogenetic protein 2，BMP-2)比未经纳米载体包覆的人类骨 形成蛋白(BMP-2)可提升碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性大约5 倍之多(由1.00提升至5.40)。

【实施例12】

本发明生物医学材料(Agglomer)的骨修复效果

将实施例2所制备带正电荷的纳米载体与200μm大小带负电的生物医 学玻璃(bioglass)进行混掺，以此Agglomer(如实施例7，但纳米载体与生物 医学材料混掺比例调整为1∶7,000)进行动物实验。以器具切除老鼠5mm*5mm 大小的骨头(如图12A所示)，观察12周。进行测试的材料包括第一代修复 材料，目的即是为验证本发明纳米载体的功效。本实施例纳米载体结合带负 电且经FDA认可的生物医学材料，与其它对照组比较骨修复的状况。

12周后，利用X-Ray检测修复情况，结果显示：仅使用胶原蛋白(collagen) 的对照组并无骨修复的情形(如图12B所示)，仅使用生物医学玻璃(bioglass) 的对照组略有看到骨修复(如图12C所示)，而加入纳米载体的组别(如图12E 所示)则比其它组的修复效果好，尤其是裂隙连接(gap junction)的位置比含 BMP-2(未包覆)的生物医学玻璃组(如图12D所示)来的好。因此，可证实利 用生物医学玻璃/纳米载体的组装对骨修复的效果确实较好。但是，骨修复 密度可能与含BMP-2(未包覆)的生物医学玻璃组相差不多。因此，可改用 Agglomer/纳米载体(磷脂酰胆碱(PC)/维生素/BMP-2)，由于提高了BMP-2的 功效与Agglomer的控制释放效果，这将有助于骨修复密度的提升以及更佳 的骨整合(osseointegration)，并降低BMP-2的使用量。上述利用micro-CT影 像分析，12周骨缺损愈合修复的结果如图13所示，含有BMP-2的组别，其 骨体积(bone volume＝BV/TV)增加最多，其中以纳米载体包覆生长因子 (BMP-2)的组别最佳。

【实施例13】

本发明生物医学材料(Agglomer)的压锭

为实现本发明纳米载体(nanocarrier)、微粒(microsphere)可顺利与各式生 物医学材料结合，并可依据需求设计配方加入不同赋形剂以达到缓释或增加 硬度的效果，因此，本实施例将纳米载体与不同生物医学骨材(主材料)(生物 医学玻璃(bioglass)、羟基磷灰石-磷酸三钙(HATCP)、β-磷酸三钙(β-TCP))及 赋形剂(如粘合剂(例如纤维素、羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)、甲基 纤维素、海藻酸钠(sodium alginate)、明胶(gelatin))、润滑剂(例如硬脂酸镁、 二氧化硅))依不同比例均匀混合(各配方的组成比例如下表3所示)，进行压 锭。本发明所使用的生物医学材料不以多孔性为限，如下表6的主材料为非 多孔性β-磷酸三钙。以下结果显示本发明纳米载体可与生物医学材料结合并 包覆于其中。压锭后的测试重量及硬度结果如下表4～6所示。

表3

*主材料中含有5％的纳米载体

表4(主材料为生物医学玻璃)

  配方一   配方二   配方三   锭剂重量(mg)   581.1   490.8   329.9   锭剂硬度(kg)   1.56   2.08   2.24

表5(主材料为羟基磷灰石-磷酸三钙)

  配方一   配方二   配方三   锭剂重量(mg)   558.1   399.5   342.0   锭剂硬度(kg)   1.32   1.21   4.55

表6(主材料为非多孔性β-磷酸三钙)

  配方一   配方二   配方三   锭剂重量(mg)   731.3   443.6   407.6   锭剂硬度(kg)   4.30   1.73   5.84

根据上述测试结果显示：本发明纳米载体、微粒可顺利与各式生物医学 材料结合，并可依据需求设计不同配方以控制硬度，必要时亦可加入崩解剂 或抑制崩解剂等，以控制药物释出速率，甚至可搭配膜衣等表面改质技术， 或是加入其他材料使用，以达到保护与控制释放的效果。

虽然本发明已以优选实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何 本发明所属技术领域中的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，应可 作任意更改与润饰。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求书限定的范 围为准。