基于氧化石墨烯纳米材料的智能给药体系的构建与其应用于组织修复与神经再生的体内外研究

摘要

目的:基于纳米氧化石墨烯(GO)，拟构建以蛋白药物基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的递送为外壳、酶响应性释放的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因载体复合物为内核的蛋白与基因序贯释放的智能水凝胶微管，结合导电材料聚吡咯(PPY)的电生理作用，以期达到加速皮肤组织创伤愈合与神经再生修复的治疗效果。
　　方法:1.采用原位聚合法制备GO-PPY，并通过电导仪、扫描电镜、红外光谱分别对其导电性、形态与官能团结构进行定性分析，并对其蛋白的缓释效果与保护功能进行研究，最后考察GO-PPY/SDF-1水凝胶对BMSCs的趋化迁移和粘附能力，以及生物相容性;2.采用酰胺缩合反应制备GO-PEI及MMP-2酶响应性断裂多肽修饰的GO-PEI，再以点击化学法用linker将GO-PEI上的多肽相连，得到层层相连的Crosslinked GO-PEI，通过红外光谱、扫描电镜、XPS分别对其结构官能团、MMP-2酶响应性断裂、PEI的接枝率进行定性定量分析，考察不同复合物包裹质粒DNA(pDNA)的效率、细胞转染效率以及细胞毒性三项指标;3.通过3D打印法制备外壳为GO-PPY/SDF-1、内核为Crosslinked GO-PEI/bFGF pDNA的蛋白与基因序贯释放的同轴水凝胶微管，并通过循环伏安法和力学拉伸实验对水凝胶的导电性和结构力学性能进行分析，考察不同载体基因转染的蛋白表达以及对BMSCs向神经分化潜能的影响;4.建立大鼠皮肤创伤模型并利用构建的智能水凝胶微管进行创伤修复治疗，通过对愈合皮肤组织进行马森染色、免疫荧光染色来考察皮肤组织修复和神经再生的效果，并对治疗组各脏器官进行HE染色观察智能水凝胶制剂对大鼠的生物安全性。
　　结果:GO-PPY不仅对负载的蛋白药物SDF-1起到了缓释的效果，而且还保护了蛋白不被酶快速降解。同时，SDF-1的释放增加了BMSCs的趋化迁移和粘附能力，也证明了GO-PPY/SDF-1水凝胶对BMSCs有良好的生物相容性。酶响应断裂基因载体Crosslinked GO-PEI中PEI的接枝率为62wt％，且可以在MMP-2酶作用下响应性断裂，当pDNA与载体Crosslinked GO-PEI为最佳质量比3∶1时，对BMSCs的转染效率最高，且没有明显的细胞毒性。最后证明了经3D打印的同轴智能水凝胶微管由于GO-PPY的加入不仅具有良好的导电性能，还增加了凝胶的强度。同时证明了导电材料GO-PPY和bFGF基因转染共同作用，可以促使BMSCs向神经细胞分化。最终的体内实验证明，该智能水凝胶促进了大鼠皮肤创面的伤口愈合以及神经再生，同时具有较好的生物安全性。
　　结论:GO-PPY/SDF-1/Crosslinked GO-PEI/pDNA水凝胶微管，实现了蛋白药物SDF-1与bFGF基因序贯释放，不仅可以缓释和保护蛋白药物，同时它的导电性能、高效转染BMSCs和调控基因的表达在促使皮肤创伤修复与神经再生方面具有良好的潜力。

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致谢

摘要

全文缩写表

前言

第一章 基于氧化石墨烯／聚吡咯的蛋白递送体系的构建及体外药效学评价

1．1 仪器与试剂

1．1．1 仪器

1．1．2 试剂

1．1．3 动物

1．2 实验方法

1．2．2 GO-PPY的导电性考察

1．2．5 GO-PPY／SDF-1水凝胶的制备

1．2．6 BMSCs的提取分离与培养

1．2．7 BMSCs的趋化迁移能力考察

1．2．8 BMSCs与GO-PPY／SDF-1水凝胶微管的粘附性考察

1．2．10 数据统计

1．3 实验结果与讨论

1．3．3 GO-PPY负载蛋白释放浓度筛选

1．3．4 GO-PPY的蛋白稳定性保护考察

1．3．5 BMSCs体外趋化迁移能力的考察

1．3．6 BMSCs与凝胶制剂的粘附性考察结果

1．3．7 凝胶制剂对BMSCs细胞相容性考察结果

1．4 本章小结

第二章 MMP-2酶响应性断裂的基因转染体系的构建及基因复合物的筛选

2．1 仪器与试剂

2．1．1 仪器

2．1．2 试剂

2．1．3 动物

2．2 实验方法

2．2．1 GO-PEI的合成与表征

2．2．2 Linker的合成

2．2．5 Crosslinked GO-PEI基因载体的MMP-2酶响应性断裂分析

2．2．6 血清干扰下的BMSCs染效率评价

2．2．7 载体的细胞毒性评价

2．2．8 pDNA的摄取实验

2．2．9 数据统计

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 PEI的接枝率分析

2．3．2 Linker的1H-NMR分析

2．3．3 Crosslinked GO-PEI的FTIR

2．3．4 Crosslinked GO-PEI基因载体的MMP-2酶响应性断裂分析

2．3．5 凝胶阻滞电泳

2．3．6 血清干扰下的BMSCs转染效率评价

2．3．7 细胞毒性检测

2．3．8 pDNA摄取结果

2．4 本章小结

第三章 智能水凝胶的构建与诱导BMSCs向神经细胞分化的研究

3．1 仪器与试剂

3．1．1 仪器

3．1．2 试剂

3．2 实验方法

3．2．1 蛋白与基因序贯释药的智能水凝胶的制备与表征

3．2．2 结构力学性能检测

3．2．3 导电性能考察

3．2．4 bFGF基因转染的蛋白表达水平分析

3．2．5 BMSCs体外诱导向神经分化的免疫荧光染色

3．2．6 数据统计

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 智能水凝胶的形态宏观分析与SEM分析

3．3．2 智能水凝胶的结构力学性能分析

3．3．3 智能水凝胶的导电性质考察

3．3．4 bFGF基因转染的蛋白表达水平分析

3．3．5 体外诱导BMSCs向神经细胞分化

3．4 本章小结

第四章 智能水凝胶促进组织修复与神经再生的体内评价

4．1 仪器与试剂

4．1．1 仪器

4．1．2 试剂

4．1．3 实验动物

4．2 实验方法与步骤

4．2．1 智能水凝胶制剂促进创伤愈合效率评价

4．2．2 皮肤组织切片分析

4．2．3 Masson染色

4．2．4 皮肤神经再生评估

4．2．6 HE染色

4．2．7 统计学分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 体内创伤愈合效率研究

4．3．2 Masson染色

4．3．3 皮肤组织神经再生评估

4．3．4 创伤愈合后bFGF蛋白表达量的考察

4．3．5 HE染色

4．4 本章小结

全文总结

参考文献

综述 新型局部给药系统促进神经再生与组织修复

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