公开/公告号CN102973939A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-03-20
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申请/专利权人 上海美加净日化有限公司;
申请/专利号CN201210398690.1
申请日2012-10-18
分类号A61K39/395(20060101);A61K8/99(20060101);C07K16/12(20060101);A61P1/02(20060101);A61Q11/00(20060101);
代理机构31224 上海天翔知识产权代理有限公司;
代理人吕伴
地址 200333 上海市普陀区金沙江路1829号
入库时间 2024-02-19 16:29:48
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-08-06
授权
授权
2014-05-07
著录事项变更 IPC(主分类):A61K39/395 变更前: 变更后: 申请日:20121018
著录事项变更
2013-04-17
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K39/395 申请日:20121018
实质审查的生效
2013-03-20
公开
公开
技术领域
本发明涉及口腔用品技术领域，特别涉及一种含抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂及其制备方法和含抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌混合特异性IgY抗体制剂的用于预防龋齿和牙龈炎及其口臭的牙膏。
背景技术
我国3~6岁儿童患龋率为25.49%~92.72%，成人患龋率为40.37%。其中变形链球菌和远缘链球菌是主要致龋菌。细菌感染性疾病的发生，首先是通过细菌表面结合的粘附素与其存在于上皮细胞、内皮细胞、白细胞或细胞外基质中相应的受体发生特异性结合而定居于机体内的特定器官。变形链球菌和远缘链球菌的感染正是利用食物中的蔗糖合成大量的胞外多糖构成牙菌斑的间质，有助于细菌对牙面的附着及细菌间的相互附着，形成菌斑。人们一直期望通过抑制变形链球菌和远缘链球菌的毒性来达到防龋的目的。近几年抗变形链球菌和远缘链球菌IgY作为一种新型的生物防龋物质受到广泛关注。目前用于预防龋病的牙膏一般为含氟牙膏，在清除口腔致龋菌的同时也破坏了口腔内维持微生态平衡的有益菌，
此外，我国牙龈、牙周疾病发病率占人口的70%以上，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是慢性龈缘炎、慢性牙周炎、侵袭性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌，其菌毛能够与口腔上皮细胞表面的甘油醛-3-磷酸脱氢酶结合，侵入牙龈上皮细胞和牙龈成纤维细胞，逃避免疫清除。牙龈卟啉单胞菌产生二肽酰氨肽酶降解结缔组织，促进MMP-2和MMP-1活性增加。牙龈卟啉单胞菌的精氨酸和赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（RgpA、RgpB、Kgp）能水解L-12导致INNγ产生减少。部分牙龈卟啉单细胞毛能够诱导巨噬细胞表达L-1α、L-1β、L-6、TNFα导致牙槽骨破坏。在牙周病患者同时伴随着口臭的发生，其口臭主要有具核梭杆菌引起。目前 没有有效的治疗口臭的方法，使用抗菌素类药物治疗口臭有很多弊端。
对于预防和治疗牙周病和口臭从主要的病因菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌中着手是关键所在。
目前用于预防和治疗牙周炎的牙膏一般为含有中草药成分的牙膏。虽然这类的专利有很多，但均无明确疗效。
现有文献报道表明临床上使用特异性IgY抗体预防龋齿和治疗婴幼儿轮状病毒性腹泻，预防肺纤维化患者绿脓杆菌感染，减轻幽门螺杆菌引起的胃痛效果显著，且无副作用和成瘾性。
在我们研究的许多种类的IgY中发现，有的牙周病因菌免疫母鸡产生的IgY抗体经实验证明没有或没有明显的抑制牙周病和口臭的趋势和疗效。简单的说，不是所有的IgY都有明显的治疗作用。
由于牙周病和口臭的可疑病因菌有十一种之多，但主要的可疑病因菌包括牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线菌放线杆菌、栖牙密螺旋体、福氏拟杆菌、牙龈二氧化碳噬纤维菌等。在探索制备对应的IgY用于治疗牙周病和口臭的同时，我们推测牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线菌放线杆菌、栖牙密螺旋体、福氏拟杆菌、牙龈二氧化碳噬纤维菌都有可能引起牙周病和口臭；因为我们事先无法预测在这当中的哪些菌是引起牙周病和口臭的主要因素，哪些菌是引起牙周病及其口臭是次要因素。
我们认为必须有合适的抗牙周病和口臭的试验来确定哪些菌是引起牙周病和口臭的主要因素。从而指导制备抗牙周病和口臭的药物或卫生产品。
目前的现有技术没有相关的提示指导技术人员发现抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌混合IgY是解决治疗牙周病及其口臭的关键。
技术人员无法预先在不做抗牙周病和口臭的实验的前提下，预先得知牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。
技术人员无法预先在不做抗牙周病和口臭的实验的前提下，预先得知抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌混合IgY比单独的抗牙龈卟啉单胞菌IgY、单独的抗具核梭杆菌IgY的效果更好。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种抗变形链球菌和远缘链 球菌混合特异性IgY抗体制剂。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种含抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种含抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂的用于预防龋齿和牙龈炎及其口臭的牙膏。
作为本发明第一方面的抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂，其特征在于，由10～70重量份的变形链球菌菌体和菌体碎片与30～90重量份的远缘链球菌菌体和菌体碎片混合成抗原免疫产蛋母鸡而制备。
作为本发明第二方面的抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A．变形链球菌和远缘链球菌培养步骤
A.1细菌种类：变形链球菌（S.mutans）和远缘链球菌（S.sobrinus）；
A.2取变形链球菌（S.mutans）MT8148菌株和远缘链球菌（S.sobrinus）6715菌株，分别经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的变形链球菌、远缘链球菌，并经鉴定确认为变形链球菌、远缘链球菌而得到变形链球菌菌体和菌体碎片、远缘链球菌菌体和菌体碎片；
B．免疫原制备步骤：
B.1取变形链球菌菌体和菌体碎片10～70重量份，远缘链球菌菌体和菌体碎片30～90重量份混合成菌液抗原；
B.2将等体积的菌液抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂变形链球菌和远缘链球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐剂混合免疫原含有细菌10亿-80亿；
B.3将等体积的混合菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂变形链球菌和远缘链球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐剂混合免疫原中含有细菌10亿-80亿；
C．免疫步骤：
使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.5ml-3.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐 剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡。加强免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫五次，前后共免疫八次；
D．变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY提取物的制备：
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，使用75%的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用冰醋酸调节酸碱度至pH5.30-5.50，然后放置-20℃冻藏3天后取出解冻，取上清液，用凝胶过滤系统将蛋黄液浓缩20倍，用1NNaOH调节PH至7.0-8.0，置-20℃保藏。
上述抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂的制备方法，在所述步骤D后增加一IgY纯化步骤，具体是将变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY提取物加硫酸胺至55%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水经中空纤维过滤器除盐，即得抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂纯品。
在本发明一个优选实施例中，所述步骤D用以下方法所取代：收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，用75%酒精消毒鸡蛋外壳，打碎蛋壳，留取蛋黄。用去离子水10倍稀释蛋黄后，用冰醋酸和无水乙酸钠调节PH至5.30-5.50.，4℃沉降后取上清液，添加2%的壳聚糖和海藻酸钠，2%氯化钙和多聚磷酸钠絮凝沉降，再取上清液用凝胶过滤系统超滤去除多余的去离子水，将蛋黄液浓缩20倍左右，用1N氢氧化钠调节PH至7.0-8.0，置-20℃保藏。
作为本发明第三方面的含有上述抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂的用于预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭的牙膏，包含有由抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂构成的抗致病菌制剂，所述抗致病菌制剂由占牙膏总质量的质量百分比原料组成：
抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌混合特异性IgY抗体和抗变形链球菌、远缘链球菌混合特异性IgY抗体按1:1质量比混合后的制剂0.1-3.0%、洗必泰0.01-2.0%、甘油1.0-30.0%、聚乙烯吡咯烷酮0.1-2.0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮构成抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂、抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂的保护剂。
在本发明所述牙膏的一个优选实施例中，还包含牙膏膏剂，所述牙膏膏剂由占牙膏总质量的质量百分比原料组成：卡波浦尔0.1～0.5%、羧甲基纤维素钠0.5～1.3%、卡拉胶0.2～0.5%，黄原胶0.3～0.7%，甘油5.0～20.0%，山梨醇5.0～70.0%，阿斯巴甜0.1～0.5%；糖精钠0.1～0.3%，PEG-6000.5～5.0%，PEG-12000.5～5.0%，椰油酰胺丙基甜菜碱0.1-2.0%，香精0.8～2.0%，SiO21.0～30%，去离子水余量。
本发明用于预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭的牙膏对预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭病菌具有明显的效果。
本发明的预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭的IgY牙膏区别于含氟牙膏的优势即在清除口腔致龋菌的同时还保护了口腔内维持微生态平衡的有益菌，弥补了传统预防龋病方法的不足之处。
本发明的预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭的IgY牙膏用于预防变形链球菌、远缘链球菌以及与其有共同抗原决定簇的厌氧菌引起的龋齿、牙龈炎和由牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌以及与其有共同抗原决定簇的厌氧菌引起的牙周炎及口臭等。
具体实施方式
下面结合实施例详细描述本发明的实现方案。下面实施例所涉及的菌种皆由上海交通大学医学院提供。
实施例1：
抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂的制备：
A．变形链球菌和远缘链球菌培养步骤
A.1细菌种类细菌种类：变形链球菌（S.mutans）和远缘链球菌（S.sobrinus）；
A.2取变形链球菌（S.mutans）MT8148菌株和远缘链球菌（S. sobrinus）6715菌株，分别经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的变形链球菌、远缘链球菌，并经鉴定确认为变形链球菌、远缘链球菌而得到变形链球菌菌体和菌体碎片、远缘链球菌菌体和菌体碎片；
B．免疫原制备步骤：
B.1取变形链球菌菌体和菌体碎片10～70重量份，远缘链球菌菌体和菌体碎片30～90重量份混合成菌液抗原；
B.2将等体积的菌液抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂变形链球菌和远缘链球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐剂混合免疫原含有细菌10亿-80亿；
B.3将等体积的混合菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂变形链球菌和远缘链球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐剂混合免疫原中含有细菌10亿-80亿；
C．免疫步骤：
使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.5ml-3.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡。加强免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫五次，前后共免疫八次；
D．抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY提取物的制备：
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，使用75%的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用冰醋酸调节酸碱度至pH5.30-5.50，然后放置-20℃冻藏3天后取出解冻，取上清液，用凝胶过滤系统将蛋黄液浓缩20倍，用1NNaOH调节PH至7.0-8.0，置-20℃保藏。
E.IgY纯化步骤：
将变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY提取物加硫酸胺至55%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水经中空纤维过滤器除盐，即得抗变形链球菌和远缘链 球菌混合特异性IgY抗体直接纯品。
抗变形链球菌、远缘链球菌混合特异性IgY纯品经ELISA方法测定，抗变形链球菌、远缘链球菌混合特异性IgY纯品中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1:1280000/mg蛋白，或者称抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY纯品中，每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活性为1:1280000/mg蛋白。在IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为89.3%。
实施例2
抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂的制备：
A．变形链球菌和远缘链球菌培养步骤
A.1细菌种类细菌种类：变形链球菌（S.mutans）和远缘链球菌（S.sobrinus）；
A.2取变形链球菌（S.mutans）MT8148菌株和远缘链球菌（S.sobrinus）6715菌株，分别经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的变形链球菌、远缘链球菌，并经鉴定确认为变形链球菌、远缘链球菌而得到变形链球菌菌体和菌体碎片、远缘链球菌菌体和菌体碎片；
B．免疫原制备步骤：
B.1取变形链球菌菌体和菌体碎片10～70重量份，远缘链球菌菌体和菌体碎片30～90重量份混合成菌液抗原；
B.2将等体积的菌液抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂变形链球菌和远缘链球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐剂混合免疫原含有细菌10亿-80亿；
B.3将等体积的混合菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂变形链球菌和远缘链球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐剂混合免疫原中含有细菌10亿-80亿；
C．免疫步骤：
使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.5ml-3.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡。加强免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉 注射给产蛋母鸡加强免疫五次，前后共免疫八次；
D．抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY提取物的制备：
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，用75%酒精消毒鸡蛋外壳，打碎蛋壳，留取蛋黄。用去离子水10倍稀释蛋黄后，用冰醋酸和无水乙酸钠调节PH至5.30-5.50.，4℃沉降后取上清液，添加2%的壳聚糖和海藻酸钠，2%氯化钙和多聚磷酸钠絮凝沉降，再取上清液用凝胶过滤系统超滤去除多余的去离子水，将蛋黄液浓缩20倍左右，用1N氢氧化钠调节PH至7.0-8.0，置-20℃保藏。
E.IgY纯化步骤：
将变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY提取物加硫酸胺至55%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水经中空纤维过滤器除盐，即得抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体直接纯品。
抗变形链球菌、远缘链球菌混合特异性IgY纯品经ELISA方法测定，抗变形链球菌、远缘链球菌混合特异性IgY纯品中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1:1280000/mg蛋白，或者称抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY纯品中，每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活性为1:1280000/mg蛋白。在IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为89.3%。
实施例3：
抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂的制备：
A．牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌培养步骤
A.1细菌种类：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）；
A.2取牙龈卟啉单胞菌（P.g）ATCC33277菌株和具核梭杆菌（Fn）ATCC10953菌株，分别经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈卟啉单细胞菌、具核梭杆菌，并经鉴定确认为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌而得到 牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片、具核梭杆菌菌体和菌体碎片；
B．免疫原制备步骤：
B.1取牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片10～70重量份，具核梭杆菌菌体和菌体碎片30～90重量份混合成菌液抗原；
B.2将等体积的菌液抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐剂混合免疫原含有细菌10亿-80亿；
B.3将等体积的混合菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐剂混合免疫原中含有细菌10亿-80亿；
C．免疫步骤：
使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.5ml-3.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡。加强免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫五次，前后共免疫八次；
D．抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY提取物的制备：
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，使用75%的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用冰醋酸调节酸碱度至pH5.30-5.50，然后放置-20℃冻藏3天后取出解冻，取上清液，用凝胶过滤系统将蛋黄液浓缩20倍，用1N NaOH调节PH至7.0-8.0，置-20℃保藏。
E.IgY纯化步骤：
将抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY提取物加硫酸胺至55%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水经中空纤维过滤器除盐，即得抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体直接纯品。
抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂纯品经ELISA方法测定，抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY纯品中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1:32000/mg蛋白，或者称抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY纯品中，每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活性为1:32000。在IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为89.3%。
实施例4：
抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂的制备：
A．牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌培养步骤
A.1细菌种类：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）；
A.2取牙龈卟啉单胞菌（P.g）ATCC33277菌株和具核梭杆菌（Fn）ATCC10953菌株，分别经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈卟啉单细胞菌、具核梭杆菌，并经鉴定确认为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌而得到牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片、具核梭杆菌菌体和菌体碎片；
B．免疫原制备步骤：
B.1取牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片10～70重量份，具核梭杆菌菌体和菌体碎片30～90重量份混合成菌液抗原；
B.2将等体积的菌液抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐剂混合免疫原含有细菌10亿-80亿；
B.3将等体积的混合菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐剂混合免疫原中含有细菌10亿-80亿；
C．免疫步骤：
使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.5ml-3.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡。加强免疫二次后， 此后每隔十周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫五次，前后共免疫八次；
D．抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY提取物的制备：
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，用75%酒精消毒鸡蛋外壳，打碎蛋壳，留取蛋黄。用去离子水10倍稀释蛋黄后，用冰醋酸和无水乙酸钠调节PH至5.30-5.50.，4℃沉降后取上清液，添加2%的壳聚糖和海藻酸钠，2%氯化钙和多聚磷酸钠絮凝沉降，再取上清液用凝胶过滤系统超滤去除多余的去离子水，将蛋黄液浓缩20倍左右，用1N氢氧化钠调节PH至7.0-8.0，置-20℃保藏。
E.IgY纯化步骤：
将抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY提取物加硫酸胺至55%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水经中空纤维过滤器除盐，即得抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体直接纯品。
抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂纯品经ELISA方法测定，抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY纯品中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1:32000/mg蛋白，或者称抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY纯品中，每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活性为1:32000。在IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为89.3%。
实验例1：
变形链球菌、远缘链球菌混合免疫原；牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌混合免疫原按本发明的方法免疫产蛋母鸡，取第一次免疫后30天免疫鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体的提取物和抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体的提取物，应用ELISA方法测定抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体结合不同抗原的生物学 效价（见表1）：
表1抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体的提取物、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体的提取物的效价
根据上述实验结果可以清楚地看到：
⑴.变形链球菌、远缘链球菌两种菌菌体+菌体碎片,牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌两种菌菌体+菌体碎片免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗这几种细菌的特异性IgY抗体；
⑵.产生的对各种细菌的特异性IgY抗体的效价并不随免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量而变化，即：并不是免疫剂量大的细菌产生的IgY抗体的效价也高，这是与抗原的免疫原性相关；
⑶.抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体与抗变形链球菌和远缘链球菌的混合特异性IgY抗体都能起反应，其效价有叠加作用；
⑷.由上述实验可见，一种抗变形链球菌、远缘链球菌混合特异性IgY抗体与抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体混合后可以预防由上述细菌引起的龋病、牙龈炎、牙周病及其口臭等；
⑸.由此还可以扩大到由与上述细菌有共同抗原决定簇的细菌引起的龋病、牙龈炎、牙周病、口臭等，都可以使用本发明的抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体和抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异 性IgY抗体治疗。
实验例2：
变形链球菌、远缘链球菌混合免疫原；牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌混合免疫原按本发明的方法免疫产蛋母鸡，取第一次免疫后60天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体的纯品、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体的纯品，应用ELISA方法测定抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体的纯品、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体的纯品结合不同抗原的生物学效价（见表2）：
表2抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体的纯品、抗牙龈卟啉单胞菌和抗具核梭杆菌IgY抗体的纯品的效价
根据上述实验结果可以清楚地看到：
⑴.按本发明的方法制备出的抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体的纯品要比实验例1中的按本发明的方法制备出抗变形链球菌、远缘链球菌IgY抗体的提取物的特异性结合变形链球菌、远缘链球菌混合抗原，以及变形链球菌、远缘链球菌等细菌各自抗原的生物学效价都要高， 基本是按比例增加；
⑵.按本发明的方法制备出的抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体的纯品要比实验例1中的按本发明的方法制备出抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY的提取物的特异性结合牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合抗原，以及牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等细菌各自抗原的生物学效价都要高，基本是按比例增加；
⑶.变形链球菌、远缘链球菌混合免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗这两种细菌的特异性IgY抗体；牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合免疫原免疫产蛋母鸡，也可以产生分别抗这两种细菌的特异性IgY抗体；
⑷产生的对各种细菌的特异性IgY抗体的效价并不随免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量而变化，即：并不是免疫剂量大的细菌产生IgY抗体的效价也高，这是与抗原的免疫原性相关；
⑸.抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体与变形链球菌和远缘链球菌的混合抗原都能起反应，其效价有叠加作用；抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY与牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等两种菌的混合抗原都能起反应，而且总的特异性IgY抗体的效价也增加了，其效价有叠加作用；
⑹.由上述实验可见，用抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体与抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY可以预防由上述细菌引起的龋病、牙龈炎、牙周病及其口臭等；
⑺.由此还可以扩大到由与上述细菌有共同抗原决定簇的细菌引起的龋病、牙龈炎牙周病及其口臭等，都可以使用本发明的抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY预防和治疗。
实验例3：
抗龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭IgY全效牙膏的活性效价
将抗龋病、牙龈炎和牙周炎及其口臭IgY按本专利配方制成牙膏产品后的效价结果如表3：
注：加保护剂后的预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭的IgY全效牙膏由本专利提供的抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY的制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY的制剂和牙膏膏剂配制而成
未加保护剂的抗龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭IgY全效牙膏单纯由抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY的制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY和牙膏膏剂配制而成。
显然本专利提供的加保护剂后的预防龋齿牙龈炎和牙周炎及其口臭的IgY全效牙膏能有效保护抗龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭的IgY在牙膏中的活性。
实验例4：
由抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂构成的抗致病菌制剂对变形链球菌抗蔗糖依赖性粘附的作用检测
方法：
在含1%蔗糖的BHI培养基中加入由抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂构成的抗致病菌制剂，0.22μm滤孔滤膜过滤除菌。
阴性对照组：非特异性IgY、不含IgY的同类牙膏上清液；
空白对照组:不含由抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂构成的抗致 病菌制剂的BHI。
所有试管中加入50μl来源于同一试管培养18h的S.mutans8148、S.sobrinus6715，30°角倾斜培养18h（此为第一批试管：A试管）。
取出第一批试管（A试管），轻微翻转试管3次，将菌液倒入第二批洗净试管（B试管），所含细菌为非粘附细菌。B试管中的菌液离心弃上清，用PBS缓冲液洗涤菌细胞两次，洗净培养基，再加入3mlPBS缓冲液，涡旋震荡，充分混悬细菌。
从第一批试管（A试管）的无粘附试管壁侧加入3ml PBS，涡旋震荡5min后，将含有细菌的液体转移至第三批洁净试管中（C试管）。这些细菌为非紧密粘附的细菌。C试管中的菌液离心弃上清，再加入3ml PBS缓冲液，涡旋震荡，充分混悬细菌。
再向第一批试管（A试管）中加入PBS超声震荡，使试管壁上紧密粘附的细菌全部震荡下。试管离心弃上清，再加入3ml PBS缓冲液,振荡均匀。
在分光光度计下测定所有试管中细菌的OD550nm值，计算细菌的百分粘附率，紧密粘附的细菌百分粘附率=A/（A+B+C）×100%。
结果
由抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂构成的抗致病菌制剂对变形链球菌有抗蔗糖依赖性粘附作用免疫提取的抗龋齿和牙龈炎及其口臭的（IgY）原料较市售鸡蛋提取的抗龋齿和牙龈炎及其口臭的（IgY）原料抑制变形链球菌蔗糖依赖性粘附作用更显著，加入0.2%浓度的免疫提取的抗龋齿和牙龈炎及其口臭的（IgY）原料可将变形链球菌蔗糖依赖性粘附从对照70.68%下降至15.43%；加入0.2%浓度的市售提取的抗龋齿和牙龈炎及其口臭的（IgY）原料可将变形链球菌蔗糖依赖性粘附从对照70.68%下降至45.83%（具体实验数据见表4）
表4.由抗变形链球菌、远缘链球菌混合特异性IgY抗体和抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂对变形链球菌和远缘链球菌体外抗粘附作用的抑菌结果
注：由抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂、抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌混合特异性IgY抗体制剂构成的抗致病菌制剂冻干粉批号：20091012，含辅料，效价：1：64－128万，市售鸡蛋IgY冻干粉批号：20090916，含辅料，效价：1：32万。
实验例5：
抑菌试验
牙龈卟啉单胞菌厌氧培养48h，经鉴定后将数个典型菌落混悬于BHI培养基，调整菌液浓度为（2×108）CPU/L～（1×109）CPU/L，用无菌的BHI培养基对IgY进行稀释，调整抗牙龈卟啉单细胞菌IgY终浓度为5.0、1.0、0.1gL。
取牙龈卟啉单细胞菌100μl置于96孔培养板中，再加各浓度组抗牙龈卟啉单细胞菌IgY100μl，每组3孔，空白对照孔不加菌液只加BHI培养基。将96孔培养板于37℃、厌氧培养24h、72h。
A值测定，取厌氧培养24h、72h得96孔培养板，用酶标仪测A490，读取吸光度值（A）。
统计学处理使用t检验。
结果
抗牙龈卟啉单胞菌IgY提取
应用水稀释法提取的不同批次的抗牙龈卟啉单胞菌IgY的纯度达到31.4～34.6%，结合牙龈卟啉单胞菌的效价达1：800。
抗牙龈卟啉单细胞菌IgY纯化，不同批次的55%饱和硫酸铵沉淀的IgY 纯度达到58.3%～61.2%，33%饱和硫酸铵进一步沉淀的IgY纯度达到87.6%～89.1%，33%饱和硫酸铵纯化的结合牙龈卟啉单细胞菌的效价达1：3200。
抗牙龈卟啉单细胞菌IgY抑菌率见表5。
表5.纯化的抗牙龈卟啉单胞菌IgY对牙龈卟啉单胞菌的抑制率
由表5可以看出，抗牙龈卟啉单胞菌IgY对抑制牙龈卟啉单细胞菌生长率有显著作用。
纯化的抗具核梭杆菌IgY对具核梭杆菌的抑制率
具核酸梭杆菌厌氧培养48h，经鉴定后将数个典型菌落混悬于BHI培养基，调整菌液浓度为（2×108）CPU/L～（1×109）CPU/L，用无菌的BHI培养基对IgY进行稀释，调整抗具核酸梭杆菌IgY终浓度为2.0、1.0、0.1g/L。
取具核酸梭杆菌100μl置于96孔培养板中，再加各浓度组抗具核酸梭杆菌IgY100μl，每组3孔，空白对照孔不加菌液只加BHI培养基。将96孔培养板于37℃、厌氧培养24h、72h。
A值测定，取厌氧培养24h、72h得96孔培养板，用酶标仪测A490，读取吸光度值（A）。
统计学处理使用t检验。
结果
抗具核梭杆菌IgY提取
应用水稀释法提取的不同批次的抗具核酸梭杆菌IgY的纯度达到31.4～34.6%，结合具核梭杆菌的效价达1：25600。
抗牙龈卟啉单细胞菌IgY纯化，不同批次的55%饱和硫酸铵沉淀的IgY 纯度达到58.3%～61.2%，33%饱和硫酸铵进一步沉淀的IgY纯度达到87.6%～89.1%，33%饱和硫酸铵纯化的结合具核酸梭杆菌的效价达1：51200。结果见表6
表6
由表6可以看出，抗具核梭杆菌IgY对抑制具核梭杆菌生长率有显著作用。
机译： 分别含有抗变形链球菌IgY，抗血链球菌IgY和以色列抗放线菌IgY及其蛋黄IgY的蛋的生产方法和含有抗变链球菌抗链球菌和抗放线菌的复合特异性IgY的冰淇淋以色列
机译： 包含从鸡蛋中提取的混合IgY或蛋黄的冰淇淋，分别含有抗变形链球菌IgY，血红链球菌IgY和以色列放线菌IgY
机译： 蛋黄特异性免疫球蛋白（igy）的制备方法，特别是igy，蛋特异性含蛋黄，特别是igy蛋黄，以及食品添加剂组合物
