一种人乳腺癌细胞抑制剂及制备方法

摘要

本发明公开了一种人乳腺癌细胞抑制剂及制备方法，其将Zn(NO3)2·6H2O、2,2'-双苯并咪唑（Bibim）、5-羟基间苯二甲酸（OH-H2Bdc）按照摩尔比为2~3:1:1~2的配比称量好；然后加水放入容器中，用三乙胺将溶液的PH值调至8.0~9.0，搅拌均匀；然后将搅拌后的原料液放入反应釜中，封盖，升温至100~110℃后进行保温反应45~56h；再采用梯度降温法将其降至室温，得到无色块状晶体配合物[Zn(OH-H2Bdc)(Bibim)]n，即得到人乳腺癌细胞抑制剂。本发明的人乳腺癌细胞抑制剂具有稳定性好，抑制能力强的特点，为抗人乳腺癌药物的研发提供了指导。

说明书

技术领域

本发明属于抗癌药物，尤其涉及一种人乳腺癌细胞抑制剂及制备方法。

背景技术

乳腺癌(breastcancer)是我国女性发病第一位的恶性肿瘤，发病率非常高，严重影响女性的正常生活，但其发病原因尚未明确，雌激素为主的内分泌激素与乳腺癌(breastcancer)的发生可能密切相关。

目前乳腺癌治疗方法主要有三种：手术治疗、放疗、化疗。手术治疗法主要是将发病部位（乳房切除），对患者伤害较大，易发生并发症，影响患者的正常生活。此外，乳腺癌骨转移是最常见的，手术患者大部分两年后会发生转移或复发，而且局部治疗往往不能达到根治的目的。通常用于放疗、化疗的药物大多为化学药物，虽然可控制部分癌细胞的发展，缓解症状，但由于化疗药物毒副作用大，对身体伤害大，同时免疫能力低下产生一系列并发症，不良反应大，同时治疗费用昂贵，有相当多的患者不能耐受不良反应而放弃治疗。同时由于癌细胞暴露于亚致死浓度的化疗药物中往往会产生耐药性，并常常交叉耐受其他一些抗癌药物，因此由于化疗药物的耐药性和癌细胞转移的产生常常使治疗达不到预期效果。

研究出能选择性抑制癌细胞的生长扩散或杀死癌细胞，而对正常细胞毒性小，且在长期用药条件下仍能保留其疗效的抗肿瘤药物是目前研究的重点。

5-羟基间苯二甲酸，又称5-羟基间苯二酸，对称羟基间苯二甲酸，5-羟基-1,3-苯二甲酸；分子式：C₈H₅O₆，分子量：182.13，熔点：296-299℃，性状：白色针状结晶，易溶于乙醇，微溶于水。用途：用作农药、医药中间体。其结构式为：

2,2'-双苯并咪唑，又称2,2'-二苯并咪唑，分子式为C₁₄H₁₀N₄，分子量为234.26，熔点293~294℃，性状：黄色粉状，用途：医药生物化工。化学结构式：

发明内容

本发明的目的就是提供一种人乳腺癌细胞抑制剂及制备方法。该抑制剂具有稳定性好，抑制能力强的特点，能为抗人乳腺癌药物的研发提供理论指导。

本发明的技术方案：

一种人乳腺癌细胞抑制剂，所述人乳腺癌细胞抑制剂结构式为：

其分子量为479.7~479.8，熔点为294~298℃，粘度为13.0~1.3.2mm^-1，密度为1.60～1.70g cm^-3。

人乳腺癌细胞抑制剂为无色块状晶体，其晶体结构属于单斜晶系P2₁/n空间群，其晶胞参数为：a为7.40~7.50b为12.20～12.30c为21.50~21.60α为90°，β为95~96°，γ为90°。

本发明的原料中2,2'-双苯并咪唑的制备方法为：先按草酸铵与邻苯二胺摩尔比为1:2分别称取草酸铵与邻苯二胺作为反应物，加入丙三醇作为溶剂，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统内，在功率为200~250w，温度为200~250℃下反应10~15min；然后在功率为300~350w，温度为160~165℃下反应10~15min，反应完毕后，得到黄色沉淀，冷却至室温，抽滤，用蒸馏水洗涤两至三次，得到粗产品，将粗产品用乙二醇重结晶，抽滤，再放在干燥箱中用80~90℃，烘1~2h，得到黄色粉状化合物即为2,2'-双苯并咪唑。

2,2'-双苯并咪唑的合成反应原理如下：

本发明的人乳腺癌细胞抑制剂的制备方法，它的制备方法包括如下步骤：

（1）将原料Zn(NO₃)₂·6H₂O、2,2'-双苯并咪唑、5-羟基间苯二甲酸按照摩尔比为2~3:1:1~2的配比称量好；

（2）将称量好的原料投入容器中，加入水，再用三乙胺将溶液的pH值调至8.0~9.0，然后搅拌均匀形成原料液；水与原料总体积的体积比为10~20:1；搅拌时间为5~20min，搅拌速度为200~600r/min。

（3）将搅拌均匀的原料液转入反应釜中，封盖，升温至100~110℃后进行保温反应45~56h；

（4）反应完成之后，采用梯度降温法将其降至室温，得到无色块状晶体的配合物，即人乳腺癌细胞抑制剂。

所述梯度降温法为：先降低10℃，保持20~30min；然后再降低10℃，保持20~30min；依此循环降至室温。

本发明的化学反应式：

反应过程中，Zn²⁺分别与三个来自5-羟基间苯二甲酸配体的羧基氧原子和两个来自2,2'-双苯并咪唑配体的氮原子配位。

本发明各组分在人乳腺癌细胞抑制中的作用：

人乳腺癌细胞抑制剂的作用：可能通过结合DNA上的邻近鸟嘌呤，或可能通过抑制DNA合成必需酶从而抑制DNA合成；也可能是借助各种诱导因素使DNA解旋或发生断裂反应，或者借助于DNA拓扑异构酶而引起DNA单链及双链的断裂，干扰DNA的正常功能从而导致肿瘤细胞死亡。

Zn⁺⁺的作用：选择性地与DNA寡居核苷酸上的鸟嘌呤碱基结合，形成单功能加合物并适度降低了DNA的解链温度，从而可引起细胞行为和生物功能的显著变化。

2,2'-双苯并咪唑的作用：在生理条件下，通过金属-配体间的电荷传递以及寿命长的激发态而使它易于插入到DNA双螺旋结构的碱基对之中。

5-羟基间苯二甲酸基的作用：它的桥联单齿的羧酸根上未配位的氧原子(O4)可以与2,2'-双苯并咪唑中的未配位的咪唑氮原子(N2和N4)、螯合双齿中已配位的羧基氧(O1)与羟基氧原子(O5)及螯合双齿中已配位的羧基氧(O2)与2,2'-双苯并咪唑中的未配位的咪唑氮原子(N2)形成的氢键[N2-H2…O2(2.851(4));N2-H2…·O4(3.251(4));N4-H4…O4(2.709(4))；O5-H5…O1(2.707(4))]堆垛成有趣的二维网状超分子结构，使抑制剂的抑制能力增强。

本发明的人乳腺癌细胞抑制剂在制备抗人乳腺癌药物及抗人乳腺癌药物分析中的应用，为抗人乳腺癌药物的研发提供了技术指导。

本发明的有益效果：

（1）本发明制备人乳腺癌细胞抑制剂的方法简单易行。

（2）本发明制备人乳腺癌细胞抑制剂具有活性高，毒性低的特点。

（3）本发明的人乳腺癌细胞抑制剂具有稳定性好的特点，2,2'-双苯并咪唑基团能够插入DNA的双螺旋结构的碱基对之中。

（4）本发明的人乳腺癌细胞抑制剂能够有效抑制人乳腺癌细胞的生长，为抗人乳腺癌药物的研发提供技术指导。

附图说明

图1为本发明的人乳腺癌细胞抑制剂的红外光谱图。从图1可知配合物在3284cm^-1附近宽吸收峰可指认为ν_(O-H)的伸缩振动，说明配合物中含有水分子且存在着氢键。配合物在1537cm^-1处出现了ν_as(OCO^-₎伸缩振动峰，1382cm^-1处的红外吸收峰可归属为ν_s(OCO^-₎伸缩振动，它们的Δν（ν_as-ν_s）为155cm^-1，这表明配体中的羧基参与配位且同时存在多种配位形式。配合物中的1040cm^-1处的吸收峰可指认为ν_s(C-O-C)的对称伸缩振动；而1260cm^-1处的吸收峰可指认为ν_as(C-O-C)的不对称伸缩振动。

图2为本发明的人乳腺癌细胞抑制剂中的2,2'-双苯并咪唑的红外光谱图。从图2可知双苯并咪唑的ν_(C-N)在1255cm^-1处，而双苯并咪唑的骨架伸缩振动位于1674cm^-1和1501cm^-1处。

图3为本发明的人乳腺癌细胞抑制剂的金属离子配位环境图。在图3中，Zn²⁺分别与三个来自5-羟基间苯二甲酸配体的羧基氧原子和两个来自2,2'-双苯并咪唑配体的氮原子配位。

图4为本发明的人乳腺癌细胞抑制剂的一维螺旋链。在图4中，5-羟基间苯二甲酸配体采用μ₃-桥联配位模式：一个羧基采用桥联单齿配位模式桥联一个Zn(II)，另一个羧基则作为螯合双齿配体连接另一个Zn(II)形成一维螺旋链结构，每个2,2'-双苯并咪唑配体螯合Zn(II)离子位于链的两侧并垂直于该链。

图5为本发明的人乳腺癌细胞抑制剂的二维图。在图5中，邻近的链通过2,2'-双苯并咪唑之间的吡啶环与吡啶环之间及苯环与苯环之间形成π–π堆积作用(面心与面心之间的距离是3.807和3.556)，这些氢键作用和π–π堆积作用堆垛成有趣的二维网状超分子结构。

图6为本发明人乳腺癌细胞抑制剂、2,2'-双苯并咪唑和5-羟基间苯二甲酸配体对四种人肿瘤细胞MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（肺癌细胞）、Hela(宫颈癌细胞)和MG-63(骨肉瘤细胞)的抑制率图。

图7为本发明人乳腺癌细胞抑制剂、2,2'-双苯并咪唑和5-羟基间苯二甲酸配体对四种人肿瘤细胞MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（肺癌细胞）、Hela(宫颈癌细胞)和MG-63(骨肉瘤细胞)的IC₅₀图。

图8为本发明人乳腺癌细胞抑制剂-DNA复合体系的紫外吸收光谱图（抑制剂的浓度为2.0×10^-5mol/L，[DNA]/[抑制剂]＝0to 10）。

图9为在0.1mol/L缓冲溶液(pH＝7.35)下，抑制剂-DNA复合体系的荧光光谱图（λ_ex＝274nm，λ_em＝415nm）。

图10为本发明人乳腺癌细胞抑制剂-DNA复合体系的粘度图（t＝30℃）。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

一、本发明的制备方法：

（1）2,2'-双苯并咪唑的制备方法为：分别称取1.42克(10mmol)草酸铵与2.16克邻苯二胺(20mmol)作为反应物，加入15mL丙三醇，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统内，在功率为200w，温度为250℃下反应10min；然后在功率为300w，温度为165℃下反应11min，反应完毕后，得到黄色沉淀，冷却至室温，抽滤，用蒸馏水洗涤两至三次，得到的粗产品。将粗产品用100mL乙二醇重结晶，抽滤，将产品放在干燥箱中用80℃，烘2h，得到黄色粉状化合物即得到2,2'-双苯并咪唑；将其采用红外光谱测定，得到的红外光谱图如图2所示。

（1）将Zn(NO₃)₂·6H₂O（0.5mmol）、2,2'-双苯并咪唑（0.25mmol）、5-羟基间苯二甲酸（0.25mmol）和15mL水放在烧杯中，然后用三乙胺将溶液的调pH值至8.5，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为10min，搅拌速度为300r/min。

（2）将搅拌后的原料液放入体积为23mL带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到100℃并保持48小时。

（3）用梯度降温法先降低至90℃，保持30min,然后再降低至80℃，保持30min；依此循环降至室温，得到无色块状晶体，即得到人乳腺癌细胞抑制剂；将其采用红外光谱测定，得到的红外光谱图如图1所示。

二、产品检验：

将得到的人乳腺癌细胞抑制剂采用X-射线单晶衍射检测，得到图3~5和表1。

表1配合物（抑制剂）的晶体数据

三、产品性能检测方法：

（1）用二甲基亚砜（DMSO）分别将无色块状晶体配合物人乳腺癌细胞抑制剂、2,2'-双苯并咪唑和5-羟基间苯二甲酸配成2.0×10^-3mol/L的储备液，缓冲溶液(pH＝7.35)为0.1mol·L^-1的三羟甲基氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl），MTT试剂（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）的浓度为5mg/mL。

（2）MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（肺癌细胞）、Hela（宫颈癌细胞）和MG-63（骨肉瘤细胞）细胞株均置于37℃、5%CO₂充分湿化条件下的培养箱中，接种于含10%灭活新生牛血清的PPMI1640培养液中培养。

（3）将所有化合物配制成10μg/mL，助溶剂DMSO终浓度不超过1%，测试该浓度下各化合物对癌细胞的抑制率。

（4）取处于对数生长期的细胞，每孔180μL(约4500-5000个细胞)含细胞的培养基接种于96孔培养板，于37℃、5%CO₂充分湿化条件下培养24h。

（5）待细胞贴壁后，按每孔20μL的量加入样品,每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。

（6）继续培养48h后，每孔加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mL)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加入150μL DMSO，轻微震荡反应5-8min，使结晶颗粒充分溶解。

（7）空白对照组调零，用酶标仪以490nm波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值(值)，计算细胞增殖抑制率。可根据公式计算化合物的抑制率：抑制率＝（1-加药组OD值/对照组OD值）×100%。

（8）所有实验均重复3次后取平均值。得到本发明的抑制剂和其配体对四种人肿瘤细胞的抑制率如图6和表2所示。

由图6和表2可见，本发明的抑制剂对人乳腺癌细胞具有较好的细胞毒活性，其抑制率为63.95%，大于50%，且比其相应的2,2'-双苯并咪唑和5-羟基间苯二甲酸的抑制率大。说明配体在形成配合物（抑制剂）以后，其对癌细胞的抑制作用增强。

表2抑制剂和其配体（10μM，48小时）对四种人癌细胞株的抑制率（%）

实施例2

一、本发明的制备方法：

（1）2,2'-双苯并咪唑的制备方法为：分别称取2.84克(20mmol)草酸铵与4.32克邻苯二胺(40mmol)作为反应物，加入20mL丙三醇，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统内，在功率为250w，温度为230℃下反应12min；然后在功率为350w，温度为160℃下反应10min，反应完毕后，得到黄色沉淀，冷却至室温，抽滤，用蒸馏水洗涤三次，得到的粗产品。将粗产品用100mL乙二醇重结晶，抽滤，将产品放在干燥箱中用85℃，烘1.5h，得到黄色粉状化合物即得到2,2'-双苯并咪唑；

（2）将Zn(NO₃)₂·6H₂O（0.75mmol）、2,2'-双苯并咪唑（0.25mmol）、5-羟基间苯二甲酸（0.50mmol）和20mL水放在烧杯中，然后用三乙胺将溶液的PH值调至9.0，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为5min，搅拌速度为600r/min。

（3）将搅拌后的原料液放入带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到110℃并保持45小时。

（4）用梯度降温法先降低至100℃，保持30min,然后再降低至90℃，保持30min；依此循环降至室温，得到无色块状晶体，即得到人乳腺癌细胞抑制剂。

二、产品检验

检验方法同实施例1，得到晶体测定参数如表3

表3配合物（抑制剂）的晶体数据

三、产品性能检测方法：

（1）用二甲基亚砜（DMSO）分别将无色块状晶体配合物人乳腺癌细胞抑制剂、2,2'-双苯并咪唑和5-羟基间苯二甲酸配成2.0×10^-3mol/L的储备液，缓冲溶液(pH＝7.35)为0.1mol·L^-1的三羟甲基氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl），MTT试剂（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）的浓度为5mg/mL。

（2）MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（肺癌细胞）、Hela（宫颈癌细胞）和MG-63（骨肉瘤细胞）细胞株均置于37℃、5%CO₂充分湿化条件下的培养箱中，接种于含10%灭活新生牛血清的PPMI1640培养液中培养。

（3）将所有化合物配制成10μg/mL，助溶剂DMSO终浓度不超过1%，测试该浓度下各化合物对癌细胞的抑制率。

（4）取处于对数生长期的细胞，每孔180μL(约4500-5000个细胞)含细胞的培养基接种于96孔培养板，于37℃、5%CO₂充分湿化条件下培养24h。

（5）待细胞贴壁后，按每孔20μL的量加入样品,每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。

（6）继续培养48h后，每孔加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mL)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加入150μL DMSO，轻微震荡反应5-8min，使结晶颗粒充分溶解。

（7）所有实验均重复3次后取平均值。对初筛抗肿瘤效果好的受试化合物，继续用5个浓度梯度做相应细胞株的IC₅₀值，得到本发明的肺癌细胞抑制剂和其配体对四种人肿瘤细胞的IC₅₀值如图7和表3所示。

由图7和表4可见，该抑制剂能够较好地抑制人乳腺癌细胞的生长，其中对MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）有较小的IC₅₀值（18.63±1.27）。

表4抑制剂和其配体对四种人癌细胞株的IC₅₀(μM).

实施例3

一、本发明的制备方法：

（1）2,2'-双苯并咪唑的制备方法为：分别称取2.13克(15mmol)草酸铵与3.24克邻苯二胺(30mmol)作为反应物，加入23mL丙三醇，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统内，在功率为230w，温度为250℃下反应15min；然后在功率为320w，温度为160℃下反应12min，反应完毕后，得到黄色沉淀，冷却至室温，抽滤，用蒸馏水洗涤2次，得到的粗产品。将粗产品用100mL乙二醇重结晶，抽滤，将产品放在干燥箱中用90℃，烘1h，得到黄色粉状化合物即得到2,2'-双苯并咪唑；

（2）将Zn(NO₃)₂·6H₂O（0.5mmol）、2,2'-双苯并咪唑（0.25mmol）、5-羟基间苯二甲酸（0.5mmol）和20mL水放在烧杯中，然后用三乙胺将溶液的PH值调至9.0，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为20min，搅拌速度为200r/min。

（2）将搅拌后的原料液放入带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到105℃并保持56小时。

（3）用梯度降温法先降低至95℃，保持30min,然后再降低至85℃，保持30min；依此循环降至室温，得到无色块状晶体，即得到人乳腺癌细胞抑制剂。

二、产品检验：

检验方法同实施例1

三、产品性能检测方法：

（1）用10%二甲基亚砜（DMSO）将无色块状晶体配合物人乳腺癌细胞抑制剂配成2.0×10^-3mol/L的溶液。

（2）用三羟甲基氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl）缓冲溶液将DNA配成2.0×10^-4mol/L的溶液。

（3）在比色皿中加入3mL，2.0×10^-5mol/L的配合物溶液，逐次加入1μL，2.0×10^-4mol/L的ct-DNA(即小牛胸腺DNA)溶液。

（4）每个混合液摇匀放置5min后，将其置于紫外-可见吸收光谱仪上扫描，结果如图8所示。

由图8可知，随着DNA浓度的增大，抑制剂-DNA复合体系的紫外吸收增加，在258nm处有8nm的红移，增色率为79.2%；而在341nm处，则没有红移和增色现象。

抑制剂与DNA的键合强度K_b可以通过下列方程式确定：

[DNA]/(ε_a-ε_f)＝[DNA]∕(ε_b-ε_f)﹢1/[K_b(ε_b-ε_f)]

此处，ε_a,ε_f和ε_b分别是DNA的已知浓度，未与抑制剂键合及已与抑制剂键合的相关系数，K_b是抑制剂与DNA的键合常数，[DNA]是DNA在0.1mol/L缓冲溶液(pH＝7.35)中的浓度。将[DNA]/(ε_a-ε_f)比[DNA]作图，可以得到斜率1∕(ε_b-ε_f)和截距1/[K_b(ε_b-ε_f)]，斜率和截距之比就可以得到键合常数K_b，该抑制剂的键合常数为3.11×10⁵。由此可见，该抑制剂较强地插入到DNA的碱基对之中。

由上述实施例可知，本发明的人乳腺癌细胞抑制剂具有稳定性好，与癌细胞DNA作用较强的特点，是一种优质的人乳腺癌细胞抑制剂。

实施例4

一、本发明的制备方法：

（1）2,2'-双苯并咪唑的制备方法同实施例1；

（2）将Zn(NO₃)₂·6H₂O（0.5mmol）、2,2'-双苯并咪唑（0.25mmol）、5-羟基间苯二甲酸（0.25mmol）和15mL水放在烧杯中，然后用三乙胺将溶液的PH值调至8.5，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为15min，搅拌速度为400r/min。

（3）将搅拌后的原料液放入体积为23mL带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到100℃并保持48小时。

（4）用梯度降温法先降低至90℃，保持30min,然后再降低至80℃，保持30min；依此循环降至室温，得到无色块状晶体，即得到人乳腺癌细胞抑制剂。

二、产品检验

检验方法同实施例1

三、产品性能检测方法：

（1）用10%二甲基亚砜（DMSO）将无色块状晶体配合物人乳腺癌细胞抑制剂配成2.0×10^-3mol/L的溶液。

（2）在比色皿中加入1mL，2.0×10^-5mol/L的配合物溶液，1.0mL三羟甲基氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl）缓冲溶液（pH＝7.35）中，逐次加入1mL的ct-DNA(即小牛胸腺DNA)溶液，使DNA对配合物的浓度逐渐提高。

（3）将上述每个混合液用二次亚沸蒸馏水稀释至5mL后摇匀。摇匀放置5min后，将其置于荧光光谱仪上扫描（λ_ex＝326nm，λ_em＝355nm），结果如图9所示。

由图9可见，随着DNA浓度的增加，抑制剂-DNA复合体系的荧光强度增加，当抑制剂/[DNA]＝10时，荧光强度最强，分别是无DNA存在时的0.65、0.51和0.42倍。说明探针是以插入模式与DNA结合的。

实施例5

一、本发明的制备方法：

（1）2,2'-双苯并咪唑的制备方法同实施例1；

（2）将Zn(NO₃)₂·6H₂O（0.5mmol）、2,2'-双苯并咪唑（0.25mmol）、5-羟基间苯二甲酸（0.25mmol）和15mL水放在烧杯中，然后用三乙胺将溶液的PH值调至8.0，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为10min，搅拌速度为300r/min。

（2）将搅拌后的原料液放入体积为23mL带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到100℃并保持48小时。

（3）用梯度降温法先降低至90℃，保持30min,然后再降低至80℃，保持30min；依此循环降至室温，得到无色块状晶体，即得到人乳腺癌细胞抑制剂。

二、产品检验

检验方法同实施例1

三、产品性能检测方法：

（1）用10%二甲基亚砜（DMSO）将无色块状晶体配合物人乳腺癌细胞抑制剂配成2.0×10^-3mol/L的溶液。

（2）测定时溶液体系温度恒定在30℃。

（3）选择相对合适的转速（30RPM）和扭矩。

（4）用微量进样器将定量体积的待测物储液滴加至ct-DNA缓冲液中，按照[抑制剂]/[DNA]＝0、0.02、0.04、0.06、0.09、0.12、0.16、0.20的累加比例逐渐滴加。

（5）每次滴加完反应10min待数值稳定记录数据。

（6）以不同化合物的(η/η⁰)^1/3对[抑制剂]/[DNA]的比值作图，结果如图10所示。

由图10可见，随着抑制剂浓度的增大，体系中DNA的粘度表现出明显的增加，当[抑制剂]/[DNA]达到0.17时，相对粘度比值(η/η⁰)^1/3＝1.030，粘度明显增大，这进一步充分证明，抑制剂是通过其2,2'-双苯并咪唑平面与DNA碱基对间产生经典插入作用的，只有这种经典而有力的插入作用才能使DNA溶液粘度显著增大。