转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法

摘要

一种转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸含量的方法，该方法包括金鱼草Rosea1基因和Delila基因的克隆、构建含有金鱼草Rosea1基因和Delila基因的植物表达载体、制备含有金鱼草Rosea1基因和Delila基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株、制备转基因丹参植株4个步骤。实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参中金鱼草Rosea1基因和Delila基因的表达；对转基因丹参中迷迭香酸和丹酚酸含量同时进行高效液相色谱测定，筛选得到迷迭香酸和丹酚酸B含量同时提高的转基因丹参植株。采用本发明获得的转基因丹参植株，生长45天的干燥根中，迷迭香酸的含量为26.96±0.90mg/g，丹酚酸B的含量达63.64±1.94mg/g，分别是同时期非转化普通丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的1.60倍和2.12倍。

说明书

技术领域

本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体涉及到在丹参中组合共转化金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因同时提高丹参中酚酸类成分迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法。

背景技术

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物，以其根及根茎入药，为我国常用大宗药材之一。丹参的主要活性成分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类，具有活血化瘀，通经止痛，清心除烦等功效，在临床上被广泛用于心脑血管疾病、癌症以及各种炎症的治疗。伴随着丹参原药材需求量的日益扩大和规范化种植的需求，培育活性成分含量高的优良丹参新品种已成为丹参原药材生产中亟待解决的关键问题之一。基于传统中药多用其水煎剂的用药方式，以迷迭香酸和丹酚酸B为代表的水溶性酚酸类成分被普遍认为是丹参发挥药效的主要活性物质基础，更是受到研究者的普遍关注。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用，迷迭香酸作为抗炎镇痛药已于1990年在德国投放市场；丹参素和原儿茶醛是丹参治疗冠心病的主要有效成分；丹酚酸B是目前已知抗氧化作用最强的天然产物之一，也是丹参中含量最高、抗氧化活性最强的化合物，为2010年版《中华人民共和国药典》规定的丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一，对心、脑、肝、肾、胃等多个器官具有保护作用。

随着丹参有效成分及其药理活性的深入研究，近年来以丹参为主要原料的药品、制剂、化妆品和系列保健产品层出不穷，丹参资源供不应求。伴随着丹参药材需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少，人工种植面积逐年增大。然而作为常异交植物，丹参种内变异较大，性状复杂。栽培丹参只种不选的状况使得各产地丹参质量参差不齐，品种退化严重，有效成分含量不稳定，成为丹参作为高品质植物药大规模进军国际市场的最大障碍之一。另外，由于人工栽培条件下药田生态环境中生物多样性差、丰富度低，导致丹参病虫害优势种群突出、病虫害频发，严重影响了药材的产量和质量。上述问题成为中药丹参药材产业发展的瓶颈。由于丹参野生资源几乎耗尽，目前药用丹参以人工栽培为主，而栽培中人们对丹参优良品种的选育重视不够，导致丹参质量良莠差异较大。因此，提高丹参中有效成分，尤其是迷迭香酸和丹酚酸B的含量，培育优异的丹参资源具有重要意义。

为了提高品质、满足市场需求，近年来利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良以提高其药材有效成分的含量愈来愈受到人们的重视。在诸多方法之中，利用基因工程技术对药用植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，提高药用植物有效成分含量，培育能够大量积累目标次生代谢物的新品种，愈来愈受到人们的关注。以转基因技术为核心的现代分子育种技术在改良药用植物、丰富中药资源、提高抗病性和抗逆性、培养高天然药物含量的新型转基因药材中有着诱人的应用前景。但目前利用转基因技术提高丹参中丹参酚酸类成分的含量，特别是迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法尚无报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述技术的不足，提供一种转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括下述步骤：

1、金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的克隆

提取金鱼草总RNA并反转录成cDNA备用，采用Primer Premier 5.0软件，设计金鱼草Delila和Rosea1基因编码框的上游引物、下游引物，并在金鱼草Delila基因的上游引物前引入BamH I限制性酶切位点和保护碱基GAGGATCC，在下游引物前引入Sac I限制性酶切位点和保护碱基CAGGAGCTC，金鱼草Delila基因上游引物序列为 Delila-F：5’-GAGGATCCATGGCTACTGGTATCCAAAACCAAAAG-3’，下游引物序列为Delila-R：5’-CAGGAGCTCAACTTCAAGACTTCATAGTAACTTTCTG-3’；在金鱼草Rosea1基因的上游引物前引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GAAGATCT，在下游引物前引入BstEII限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，金鱼草Rosea1基因的上游引物为Rosea1-F：5’-GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3’，下游引物为Rosea1-R：5’-CAGGGTAACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’；以金鱼草cDNA为模板，经聚合酶链式反应分别扩增金鱼草Delila基因和Rosea1基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与pMD19-TSimple载体用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5α，连接产物与大肠杆菌DH5α的体积比为1：10，连接产物转入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到所述基因的编码序列，序列如下：

金鱼草Rosea1基因：

atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50

agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100

atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150

ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200

gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250

aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300

aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350

acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400

tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450

agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500

tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550

cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600

gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650

aattggaaat taa                                         663

金鱼草Delila基因：

atggctactg gtatccaaaa ccaaaagata gtgcctgaga atttgaggaa  50

gcaacttgct attgctgtga gaagtatcca atggagttat gcaattttct  100

ggtccaattc agttgcacaa ccaggggtct tggagtgggg tgatgggttc  150

tacaatggag atattaaaac tcgaaaaact gtacaatctg tcgaattgaa  200

tcaagatcag ctgggattgc agagaagtga tcaattgaga gaactttatg  250

agtctctttc acttggtgaa accaacacac aagctaaaag gcctactgct  300

gcattatcac cagaagacct cactgatgct gagtggtttt tcttggtttg  350

catgtctttc atattcaata ttggccaagg gttgcctgga agaacattag  400

cacgaaatca agcagtatgg ctatgcaacg ctcatcgtgc ggacaccaaa  450

gttttctcgc gttctttgct tgcaaagagt gcgtcaattc agacagttgt  500

gtgctttcca tattcagaag gtgtagttga gctgggagca acagagctag  550

taccggagga tttgaatcta atccagcata taaaaacttc attcttggac  600

agtcctgcca ccgttcccaa gattcccaac tatgtctcca acagtattac  650

aaacaacaat gacctcattt gtgaagcgct tgaacatgct aatataccag  700

aaaacgatct tgatcagctt ttgaattgtc cagacacgaa catatgttct  750

cctgataaca gtttggatga ctttgcagac aatttactca tagacgaatc  800

gaatttggca gaaggcatca atggggaggt tcctcaaaca caaagctggc  850

ctttcatgga tgatgcaatc agcaattgtc tcaatagttc tatgaattct  900

agtgactgta tatctcaaac tcatgaaaat ctagagtctt ttgctccact  950

ttctgatgga aaagggccac cggagacgaa taattgtatg cacagcactc  1000

aaaaatgcaa tcagcagata gaaaacacgg gtgtccaagg cgatgaggtc  1050

cattatcaag gggtactttc caatcttttg aagagttccc atcagttggt  1100

tcttggtccc tacttcagaa atgggaatag agaatcaagc ttcgttagtt  1150

ggaacaagga tggatcgtcg ggtactcatg ttccccgaag cggaacctca  1200

caaagatttc tgaagaaagt actttttgaa gtagctagaa tgcatgaaaa  1250

ctccaggctt gatgctggta aacaaaaggg caacagtgac tgccttgcaa  1300

agccaacggc tgatgaaatt gatagaaacc acgtcttgtc agagagaaaa  1350

cgcagagaga aaataaacga acggtttatg attcttgcat ccctagtccc  1400

atccggtggc aaggttgaca aagtatcaat actagaccat acaatagatt  1450

acttgagagg gcttgagagg aaagtcgacg agctggaatc taacaaaatg  1500

gtaaagggcc gggggcggga atcaactaca aaaactaaac tacacgatgc  1550

cattgagagg acctctgata attatggcgc aacaaggaca agtaacgtca  1600

agaaaccgtt gacaaacaag agaaaggctt ctgatacgga caagattgga  1650

gccgtaaata gcagaggtcg attgaaagat tccttaacag ataatataac  1700

tgtgaacatt acaaacaagg atgtgttgat tgtcgtgact tgttcttcca  1750

aggagtttgt attgcttgaa gtgatggaag ccgtaagacg actaagtttg  1800

gattccgaaa ctgttcaatc ttccaacaga gatggaatga tatctattac  1850

cataaaagcc aagtgcaagg gattgaaggt tgcatcagca agtgtgatca  1900

aacaagctct tcagaaagtt actatgaagt cttgaagtt              1939

2、构建含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体

用EcoR I和HindIII双酶切植物表达载体pBI121和pCAMBIA-1302，回收的酶切产物用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，经菌落聚合酶链式反应检测及提取质粒做酶切检测筛选阳性克隆，获得pCAMBIA-1302+中间载体；用BamH I和Sac I双酶切含有金鱼草Delila基因的pMD19-T Simple载体和pCAMBIA1302+中间载体，回收的酶切产物用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，进行菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证获得pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒；用BglII和BstEII双酶切含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-T Simple载体和pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒，回收的酶切产物利用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，经菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证，得到含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体，该表达载体序列如核苷酸列表<210>3所示。

3、制备含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株

将含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于28℃恒温培养箱中倒置培养18～36小时，挑取抗性单菌落进行菌落聚合酶链式反应筛选，获得含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株。

4、制备转基因丹参植株

采用常规组织培养技术方法获得无菌丹参试管苗，根癌农杆菌介导的丹参遗传转化体系采用叶盘法，即将继代培养15天的丹参无菌苗叶片切成小块，转入每1L培养基中含有10mL浓度为1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a-萘乙酸的MS培养基上预培养1天，用含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株浸染预培养过的丹参叶片，浸染方法为28℃恒温100转/分钟浸染25～30分钟，将浸染过的叶片置于每1L培养基中含有10mL浓度为1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a-萘乙酸的MS培养基上暗培养2～3天至叶片边缘有农杆菌长出，将叶片从培养基上取出，转接到每1L培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的MS培养基中进行培养，长出抗性芽后将其转入到每1L培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的1/2MS培养基上生根，获得潮霉素抗性的再生丹参植株，用金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的特异性检测引物聚合酶链式反应扩增再生丹参植株的DNA，波长为302nm的紫外线下可同时观察到663bp和1939bp目的条带的阳性株系即为转基因丹参植株。

在本发明的构建含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的步骤2中，所述的用EcoRI和HindIII双酶切为：取植物表达载体pBI121、10×MBuffer、限制性内切酶EcoRI、限制性内切酶HindII、二次蒸馏水于37℃反应小时10分钟，限制性内切酶EcoR I与限制性内切酶HindII、10×M Buffer、二次蒸馏水、植物表达载体pBI121的体积比为3：3：5：19：20。取植物表达载体pCAMBIA-1302、10×M Buffer、限制性内切酶EcoR I、限制性内切酶HindII、二次蒸馏水于37℃反应小时10分钟，限制性内切酶EcoR I与限制性内切酶HindII、10×M Buffer、二次蒸馏水、植物表达载体pCAMBIA-1302的体积比为3：3：5：19：20。

在本发明的构建含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的步骤2中，所述的用BamH I和Sac I双酶切为：取含有金鱼草Delila基因的pMD19-T Simple载体、10×K Buffer、限制性内切酶BamH I、限制性内切酶Sac I、二次蒸馏水于37℃反应2小时20分钟，限制性内切酶BamH I与限制性内切酶Sac I、10×K Buffer、二次蒸馏水、含有金鱼草Delila基因的pMD19-TSimple载体的体积比为3：3：5：19：20。取pCAMBIA1302+中间载体、10×KBuffer、限制性内切酶BamH I、限制性内切酶Sac I、二次蒸馏水于37℃反应小时20分钟，限制性内切酶BamH I与限制性内切酶SacI、10×KBuffer、二次蒸馏水、pCAMBIA1302+中间载体的体积比为3：3：5：19：20。

在本发明的构建含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的步骤2中，所述的用Bgl II和BstEII双酶切为：取含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-T Simple载体、10×H Buffer、限制性内切酶BglII、二次蒸馏水于37℃反应1小时20分钟后，再加入限制性内切酶BstEII在60℃反应1小时，限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEII、10×H Buffer、二次蒸馏水、含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-T Simple载体的体积比为3：3：5：19：20。取pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒、10×H Buffer、限制性内切酶BglII、二次蒸馏水于37℃反应1小时20分钟后，再加入限制性内切酶BstEII在60℃下反应1小时，限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEII、10×H Buffer、二次蒸馏水、pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒的体积比为3：3：5：19：20。

本发明将金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因组合转入丹参植株，筛选获得了迷迭香酸和丹酚酸B的含量同时显著提高的转基因丹参植株。在生长45天的转基因的丹参干燥根中，迷迭香酸的含量为26.96±0.90mg/g，丹酚酸B的含量达63.64±1.94mg/g，分别是同时期非转化普通丹参干燥根中迷迭香酸（16.90±0.48mg/g）和丹酚酸B（30.04±0.89mg/g）的1.60倍和2.12倍，为提高丹参中迷迭香酸含量提供了一种新方法，可在丹参的培育中推广使用。

附图说明

图1是制备含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的根癌农杆菌时的菌落聚合酶链式反应检测电泳图。

图2是聚合酶链式反应检测转基因丹参植株的DNA电泳图。

图3是实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应同时检测转基因丹参植株中金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的表达量图。

图4是高效液相色谱测定转基因丹参植株中迷迭香酸和丹酚酸B含量的色谱图。

图5是高效液相色谱测定对照参植株中迷迭香酸和丹酚酸B含量的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

1、金鱼草Rosea1基因和Delila基因的克隆

（1）金鱼草总RNA的提取

选取新鲜、健壮的金鱼草幼苗全株，利用OMEGA公司E.Z.N.A.^TM Plant RNA Kit提取试剂盒分离提取其总RNA。提取方法参照OMEGA公司E.Z.N.A.^TM Plant RNA Kit提取试剂盒说明书。

（2）cDNA第一链的合成

采用Takara公司PrimeScriptRT reagent Kit反转录试剂盒进行，反应体系为：5×PrimeScript^TMBuffe 2μL，PrimeScript^TM RT Enzyme Mix 10.5μL，Oligo dT Primer 0.5μL，Random 6mers 0.5μL，金鱼草总RNA 1μL；RNase free dH₂O 5.5μL，反转录反应条件为：37℃孵育30分钟，85℃反应5秒得cDNA，将cDNA用二次蒸馏水稀释10倍，-20℃保存备用。

（3）金鱼草Rosea1基因和Delila基因聚合酶链式反应扩增

①金鱼草Rosea1基因的聚合酶链式反应扩增

参照GENBANK中己公布的金鱼草Rosea1基因，用Premier Primer 5.0软件，设计可扩增出金鱼草Rosea1基因编码框的上游引物、下游引物，并在上游引物上引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GAAGATCT，下游引物上引入BstEII限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTCACC，以便构建表达载体。上游引物序列为Rosea1-F：5’-GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3’，下游引物序列为Rosea1-R：5’-CAGGGTCACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’。以金鱼草cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，反应扩增体系为：金鱼草cDNA2μL，dNTP（购自Takara公司）4μL，上游引物Rosea1-F 1μL，下游引物Rosea1-R 1μL，LA Taq Polymerase(购自Takara公司)0.5μL，10×LA PCR BufferII（购自Takara公司）5μL，二次蒸馏水36.5μL；聚合酶链式反应扩增的方法为：94℃、5分钟；94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、45秒，35个循环；72℃、10分钟。将获得的扩增产物用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目标片段，与pMD19-TSimple载体（购自Takara公司）用T4DNA连接酶（购自Takara公司）连接，连接体系为：PCR纯化回收产物7.5μL，10×T4连接酶Buffer（购自Takara公司）1μL，T4DNA连接酶1μL，pMD19-TSimple载体0.5μL；连接条件为：4℃连接过夜（12～16小时）。10μL连接产物采用热激转化法转入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆经菌落聚合酶链式反应检测。

检测后送深圳华大基因公司测序，测序结果为：

atggaaaaga  attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga    50

agacactctc  ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc    100

atcaagttcc  acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg    150

ctgaggtggt  tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc    200

gagagatgaa  gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca    250

aatggtcgct  gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg    300

aagaactttt  ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga    350

acgatgccgg  aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata    400

tcgtaagacc  ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg    450

agagaagtcg  gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga    500

tgagattcca  gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt    550

cgccacaaga  tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta    600

gaaacaacgg  aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca    650

aattggaaat  taa                                            663

②金鱼草Delila基因聚合酶链式反应扩增

参照GENBANK中己公布的金鱼草Delila基因，用PremierPrimer5.0软件，设计可扩增出金鱼草Delila基因编码框的上游引物、下游引物，并在上游引物前引入BamH I限制性酶切位点和保护碱基GAGGATCC，在下游引物前引入Sac I限制性酶切位点和保护碱基CAGGAGCTC，以便构建表达载体。上游引物序列Delila-F：5’-GAGGATCCATGGCTACTGGTATCCAAAACCAAAAG-3’，下游引物序列为Delila-R：5’-CAGGAGCTCAACTTCAAGACTTCATAGTAACTTTCTG-3’。以金鱼草cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，反应扩增体系为：金鱼草cDNA 2μL，dNTP 4μL，上游引物Delila-F 1μL，下游引物Delila-R 1μL，LA Taq Polymerase 0.5μL，10×LA PCR BufferII5μL，二次蒸馏水36.5μL；聚合酶链式反应扩增的方法为：94℃，5分钟；94℃、35秒，62℃、30秒，72℃、3分钟，38个循环；72℃，10分钟。将获得的扩增产物用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目标片段与pMD19-TSimple载体用T4DNA连接酶连接，连接体系为：PCR纯化回收产物7.5μL，10×T4连接酶Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，pMD19-T Simple载体0.5μL，连接条件为：4℃连接过夜（12～16小时）。10μL连接产物采用热激转化法转入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆经菌落聚合酶链式反应检测。检测后送深圳华大基因公司测序，测序结果为：

atggctactg gtatccaaaa ccaaaagata gtgcctgaga atttgaggaa  50

gcaacttgct attgctgtga gaagtatcca atggagttat gcaattttct  100

ggtccaattc agttgcacaa ccaggggtct tggagtgggg tgatgggttc  150

tacaatggag atattaaaac tcgaaaaact gtacaatctg tcgaattgaa  200

tcaagatcag ctgggattgc agagaagtga tcaattgaga gaactttatg  250

agtctctttc acttggtgaa accaacacac aagctaaaag gcctactgct  300

gcattatcac cagaagacct cactgatgct gagtggtttt tcttggtttg  350

catgtctttc atattcaata ttggccaagg gttgcctgga agaacattag  400

cacgaaatca agcagtatgg ctatgcaacg ctcatcgtgc ggacaccaaa  450

gttttctcgc gttctttgct tgcaaagagt gcgtcaattc agacagttgt  500

gtgctttcca tattcagaag gtgtagttga gctgggagca acagagctag  550

taccggagga tttgaatcta atccagcata taaaaacttc attcttggac  600

agtcctgcca ccgttcccaa gattcccaac tatgtctcca acagtattac  650

aaacaacaat gacctcattt gtgaagcgct tgaacatgct aatataccag  700

aaaacgatct tgatcagctt ttgaattgtc cagacacgaa catatgttct  750

cctgataaca gtttggatga ctttgcagac aatttactca tagacgaatc  800

gaatttggca gaaggcatca atggggaggt tcctcaaaca caaagctggc  850

ctttcatgga tgatgcaatc agcaattgtc tcaatagttc tatgaattct  900

agtgactgta tatctcaaac tcatgaaaat ctagagtctt ttgctccact  950

ttctgatgga aaagggccac cggagacgaa taattgtatg cacagcactc  1000

aaaaatgcaa tcagcagata gaaaacacgg gtgtccaagg cgatgaggtc  1050

cattatcaag gggtactttc caatcttttg aagagttccc atcagttggt  1100

tcttggtccc tacttcagaa atgggaatag agaatcaagc ttcgttagtt  1150

ggaacaagga tggatcgtcg ggtactcatg ttccccgaag cggaacctca  1200

caaagatttc tgaagaaagt actttttgaa gtagctagaa tgcatgaaaa  1250

ctccaggctt gatgctggta aacaaaaggg caacagtgac tgccttgcaa  1300

agccaacggc tgatgaaatt gatagaaacc acgtcttgtc agagagaaaa  1350

cgcagagaga aaataaacga acggtttatg attcttgcat ccctagtccc  1400

atccggtggc aaggttgaca aagtatcaat actagaccat acaatagatt  1450

acttgagagg gcttgagagg aaagtcgacg agctggaatc taacaaaatg  1500

gtaaagggcc gggggcggga atcaactaca aaaactaaac tacacgatgc  1550

cattgagagg acctctgata attatggcgc aacaaggaca agtaacgtca  1600

agaaaccgtt gacaaacaag agaaaggctt ctgatacgga caagattgga  1650

gccgtaaata gcagaggtcg attgaaagat tccttaacag ataatataac  1700

tgtgaacatt acaaacaagg atgtgttgat tgtcgtgact tgttcttcca  1750

aggagtttgt attgcttgaa gtgatggaag ccgtaagacg actaagtttg  1800

gattccgaaa ctgttcaatc ttccaacaga gatggaatga tatctattac  1850

cataaaagcc aagtgcaagg gattgaaggt tgcatcagca agtgtgatca  1900

aacaagctct tcagaaagtt actatgaagt cttgaagtt              1939

测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的编码框核苷酸序列一致（GenBank中金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的登录号分别为：DQ275529和M84913）。所述的金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的克隆，为通过转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量提供了重要的转录因子基因。

2、构建含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体

以pCAMBIA-1302和pBI121为植物表达载体，pCAMBIA-1302和pBI121为市场销售的生物材料，由澳大利亚CAMBIA公司生产。用限制性内切酶EcoRI和HindIII（本实施例中用到的限制性内切酶以及Buffer皆购自Takara公司）分别双酶切植物表达载体pBI121和pCAMBIA-1302。EcoR I和HindIII双酶切植物表达载体pBI121的体系和方法为：取植物表达载体pBI12110μL、10×M Buffer2.5μL、限制性内切酶EcoRI 1.5μL、限制性内切酶HindII1.5μL、二次蒸馏水9.5μL于37℃下反应2小时10分钟，回收纯化得到植物表达载体pBI121酶切产物，限制性内切酶EcoR I与限制性内切酶HindII、10×M Buffer、二次蒸馏水、植物表达载体pBI121的体积比为3：3：5：19：20。EcoR I和HindIII双酶切植物表达载体pCAMBIA-1302的体系和方法为：取植物表达载体pCAMBIA-130210μL、10×M Buffer 2.5μL、限制性内切酶EcoR I 1.5μL、限制性内切酶HindII1.5μL、二次蒸馏水9.5μL于37℃下反应2小时10分钟，回收纯化得到植物表达载体pCAMBIA-1302酶切产物，限制性内切酶EcoR I与限制性内切酶HindII、10×MBuffer、二次蒸馏水、植物表达载体pCAMBIA-1302的体积比为3：3：5：19：20。回收的酶切产物用T4DNA连接酶连接，连接体系和条件为：取植物表达载体pBI121的酶切纯化产物2μL，pCAMBIA-1302的酶切纯化产物6μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4连接酶Buffer 1μL混匀后于4℃连接过夜（12～16小时）。连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆，经菌落聚合酶链式反应检测及提取质粒做酶切检测筛选阳性克隆，从而获得pCAMBIA-1302⁺中间载体。

用限制性内切酶BamH I和Sac I分别双酶切含有金鱼草Delila基因的pMD19-T Simple载体和pCAMBIA1302⁺中间载体。BamH I和Sac I双酶切含有金鱼草Delila基因的pMD19-T Simple载体的体系和方法为：取含有金鱼草Delila基因的pMD19-T Simple载体10μL、10×K Buffer 2.5μL、限制性内切酶BamHI 1.5μL、限制性内切酶SacI 1.5μL、二次蒸馏水9.5μL于37℃反应2小时20分钟，回收纯化得到含有金鱼草Delila基因的酶切产物；限制性内切酶BamH I与限制性内切酶Sac I、10×K Buffer、二次蒸馏水、含有金鱼草Delila基因的pMD19-T Simple载体的体积比为：3：3：5：19：20。BamH I和Sac I双酶切pCAMBIA1302⁺中间载体的体系和方法为：取pCAMBIA1302⁺中间载体10μL、10×K Buffer 2.5μL、限制性内切酶BamH I 1.5μL、限制性内切酶SacI 1.5μL、二次蒸馏水9.5μL于37℃反应2小时20分钟，回收纯化得到pCAMBIA1302⁺中间载体的酶切产物，限制性内切酶BamH I与限制性内切酶Sac I、10×K Buffer、二次蒸馏水、pCAMBIA1302⁺中间载体的体积比为3：3：5：19：20。回收的酶切产物利用T4DNA连接酶连接，连接体系和条件为：取含有金鱼草Delila基因的酶切纯化产物2μL，pCAMBIA1302⁺中间载体的酶切纯化产物6μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4连接酶Buffer 1μL混匀后于4℃连接过夜（12～16小时）。连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，进行菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证获得pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒。

用限制性内切酶BglII和BstEII分别双酶切含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-T Simple载体和pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒。BglII和BstEII双酶切含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-TSimple载体的体系和方法为：取含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-T Simple载体10μL、10×HBuffer 2.5μL、限制性内切酶BglII 1.5μL、二次蒸馏水9.5μL于37℃反应1小时20分钟后，再加入限制性内切酶BstEII1.5μL在60℃反应1小时，回收纯化得到含有金鱼草Rosea1基因的酶切产物；限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEII、10×H Buffer、二次蒸馏水、含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-T Simple载体的体积比为3：3：5：19：20。BglII和BstEII双酶切pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒的体系和方法为：取pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒10μL、10×HBuffer2.5μL、限制性内切酶BglII 1.5μL、二次蒸馏水9.5μL于37℃下反应1小时20分钟后，再加入限制性内切酶BstEII1.5μL在60℃反应1小时，回收纯化得到pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒的酶切产物；限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEII、10×H Buffer、二次蒸馏水、pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒的体积比为3：3：5：19：20。回收的酶切产物利用T4DNA连接酶连接，连接体系和条件为：取含有金鱼草Rosea1基因的酶切纯化产物2μL，pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒的酶切纯化产物6μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4连接酶Buffer 1μL混匀后于4℃连接过夜（12～16小时）。连接产物采用热激转化法产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，进行菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证，得到含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体，该表达载体序列如核苷酸序列表<210>3。

上述的含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过基因工程策略来同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的含量。

3、制备含金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株

将含有金鱼草Rosea1基因的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融进行转化，根癌农杆菌EHA105感受态细胞为市场出售的生物材料，由澳大利亚CAMBIA公司生产，液氮冻融转化方法为：取100μL根癌农杆菌EHA105感受态细胞加入到离心管内置冰上溶化，将含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体30ng加入到溶化后的感受态细胞中，冰浴40分钟，液氮速冻1分钟，37℃水浴热激3分钟，向离心管中加入400μL LB液体培养基，28℃恒温100转/分钟恢复培养3～4小时，将转化后产物均匀涂布于10mL LB固体培养基（含40μL浓度为20mg/mL的利福霉素和50μL浓度为20mg/mL的卡那霉素）上，于28℃恒温培养箱中倒置培养18～36小时，挑取抗性单菌落，接种于10mL LB液体培养基中（含20μL浓度为20mg/mL的利福霉素和25μL浓度为20mg/mL的卡那霉素），28℃恒温180转/分钟振荡培养16小时，进行菌落聚合酶链式反应筛选，获得含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株。挑取抗性单菌落进行菌落聚合酶链式反应筛选结果见图1，在图1中，M为DNA分子量标准，从上到下依次为100、250、500、750、1000、2000bp，第一泳道+表示阳性对照即含金鱼草Delila基因的植物表达载体，第二泳道1、第三泳道2、第四泳道3表示不同菌株的Delila基因菌落聚合酶链式反应结果，第五泳道-表示阴性对照；第六泳道+表示阳性对照即含金鱼草Rosea1基因的植物表达载体，第七泳道4、第八泳道5、第九泳道”表示不同菌株的Rosea1基因菌落聚合酶链式反应结果，第十泳道-表示阴性对照。由图1可见，用聚合酶链式反应特异引物，能同时扩增出663bp和1939bp的特异DNA片段，说明含有金鱼草Rosea1基因金鱼草Delila基因的植物表达载体已经成功地转化到根癌农杆菌菌株中。

4、制备转基因丹参植株

（1）根癌农杆菌介导金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因转化丹参

无菌丹参试管苗的获得可采用常规组织培养技术方法，具体方法如下：

丹参种子用流水冲洗，用体积分数为75%乙醇水溶液表面灭菌20秒，二次蒸馏水冲洗2次，每次4分钟，用质量分数为0.1%的氯化汞水溶液表面灭菌10分钟，二次蒸馏水冲洗5次，种子用滤纸吸干表面残存的水分后置于MS基本培养基上萌发，25℃，16小时/8小时3000Lux光/暗培养，获得的无菌试管苗，从节间切断，将带有2个腋芽的茎段扦插于1/2MS培养基上，每四周继代繁殖一次。转化所用的材料均为继代2～4次的丹参试管苗，其中继代培养15天的幼苗用于基因转化，继代培养30天的幼苗用于核酸提取。

根癌农杆菌介导的丹参遗传转化体系采用叶盘法，具体方法如下：

选取继代培养15天的丹参无菌苗，将其叶片切成0.5厘米×0.5厘米的小块，转入预培养培养基中（预培养基为每1LMS培养基含有10mL浓度为1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a-萘乙酸的培养基），在正常培养条件下预培养1天，将预培养过的一部分叶片转入稀释好的含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体根癌农杆菌菌液中，28℃恒温100转/分钟浸染25～30分钟，取出叶片，用无菌滤纸吸干，转移到预培养培养基上暗培养2～3天（至叶片边缘有农杆菌长出）；另一部分预培养的叶片不进行农杆菌的浸染，直接在预培养培养基上培养生芽后，将芽剥落，置于1/2MS培养基上生根，作为实验未转化的空白对照植株；培养2～3天后，将叶片从原培养基上取出，转接到选择培养基上（选择培养基为1L MS培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的培养基），每10~15天更换一次选择培养基；待抗性芽长到约0.5~1厘米左右时，将抗性芽切下，转入的1/2MS培养基上生根。在每1L培养基中含有10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素、10mL浓度为3mg/mL的潮霉素的1/2MS培养基中筛选培养3～4次（每10～15天更换一次培养基），能正常生根的植株移接到MS培养基上继代培养，完整的植株从节间切断，带有2个腋芽的茎段扦插于MS培养基上继代培养，4～6周左右更换一次培养基，筛选的阳性转化株系和对照株系移栽至科研温室中同等条件培养，移栽培养45天的转基因丹参植株用于迷迭香酸和丹酚酸B含量的测定。

（2）转基因丹参植株的聚合酶链式反应检测

采用Bioer公司植物DNA提取试剂盒进行提取对照丹参植株、转化所述基因丹参株系和转化不含所述基因丹参株系的DNA，分别利用金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因完整编码框的上下游引物对目的基因进行聚合酶链式反应检测，电泳图见图2。在图2中，M为DNA分子量标准，从上到下依次为100、250、500、750、1000、2000bp，第一泳道+表示阳性对照即含金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物组合表达载体，第二泳道B表示不含DNA模板对照，第三泳道CK-表示对照丹参株系即非转化丹参株系，第四泳道CK+表示转化不含所述基因丹参株系即转化pCAMBIA1302+中间载体的对照株系，其余泳道1-30表示不同的转基因株系。由图2可见，以转化丹参基因组DNA为模板扩增，在波长为302nm的紫外线下能同时观察到663bp和1939bp的特异DNA片段，而以非转化丹参和转化不含所述基因丹参基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，说明所述的载体构建和转化策略是正确的，目的基因已插入丹参基因组中。转基因丹参植株的获得为筛选较高含量迷迭香酸和迷迭香酸的丹参株系提供了基本材料。

5、实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的表达

（1）引物的设计与合成

用Premier Primer 5.0软件，设计合成适合实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应扩增所需的金鱼草Rosea1基因，金鱼草Delila基因以及丹参管家基因肌动蛋白-β基因的引物。Rosea1基因，Delila基因以及丹参管家基因肌动蛋白-β基因实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应扩增检测引物分别为qRos1-F、qRos1-R；qDel-F、qDel-R；SmACT-F、SmACT-R。标记F的为上游引物，标记R的为下游引物，引物序列分别为：

qRos1-F：5’-AAATGGTCGCTGATTGCTGGTA-3’，

qRos1-R：5’-CGTTCTCCATCCTCGCCTAAAT-3’；

qDel-F：5’-GAGTTCCCATCAGTTGGTTCTTG-3’，

qDel-R：5’-CTTTGTGAGGTTCCGCTTCG-3’；

SmACT-F：5’-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’，

SmACT-R：5’-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3’。

（2）丹参总RNA的提取

采用OMEGA公司E.Z.N.A.^TM Plant RNA Kit提取试剂盒按照试剂盒说明书进行，方法与金鱼草总BNA的提取方法一致。

（3）cDNA第一链的合成

cDNA第一链的合成利用Takara公司PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒进行，反应体系为：5×PrimeScrip^TMBufe 2μL，PrimeScrip^TMRT Enzyme Mix 10.5μL，Oligo dT Primer 0.5μL，Random 6mers 0.5μL，丹参总RNA 1μL；RNase free dH₂O 5.5μL，将反应混合液混匀，37℃孵育30分钟，85℃反应5秒得cDNA，将cDNA用二次蒸馏水稀释50倍，-20℃保存备用

（4）实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的表达

以非转化丹参株系为空白对照，以转化不含有所述基因的植物表达载体丹参株系为阴性对照，用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应测定金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的表达量。实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应扩增条件是：94℃预变性，1分钟；40个循环（94℃变性，10秒；60℃退火并收集荧光信号，25秒）；95℃，1分钟；60℃，1分钟；60℃～95℃，每30秒升高0.5℃，收集一次荧光。反应结束后荧光信号值采用“比较Ct值的相对定量法”进行基因表达的分析。具体处理方法按照“iQ^TM5多重实时荧光定量PCR说明书”进行。检测结果见图3。在图3中，1-30,代表不同的转基因株系；CK-代表非转化丹参株系，CK+代表转化不含有所述基因的植物表达载体的株系，*、**、***分别表示实验组与对照组比较具有显著差异性(P<0.05、0.01和0.001)。由图3可见，与对照植株相比，外源目的基因金鱼草Delila基因和Rosea1基因同时在转化株系1、3、5、7、8、9、14、18、19、21、22、25、26、27、28、29中都具有不同程度的表达，Delila和Rosea1基因的相对表达量与对照相比具有显著性差异（P<0.5），表明所述的目的基因已在丹参中过量表达。

6、用高效液相色谱测定转基因丹参株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量

（1）高效液相色谱条件及系统适用性以及标准溶液的配制

①高效液相色谱条件

采用日本SHIMADZU公司LC-2010高效液相色谱仪，色谱柱为Phenomenex硅胶基质柱（5μmC₁₈反向柱，4.6mm×250mm），以质量分数为0.4%的醋酸水溶液、乙腈和甲醇为流动相梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序为0.01～5分钟，质量分数为0.4%的醋酸水溶液体积由95%降为90%，乙腈体积由5%升至10%；5～25分钟，质量分数为0.4%的醋酸水溶液体积由90%降为67%，乙腈体积由10%升至30%,甲醇体积由0升至3%；25～40分钟，质量分数为0.4%的醋酸水溶液体积由67%降为60%，乙腈体积由30%升至35%，甲醇体积由3%升至5%；柱温30℃，流速1.0mL/分钟，检测波长280nm，进样量20μL。

②配制标准溶液

配制标准溶液：分别称取迷迭香酸和丹酚酸B标准品各10.0mg，以体积分数为75%的甲醇溶液为溶剂配得浓度为10.0mg/mL的标准品母液，置于4℃冰箱中保存备用。实验时，分别取标准品母液稀释成浓度梯度的标准品溶液，0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。

本发明中采用的流动相梯度洗脱程序，迷迭香酸保留时间为24.82±0.08分钟，丹酚酸B保留时间为28.17±0.42分钟。峰形良好，可保证迷迭香酸和丹酚酸B与丹参中其它酚酸类成分的分离。

（2）绘制标准曲线

分别吸取迷迭香酸和丹酚酸B标准品母液并稀释成2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL 6个浓度梯度，0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析，绘制标准曲线。按照上述相应色谱条件进样，记录图谱及色谱参数，分别以迷迭香酸峰面积对标准品浓度进行回归分析，得到迷迭香酸的线性回归方程为：

y₁=6×10^-8x₁-0.015(r₁²=0.9990)

式中x₁表示样品中迷迭香酸的峰面积，y₁表示迷迭香酸的浓度，单位mg/mL，r₁表示相关系数。以丹酚酸B峰面积对标准品浓度进行回归分析，得到丹酚酸B的线性回归方程为：

y₂=4×10^-8x₂-0.006(r₂²=0.9990)

式中x₂表示样品中丹酚酸B的峰面积，y₂表示丹酚酸B的浓度，单位mg/mL，r₂表示相关系数。

（3）配制样品溶液

将丹参干燥根30℃烘至恒重，置于研钵中磨碎，分别称取转基因和对照丹参植株干燥粉末各25mg，置于1.5mL离心管中，加入500μL体积分数为75%的甲醇水溶液，30℃以频率30KHz的超声波提取20分钟，12000转/分钟离心6分钟。转移上清至新的离心管待用；残渣用相同方法再提取两次，合并三次上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪进行分析，记录各样品中迷迭香酸峰和丹酚酸B面积，代入线性回归方程，计算得迷迭香酸和丹酚酸B的含量。

用高效液相色谱测定转基因丹参株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量，结果见图4、图5，在图4、图5中，1为迷迭香酸，2为丹酚酸B。由图4、图5可见，在生长45天的转基因的丹参干燥根中，迷迭香酸的含量为26.96±0.90mg/g，丹酚酸B的含量达63.64±1.94mg/g，分别是同时期非转化普通丹参干燥根中迷迭香酸（16.90±0.48mg/g）和丹酚酸B（30.04±0.89mg/g）的1.60倍和2.12倍。

本实施例用共转化金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的基因工程策略获得了迷迭香酸和丹酚酸B共同高产的转基因丹参植株，用高效液相色谱法测定了转基因丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的含量，为规模化生产迷迭香酸和丹酚酸B并最终解决丹参资源紧缺问题提供了一种理想方法。