一种白花蛇舌草抗癌活性组分的制备方法

摘要

本发明公开了一种白花蛇舌草抗癌活性组分的提取方法，以白花蛇舌草全草为原材料，用正己烷提取2-3次，抽滤分离正己烷提取液与余渣，余渣用85-95%乙醇提取2-3次，得到乙醇提取液；合并乙醇提取液，浓缩后得浸膏；浸膏用无离子水重悬后，分别用乙醚和乙酸乙酯萃取，萃取物合并浓缩后，经硅胶柱色谱，分别用正己烷-二氯甲烷、二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯洗脱液，浓缩蒸干后得到白花蛇舌草提取物。本发明经过乙醇溶液提取、液液萃取富集及硅胶柱层析纯化，获得的白花蛇舌草抗癌活性组分中游离蒽醌类与总三萜酸成分含量，抗癌活性大大提高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药用植物的提取和成分富集方法，具体是一种白花蛇舌草抗癌活性组分的制备方法。

背景技术

现代社会中，癌症在发达国家是第二位死亡原因（仅次于心脏病），在发展中国家是第三位死亡原因（仅次于心脏病和肠道传染疾病），已成为世界范围内一个主要健康问题，给病人、家庭和社会造成了巨大的身心痛苦和经济负担。随着我国人口老龄化进程的加快，癌症和其它老年疾病的发病率和死亡率预计将会增加。因此，寻求新颖、有效的癌症治疗药物对减轻患者痛苦、减小家庭和社会的负担具有重大意义。

从传统药用植物中分离有效的抗癌成分是新药发现的一个热点领域。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）为茜草科耳草属植物的干燥全草，用于气管炎、肠痈（阑尾炎）、疮疖肿毒、湿热黄疸、小便不利等症，外用治疮疖痈肿，毒蛇咬伤。白花蛇舌草作为一味抗肿瘤中药，临床上用于手术、放化疗肿瘤病人的辅助治疗，或中晚期肿瘤病人以中医为主的抗癌治疗。目前，在白花蛇舌草中发现的活性成分有萜类（三萜和环烯醚萜）、蒽醌类、黄酮类、甾醇和多糖等，其中三萜类和蒽醌类均与白花蛇舌草的抗癌作用相关。在体外和动物试验中，主要三萜类成分熊果酸和齐墩果酸及蒽醌类成份2-羟基-3-甲基蒽醌对人白血病、直肠癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、皮肤癌、成胶质细胞瘤的多种细胞株有明显的抑制作用。目前按提取目标化合物的不同，白花蛇舌草的提取工艺分为沸水提取法、乙醇提取法及水提醇沉法。沸水提取法常用于汤剂制备，主要用于亲水性化合物的提取，对于极性较小的三萜类和蒽醌类提取效果不佳；乙醇提取法主要用于亲脂性化合物的提取，同时也可提取部分亲水化合物；水提醇沉法则用于粗多糖的提取。这些方法耗时较长，提取效率也较低。目前白花蛇舌草的乙醇提取工艺仅停留在乙醇提取物的制备阶段，对于运用减压短柱层析富集其中有效成分的方法尚无报道。用乙醇提取的白花蛇舌草粗提物抗癌活性成分的含量较低，制约了具有高抗肿瘤活性的产品的开发。因此，探索白花蛇舌草三萜类和蒽醌类成分的超声波辅助提取和减压短柱层析富集工艺，制备具有抗癌活性的有效组分，开发具有高抗肿瘤活性的产品，对实现该药材的精细加工、提高其加工效率和附加值具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种白花蛇舌草抗癌活性组分的提取和制备方法，该方法可提高抗癌活性组分中的游离醌类与总三萜酸成分的含量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种白花蛇舌草抗癌活性组分的提取方法，包括以下步骤：（1）白花蛇舌草全草干燥、粉碎；（2）在室温下，用正己烷超声波辅助提取2-3次，抽滤分离正己烷提取液与余渣，余渣挥干正己烷；（3）室温下，将步骤（2）中的余渣用85-95%乙醇超声波辅助提取2-3次，得到乙醇提取液；（4）合并乙醇提取液，浓缩后得浸膏；（5）浸膏用无离子水重悬，分别用乙醚和乙酸乙酯萃取，重复3-5次，萃取液减压浓缩蒸干，得到乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物；（6）将乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物混合，经硅胶减压短柱层析（图1），分别用正己烷-二氯甲烷、二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯洗脱液，浓缩、冷冻干燥后得到白花蛇舌抗癌活性组分。

做为一种优选的技术方案，步骤（2）中，每次用正己烷提取时的液料比为1 kg：5-10 L，每次超声波辅助提取30-60分钟。

做为一种优选的技术方案，步骤（3）中，每次用乙醇提取时的液料比为1 kg：5-10 L，每次超声波辅助提取30-60分钟。

做为一种优选的技术方案，步骤（4）中，合并后的提取液在40-60℃真空浓缩。

做为一种优选的技术方案，步骤（5）中，萃取液在40-60℃减压浓缩蒸干。

做为一种优选的技术方案，步骤（6）中，根据上样量，以400-600 mg样品/cm²柱底面积的比例选择适合的层析用玻璃布氏漏斗；将步骤（5）的浸膏用乙酸乙酯溶解，70-230目硅胶拌样，蒸干备用；400-800目硅胶干法装柱于层析用玻璃布氏漏斗中，柱内硅胶高度在7-12 cm，后经减压抽实至4-7 cm；样品/硅胶混合物干法上样，用正己烷洗脱至柱平衡，泵压力8-12 mbar下，以高极性溶剂10-30%递增的梯度依次用正己烷-二氯甲烷、二氯甲烷-乙酸乙酯溶剂组合减压洗脱，每个梯度组合200-900 mL，每100 mL为一个流份，收集二氯甲烷：乙酸乙酯=80:20（v/v）至二氯甲烷：乙酸乙酯=0：100（v/v）洗脱液，40-60℃减压浓缩后冷冻干燥。

本发明还提供一种具有抗癌作用的药物，该药物是用上述白花蛇舌草提取物制成与医学上可接受的药物载体制成的片剂、胶囊、粉剂、注射剂和口服液。

与以往粗提取物的制备方法不同，本发明经过正己烷脱脂、乙醇溶液超声波辅助提取、液液萃取富集及硅胶减压短柱层析纯化，获得白花蛇舌草抗癌活性组分。通过不同极性溶剂的梯度萃取和硅胶柱不同极性溶剂的梯度洗脱，以薄层色谱法和显色法进行监控，合并富含游离蒽醌类与总三萜酸成分的洗脱液流份，得到活性组分，超声波辅助提取可产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物细胞壁，使溶剂渗透到细胞中，不仅可以提高提取效率，还可大大缩短提取时间。而与传统柱层析比较，减压短柱层析具有耗时短（一般1-2 h）、硅胶和洗脱剂用量小、上样量大、分离效果好等优点，结合上述方法使得游离蒽醌与总三萜酸在有效组分中的含量大大提高，得到的有效组分中蒽醌成分含量为416.4 mg/g，总三萜酸成分含量为83.1 mg/g。为证明本方法对白花蛇舌草蒽醌和总三萜酸成分的提取、富集和纯化效果，以大黄素为标准品用乙酸镁显色法对游离蒽醌成分含量进行了，并以齐墩果酸为标准品用香草醛-高氯酸显色法对总三萜酸成分含量进行了测定，结果见表1。

表1 白花蛇舌草样品中蒽醌类和总三萜酸成分含量

样品游离蒽醌成分含量（mg/g）总三萜酸成分含量（mg/g）生药材15.22.81乙醇提取物113.759.8抗癌活性组分416.483.1

本发明的有效组分在体外试验中对直肠癌、多发性骨髓瘤、肝癌、宫颈癌、前列腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，在浓度为100 μg/mL时，白花蛇舌草抗癌活性组分对肿瘤细胞的增殖抑制作用显著大于10 μg/mL紫杉醇或100 μg/mL白花蛇舌草乙醇提取物，具有较好的体外抗癌活性。为证明白花蛇舌草抗癌活性组分的抗癌效果，用CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖检测（MTS）试剂盒测定对直肠癌（Caco-2）、宫颈癌（HeLa）、肝癌（HepG2）、多发性骨髓瘤（RPMI 8226）、前列腺癌（PC-3）细胞的增殖的抑制作用。肿瘤细胞分别与乙醇提取物（100 μg/mL）、抗癌活性组分（100 μg/mL）和阳性对照紫杉醇（10 μg/mL）共培养48小时后，用MTS试剂处理后，测定各对照和处理在492 nm波长下吸光度值，以二甲亚砜（DMSO）为溶剂对照，计算肿瘤细胞存活率。存活率越低，说明样品对肿瘤细胞的增殖抑制作用越大，反之亦然。由图1可见，在浓度为100 μg/mL时，白花蛇舌草抗癌活性组分对肿瘤细胞的增殖抑制作用显著大于10 μg/mL紫杉醇（P<0.05）或100 μg/mL白花蛇舌草乙醇提取物（P<0.05），具有较好的体外抗癌活性。

本发明的有效组分所含的蒽醌类和三萜类成分对待测肿瘤细胞株的增殖抑制作用显著大于对健康人外周血单核细胞（PBMC）的增殖抑制作用，表明其细胞增殖抑制作用具有选择性，对人体正常细胞的细胞毒性较小。为验证白花蛇舌草抗癌活性组分的抗癌效果，用CellTiter 96 AQueous 单溶液细胞增殖检测（MTS）试剂盒测定了该组分中分离得到的蒽醌类和三萜类化合物对人直肠癌（Caco-2）、宫颈癌（HeLa）、肝癌（HepG2）、多发性骨髓瘤（RPMI 8226）、前列腺癌（PC-3）细胞的增殖抑制作用。同时为确定这些化合物对人体健康细胞的细胞毒性，还测定了这些化合物对健康人外周血单核细胞（PBMC）的增殖抑制作用。不同浓度化合物与受试细胞共培养48 h后，测定细胞存活率，增殖抑制作用以化合物对受试细胞数目抑制率达到50%时的对应浓度IC₅₀值表示，结果列于表2。IC₅₀值越小，表示抑制作用越强，反之亦然。如表2中所示，白花蛇舌草抗癌活性组分中的蒽醌类和三萜类化合物对各种癌细胞均有不同程度的增殖抑制作用。其中2-羟甲基蒽醌、Digiferruginol和熊果酸对HeLa细胞的体外增殖抑制力与紫杉醇相当（P>0.01），熊果酸对HepG2细胞的体外增殖抑制力与紫杉醇相当（P>0.01）。此外，2-甲基-3-甲氧基蒽醌、2-羟甲基蒽醌和Digiferruginol对多数待测肿瘤细胞株的增殖抑制作用大于对健康人外周血单核细胞的增殖抑制作用（P<0.001），表明其增殖抑制作用具有选择性，对人体正常细胞的细胞毒性较小。

表2  白花蛇舌草抗癌活性组分中的化合物对不同癌细胞和健康人外周血单核细胞（PBMC）的增殖抑制作用（MTS法，IC₅₀均值 ± SEM，μM， n=3）

No.化合物Caco-2HeLaHepG212-甲基-3-甲氧基蒽醌102.40±5.8792.82±2.47*> 20022-羟甲基蒽醌93.25±0.49*57.60±2.39*^,#151.80±4.93*32-羟基-3-甲基蒽醌155.40±2.38101.90±1.05176.20±2.914Digiferruginol45.33±1.48*41.84±2.17*^,##108.60±3.03*51-甲氧基-2-羟基蒽醌> 200154.10±1.74> 2006齐墩果酸> 200124.50±2.93*198.10±1.297熊果酸70.69±3.0965.02±3.96^#36.63±4.85*^,# 紫杉醇33.56±1.7558.37±1.9834.16±3.45No.化合物RPMI 8226PC-3PBMC12-甲基-3-甲氧基蒽醌71.10±2.51*82.46±2.08*102.00±1.5422-羟甲基蒽醌86.75±5.20*111.20±5.70*> 20032-羟基-3-甲基蒽醌180.00±0.9528.82±2.56*70.36±3.424Digiferruginol34.84±1.42*80.91±1.13*171.90±1.9551-甲氧基-2-羟基蒽醌98.73±2.02> 20098.77±1.046齐墩果酸> 20065.18±4.05> 2007熊果酸62.66±2.4722.33±3.66*58.68±2.39 紫杉醇28.07±0.7514.15±4.71未测定

*P<0.001 Vs PBMC, ^#P>0.01 Vs 紫杉醇, ^##P<0.01 Vs 紫杉醇。

附图说明

图1为减压短柱层析示意图。

图中，１－样品-硅胶混合物，２－硅胶，３－砂芯滤网。

图2为白花蛇舌草抗癌活性组分对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用。

图3为实施例4中化合物1-7的化学结构。

具体实施方式

实施例1

白花蛇舌草抗癌活性组分的提取方法，包括以下步骤：

（1）白花蛇舌草全草干燥、粉碎；

（2）在室温下，将3 kg白花蛇舌草用正己烷超声波辅助提取2次，用纱布过滤和滤纸抽滤分离正己烷提取液与余渣，余渣挥干正己烷，每次提取时加入正己烷15 L，每次提取40分钟；

（3）室温下，将步骤（2）中的余渣用90%乙醇超声波辅助提取2次，浸提液先后经纱布过滤和滤纸抽滤，每次提取时加入乙醇15 L，每次提取40分钟，得到乙醇提取液；

（4）合并2次乙醇提取液，在40℃真空浓缩后得浸膏253.28 g；

（5）浸膏用1000 mL无离子水重悬，分别用1000 mL乙醚和1000 mL乙酸乙酯萃取，重复3次，萃取液在40℃减压浓缩蒸干，得到乙醚萃取物49.35 g和乙酸乙酯萃取物32.67 g；

（6）将步骤（5）中得到的乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物混合，称取40 g溶于60 mL乙酸乙酯，用40 g 70-230目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯味。取一个直径为10 cm的具砂芯滤网３的玻璃布氏漏斗，400-800目硅胶800 g干法装柱，柱内硅胶２高度为11 cm，轻敲柱壁，保持表面平整，抽真空并压实至硅胶２高度为7 cm备用。拌好的样品-硅胶混合物１干法上柱，顶上铺酸洗细石英砂，用正己烷洗脱至柱平衡，在泵压力10 mbar下，依次用正己烷-二氯甲烷（100:0, 80:20, 60:40, 50:50, 40:60, 20:80, 0:100; v/v）、二氯甲烷-乙酸乙酯（100:0, 80:20, 60:40, 50:50, 40:60, 20:80, 0:100; v/v）减压梯度洗脱，每个梯度组合500 mL，洗脱液每100 mL为一个流份，以薄层色谱法和显色法进行监控，收集合并二氯甲烷：乙酸乙酯=80:20（v/v）至二氯甲烷：乙酸乙酯=0：100（v/v）洗脱液，40℃减压浓缩、冷冻干燥，得到白花蛇舌草抗癌活性组分8.47g。

实施例2

白花蛇舌草抗癌活性组分的提取方法，包括以下步骤：

（1）白花蛇舌草全草干燥、粉碎；

（2）在室温下，将3 kg白花蛇舌草用正己烷超声波辅助提取3次，用纱布过滤和滤纸抽滤分离正己烷提取液与余渣，余渣挥干正己烷，每次提取时加入正己烷30 L，每次提取60分钟；

（3）室温下，将步骤（2）中的余渣用95%乙醇超声波辅助提取3次，浸提液先后经纱布过滤和滤纸抽滤，每次提取时加入乙醇30 L，每次提取60分钟，得到乙醇提取液；

（4）合并3次乙醇提取液，在60℃真空浓缩后得浸膏287.11 g；

（5）浸膏用1000 mL无离子水重悬，分别用1000 mL乙醚和1000 mL乙酸乙酯萃取，重复5次，萃取液在60℃减压浓缩蒸干，得到乙醚萃取物54.93 g和乙酸乙酯萃取物33.41 g；

（6）将步骤（5）中得到的乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物混合，称取40 g溶于60 mL乙酸乙酯，用40 g 70-230目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯味。取一个直径为10 cm的具砂芯滤网３的玻璃布氏漏斗，400-800目硅胶800 g干法装柱，柱内硅胶２高度为12 cm，轻敲柱壁，保持表面平整，抽真空并压实至硅胶２高度为7 cm备用。拌好的样品-硅胶混合物１干法上柱，顶上铺酸洗细石英砂，用正己烷洗脱至柱平衡，在泵压力12 mbar下，依次用正己烷-二氯甲烷（100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100; v/v）、二氯甲烷-乙酸乙酯（100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80,10:90, 0:100; v/v）减压梯度洗脱，每个梯度组合200 mL，洗脱液每100 mL为一个流份，以薄层色谱法和显色法进行监控，收集合并二氯甲烷：乙酸乙酯=80:20（v/v）至二氯甲烷：乙酸乙酯=0：100（v/v）洗脱液，40℃减压浓缩、冷冻干燥，得到白花蛇舌草抗癌活性组分9.05g。

实施例3

白花蛇舌草抗癌活性组分的提取方法，包括以下步骤：

（1）白花蛇舌草全草干燥、粉碎；

（2）在室温下，将3 kg白花蛇舌草用正己烷超声波辅助提取2次，用纱布过滤和滤纸抽滤分离正己烷提取液与余渣，余渣挥干正己烷，每次提取时加入正己烷21 L，每次提取40分钟；

（3）室温下，将步骤（2）中的余渣用85%乙醇超声波辅助提取2次，浸提液先后经纱布过滤和滤纸抽滤，每次提取时加入乙醇21L，每次提取50分钟，得到乙醇提取液；

（4）合并2次乙醇提取液，在50℃真空浓缩后得浸膏272.37 g；

（5）浸膏用1000 mL无离子水重悬，分别用1000 mL乙醚和1000 mL乙酸乙酯萃取，重复3次，萃取液在50℃减压浓缩蒸干，得到乙醚萃取物47.65 g和乙酸乙酯萃取物36.82 g；

（6）将步骤（5）中得到的乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物混合，称取40 g溶于60 mL乙酸乙酯，用40 g 70-230目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯味。取一个直径为10 cm的具砂芯滤网３的玻璃布氏漏斗，400-800目硅胶800 g干法装柱，柱内硅胶２高度为7 cm，轻敲柱壁，保持表面平整，抽真空并压实至硅胶２高度为4cm备用。拌好的样品-硅胶混合物１干法上柱，顶上铺酸洗细石英砂，用正己烷洗脱至柱平衡，在泵压力8 mbar下，依次用正己烷-二氯甲烷（100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100; v/v）、二氯甲烷-乙酸乙酯（100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100; v/v）减压梯度洗脱，每个梯度组合800 mL，洗脱液每100 mL为一个流份，以薄层色谱法和显色法进行监控，收集合并二氯甲烷：乙酸乙酯=75:25（v/v）至二氯甲烷：乙酸乙酯=0：100（v/v）洗脱液，50℃减压浓缩、冷冻干燥，得到白花蛇舌草抗癌活性组分7.73g。

实施例4

白花蛇舌草抗癌活性组分中蒽醌类和总三萜酸成分的分离和结构鉴定

为确定利用本发明方法得到的白花蛇舌草抗癌活性组分中蒽醌类和总三萜酸成分的结构，运用反复硅胶柱层析、制备薄层色谱和重结晶等方法，对7 g从实施例1-3中得到的白花蛇舌草抗癌活性组分进行分离，经波谱分析，得到5个蒽醌类化合物和2个三萜酸化合物，其结构式如图2所示。其波谱信息和结构鉴定结果如下，其中化合物1、2、4为首次从白花蛇舌草中分得：

化合物1 (5.0 mg)：淡黄色针晶。ESI-MS m/z 251.92 [M]⁺。分子式: C₁₆H₁₂O₃。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 8.25 (2H, m, 5-H, 8-H), 7.98 (1H, s, 1-H), 7.75 (2H, m, 6-H, 7-H), 6.90 (1H, s, 4-H), 2.40 (3H, 2, 2-CH₃)。¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 182.5 (10-C), 182.4 (9-C), 153.8 (3-C), 146.2 (2-C), 134.5 (10a-C), 133.7 (6-C), 133.6 (7-C), 132.9 (8a-C), 131.4 (4a-C), 126.9 (1-C), 126.7 (8-C), 126.6 (5-C), 126.4 (4-C), 123.5(9a-C), 62.1 (12- OCH₃), 16.3 (11-CH₃)。鉴定该化合物为2-甲基-3-甲氧基蒽醌。

化合物2 (7.7 mg)：金黄色针晶。ESI-MS m/z 236.71 [M-H]^-。分子式: C₁₅H₁₀O₃。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 8.25 (3H, m, 4-H, 5-H, 8-H), 8.22 (1H, m, 1-H), 7.77 (1H, m, 3-H), 7.73 (2H, m, 6-H, 7-H), 4.84 (2H, s, 2-CH₂), 4.84 (1H, s, 11-OH)。¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 183.1 (10-C), 182.9 (9-C), 147.6 (2-C), 134.2 (7-C), 134.1 (6-C), 133.6 (9a-C), 133.5 (8a-C), 133.5 (10a-C),132.7 (4a-C), 131.9 (3-C), 127.7 (4-C), 127.3 (5-C), 127.2 (8-C), 124.9 (1-C), 64.4 (11-C)。鉴定该化合物为2-羟甲基蒽醌。

化合物3 (52.1 mg)：橘黄色针晶或不定形粉末。ESI-MS m/z 237.01 [M-H]^-。分子式: C₁₅H₁₀O₃。¹H NMR (acetone-d₆, 400 MHz): 8.23 (2H, m, 5-H, 8-H), 8.04 (1H, s, 1-H), 7.88 (2H, m 6-H, 7-H), 7.66 (1H, s, 4-H), 2.38 (3H, d, J=1.2 Hz, 3-CH₃)。¹³C NMR (acetone-d₆, 100 MHz): 182.2 (9-C), 161.8 (2-C), 134.4 (6-C), 134.3 (7-C), 134.3 (8a-C), 132.9 (4a-C), 130.8 (3-C), 130.7 (1-C), 127.3 (9a-C), 127.2 (5-C), 127.2 (8-C), 112.1 (4-C), 16.3 (11-C)。鉴定该化合物为2-羟基-3-甲基蒽醌。

化合物4 (3.4 mg)：红色不定形粉末。ESI-MS m/z 253.02 [M-H]^-。分子式: C₁₅H₁₀O₄。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 13.04 (1H, br s,1-OH), 8.32 (2H, m, 5-H, 8-H), 7.86 (1H, d, J=7.6 Hz, 4-H), 7.83 (2H, m, 6-H, 7-H), 7.78 (1H, d, J=7.6 Hz, 3-H), 4.87 (3H, 2-CH₂OH)。¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 189.1 (9-C), 182.2 (10-C), 160.2 (1-C), 136.3 (3-C), 134.8 (7-C), 134.7 (6-C), 133.7 (10a-C), 133.1 (8a-C), 132.5 (4a-C), 127.5 (5-C), 126.9 (8-C), 119.5 (9a-C), 115.6 (2-C), 112.8 (4-C), 60.9 (11- CH₂OH)。鉴定该化合物为Digiferruginol。

化合物5 (4.0 mg)：橘黄色针晶。ESI-MS m/z 252.78 [M-H]^-。分子式: C₁₅H₁₀O₄。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 8.27 (2H, m, 5-H, 8-H), 8.14 (1H, d, J=8.6 Hz, 4-H), 7.77 (2H, m, 6-H, 7-H), 7.36 (1H, d, J=8.6 Hz, 3-H), 6.69 (1H, s, 2-OH), 1.57 (3H, s, 1-OCH₃), 4.08 (3H, s, 1-OCH₃)。¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 182.7 (9-C), 182.1 (10-C), 155.5 (2-C), 146.6 (1-C), 134.4 (10a-C), 133.8 (6-C), 133.8 (6-C), 132.9 (8a-C), 127.5 (9a-C), 127.1 (5-C), 126.8 (8-C), 125.8 (4-C), 125.5 (4a-C), 120.2 (3-C), 62.1 (11-OCH₃)。鉴定该化合物为1-甲氧基-2-羟基蒽醌。

化合物6 (21.6 mg)：白色不定形粉末。ESI-MS m/z 455.03 [M-H]^-。分子式: C₃₀H₄₈O₃。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 5.29 (1H, 12-H), 3.22 (1H, dd, J=10.8, 4.6 Hz, 3-H), 2.82 (1H, dd, J=12.8, 4.8 Hz, 18-H), 2.17 (1H, 15-H), 2.02 (1H, 16-H), 1.98 (1H, 22-H), 1.95 (1H, 16-H), 1.93 (1H, 11-H), 1.90 (1H, 11-H), 1.88 (1H, 19-H), 1.81 (1H, 2-H), 1.77 (1H, 2-H), 1.74 (1H, 22-H), 1.62 (9-H), 1.59 (1H, 6-H), 1.56 (1H, 1-H), 1.52 (1H, 7-H), 1.45 (1H, 21-H), 1.41 (1H, 6-H), 1.38 (1H, 15-H), 1.35 (1H, 19-H), 1.31 (1H, 21-H), 1.28 (1H, 7-H), 1.13 (3H, s, 27-CH₃), 1.08 (1H, 1-H), 0.98 (1H, s, 23-H), 0.93 (3H, s, 26-CH₃), 0.91 (3H, s, 30-CH₃),  0.90 (3H, s, 24-CH₃), 0.87 (1H, 5-H), 0.75 (3H, s, 25-CH₃), 0.77 (3H, s, 29-CH₃)。¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 182.4 (28-C), 143.5 (13-C), 122.6 (12-C), 79.0 (3-C), 55.2 (5-C), 47.6 (9-C), 46.5 (17-C), 45.9 (19-C),  41.6 (14-C), 41.0 (18-C), 39.3 (8-C), 38.7 (4-C), 38.4 (1-C), 37.1 (10-C), 33.8 (21-C), 33.1 (7-C), 32.9 (29-C),  32.6 (22-C), 32.4 (20-C), 28.1 (23-C), 27.7 (15-C), 27.2 (2-C), 25.9 (27-C), 23.5 (16-C), 23.4 (11-C), 22.9 (30-C), 18.3 (6-C), 17.1 (26-C), 15.6 (24-C), 15.0 (25-C)。鉴定该化合物为齐墩果酸。

化合物7 (68.5 mg)：白色不定形粉末。ESI-MS m/z 455.10 [M-H]^-。分子式: C₃₀H₄₈O₃。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 5.11 (1H, t, J=3.6 Hz, 12-H), 2.98 (1H, m, 3-H), 2.09 (1H, d, J=10.4 Hz, 18-H), 1.02 (3H, s, 27-CH₃), 0.90 (3H, s, 23-CH₃), 0.88 (3H, s, 26-CH₃), 0.85 (3H, d, J=6.0 Hz, 30-CH₃)， 0.79 (3H, d, J=6.4 Hz, 29-CH₃)， 0.73 (3H, s, 24-CH₃), 0.66 (3H, s, 25-CH₃)。¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 178.7 (28-C),138.6 (13-C), 124.7 (12-C), 77.0 (3-C), 54.9 (5-C), 52.5 (18-C), 47.2 (9-C), 47.0 (17-C), 41.8 (14-C), 39.0 (4-C), 38.7 (1-C), 38.6 (19-C), 38.6 (20-C), 38.4 (7-C), 36.7 (10-C), 36.5 (22-C), 32.9 (7-C), 30.4 (21-C), 28.4 (15-C), 27.7 (23-C), 27.2 (2-C), 24.0 (16-C), 23.5 (27-C), 23.0 (11-C), 21.3 (30-C), 18.2 (6-C), 17.2 (29-C),17.1 (26-C), 16.3 (24-C), 15.4 (25-C)。鉴定该化合物为熊果酸。