水稻RAD51C基因在育性控制中的应用

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻育性控制基因RAD51C的分离克隆、功能验证。RAD51C基因属于RecA/RAD51蛋白质家族，它能够控制水稻花粉以及胚囊的育性。敲除该基因使水稻减数分裂异常导致花粉不育和胚囊不育。可以通过组织特异性地抑制RAD51C基因表达创建雄性不育或者雌雄不育水稻材料。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一个育性控制基因RAD51C的分离克隆和功能 验证。RAD51C通过参与水稻减数分裂的调控，控制水稻花粉育性和胚囊育性。对该基因的 生物学功能验证结果表明，该基因可以作为不育基因，用于水稻杂交种子生产和育性控制。

背景技术

水稻生产在我国粮食生产上有着举足轻重的地位。自二十世纪七十年代以来，一系列杂 交水稻的推广，使得单产有了大幅度提高，在一定程度上缓解了我国人口迅速增长对粮食的 需求急剧增长的压力。杂交水稻选用在遗传上有一定差异的优良水稻品种，用三系法(不育 系，保持系和恢复系)、一些衍生出来的两系法和一系法生产具有杂种优势的杂交种。杂种优 势是两个遗传背景不同的亲本杂交产生的杂种一代在生长势，生活力，繁殖力，产量等方面 优于双亲的现象。三系法中，不育系是不能自花授粉结实的，主要为雌蕊发育正常，而雄蕊 的发育退化或者败育。保持系的雌雄蕊都发育正常。将保持系的花粉授予不育系可以成功获 得种子，但是由该种子产生的植株仍然为雄性不育。用恢复系的花粉授予不育系所产生的种 子长出的植株又恢复了育性。

雄性不育系的利用是制备杂交种的重要环节，但是从自然界寻找不育系并不多，而且选 育雄性不育系和恢复系也存在一定的困难，利用基因工程的方法获得不育系和恢复系前景诱 人。花粉发育是一个极其复杂的过程，需要多个基因按照一定的时空表达模式共同参与，才 能顺利完成，任何一个过程出现异常都会导致花粉不育。通过基因工程的方法创造雄性不育 系的途径包括：(1)利用花药或者花粉特异的启动子表达细胞毒素基因，选择性破坏花粉发 育的某些组织；(2)通过基因沉默可以阻断花粉发育相关基因的表达，导致花粉败育；(3) 改变花粉发育过程中关键酶或者功能蛋白的时空表达可以获得雄性不育材料；(4)通过导入 细胞质雄性不育基因或者扰乱线粒体功能创造细胞质雄性不育系等(缪颖等2000；宋江华等 2008)；对应雄性不育系的保持系可以是没有转化的对照植株，也可以是通过基因工程改造得 到的保持系；另外，还可以通过无性繁殖来保持不育系。

在真核生物的生活史中，要经历二倍体的孢子体时代和单倍体的配子体时代。在孢子体 时代，真核生物进行减数分裂形成单倍体配子；来自父母本的雌雄配子发生融合使后代恢复 到二倍体的水平。减数分裂在真核生物的有性生殖形成单倍体的过程中扮演着重要的角色， 此过程中染色体出现的联会交换，大大增加了遗传的多样性。近十多年来，通过对模式生物 酵母的减数分裂的研究，鉴定了许多控制减数分裂的基因。此外，人们通过反向或正向遗传 学的方法在模式植物拟南芥中克隆了几十个控制减数分裂的基因(Schwarzacher，2003；Ma， 2005；Mercier和Grelon，2008)。比较酵母和植物的减数分裂发现，减数分裂的机制在真核 生物中相对保守。

真核生物的RAD51是一类与大肠杆菌(Escherichia coli)重组蛋白RecA结构和功能上 很相似的蛋白，在有丝分裂和减数分裂过程中起到重要作用(Shinohara等，1992)。在对 recA/RAD51基因家族的研究中发现：RAD51基因家族由于基因重复和基因水平转移，而形成 RAD51，RAD51B，RAD51C，RAD51D，DMCl，XRCC2，XRCC3，RecA等多个成员(Lin等，2006)。 真核生物酵母基因组中包含多个RecA和RAD51同源蛋白，而在哺乳动物中包含五个同源蛋 白(RAD51B，RAD51C，RAD51D，XRCC2和XRCC3)，这些蛋白与RAD51或者相互之间有 20％至30％的序列同源性(Lovett，1994；Sonoda等，2001)。水稻中至少有13个同源蛋白， 其中包括：RAD51A1，RAD51A2，RAD51B，RAD51C，RAD51D，DMC1A，DMC1B，XRCC2， XRCC 3以及四个RecA同源蛋白(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

RAD51基因家族成员大多数在减数分裂中扮演重要角色，突变以后减数分裂可能会出现 不同程度的异常。酵母DMC1基因是一个在减数分裂前期I表达的减数分裂特异基因，编码 的蛋白是减数分裂同源染色体配对所必需的。在中国小鼠细胞系CL-V4B、irs1、irs1SF中， RAD51C，XRCC2和XRCC3突变后对DNA交联剂敏感，染色体自发异常频率明显增加(Cui 等，1999；Godthelp等，2002)。小鼠RAD51B，RAD51D以及XRCC2突变后在胚胎发育阶段 致死(Shu等，1999；Deans等，2000；Pittman和Schimenti，2000)。线虫RAD51C，XRCC3 突变后减数分裂重组异常导致部分不育，并且对DNA双链损伤剂敏感(Abdu等，2003)。在 拟南芥中，AtRAD51突变以后营养生长和有丝分裂没有明显的异常，而减数分裂受到严重的 影响(Mercier等，2003)。在AtRAD51的突变体中，偶线期染色体不能正常的联会，无法形 成联会复合体以及减数分裂前期I出现染色体断裂(Mercier等，2003)。AtRAD51C和AtXRCC3 突变以后与AtRAD51的突变体有着类似的表型：营养生长正常；减数分裂异常，不能形成正 常的雌雄配子从而导致败育(Bleuyard等，2006)。AtRAD51B、AtRAD51D和AtXRCC2突变 以后提高了对丝链霉素C(mitomycin C)的敏感性，但减数分裂没有明显的异常(Bleuyard等， 2005；Durrant等，2007)。AtDMC1突变以后减数分裂过程中不能形成二价体，但是可以修 复双链断裂(Couteau等，1999)。玉米RAD51A1和RAD51A2参与同源染色体联会配对以及 双链断裂修复过程，双突变体中能够看到非同源染色体的配对，联会和交换。水稻中有两个 拷贝的DMC1，分别是DMC1A和DMC1B，DMC1基因控制水稻细胞减数分裂过程中同源染 色体的配对，该基因受抑制后营养生长正常，但是减数分裂过程中染色体进行不均等分离和 孢子形成无规则，从而使花粉不育，结实率降低(Ding等，2001；Deng和Wang，2007)。

目前还没有关于水稻RAD51C基因的功能的报道。本发明利用RAD51C的T-DNA插入 突变体详细研究了该基因在减数分裂过程中的作用，为植物育性的控制提供了新的途径，也 为我们深入了解减数分裂的机制提供了帮助。

发明内容

本发明的目的是分离克隆一个控制水稻减数分裂的基因，涉及分离一种包含RAD51C基 因的DNA片段，通过该片段的T-DNA插入突变体以及遗传互补鉴定表明该片段控制水稻减 数分裂、影响雌雄配子的发育从而控制水稻的育性。该基因的克隆有利于了解水稻减数分裂 的过程，并为人工控制水稻花粉育性或胚囊育性以生产杂交种子提供理论基础。其中，所述 片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或 者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。

本发明的另一个目的是通过控制水稻减数分裂基因RAD51C的表达来获得不育转基因水 稻，进而利用不育水稻生产杂交种，为增加水稻产量，改善水稻品质，提高抗性和适应性提 供重要资源，因此在水稻育种上具有重要价值，尤其在水稻杂种优势利用上据有重要的实践 意义。具体的说就是利用基因改造的方法，利用器官或组织特异表达的启动子，特异性的抑 制该基因在雌配子或/和雄配子的表达从而得到雌性不育或雄性不育或雌雄都不育的植株，创 造新的雌性或/和雄性不育系，这些不育系可以用于杂交水稻的生产，如水稻杂交种的培育。 也可以用于控制其他植物的育性。另外，这些不育系还可以使转基因植物的花粉不育，消除 转基因植物中外源基因逃逸的风险。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2是水稻RAD51C基因的序列和它编码的蛋白质的氨 基酸序列。

图1：本发明鉴定、分离克隆和功能分析水稻RAD51C基因的流程图。

图2：水稻RAD51C基因的T-DNA插入突变体4D-50016的鉴定。(A)RAD51C基因结 构和T-DNA插入位置示意图。其中RAD51C基因的非翻译区的结构和RAD51C基因两侧的 基因组结构是根据GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中粳稻品种日本晴的相对 应区段的DNA和cDNA(AK060971)序列确定的。(B)RAD51C基因T-DNA插入突变体 T₁植株的基因型检测。WT：野生型Dongjin(对照)。(C)RAD51C基因在野生型Dongjin (WT)、T-DNA插入突变体(M)和阴性植株(N)中的表达分析。以Actin基因的表达量作 为样品量的参照。转基因家系为T₂代。

图3：RAD51C敲除株系的表型观察。图中标尺为150μM。(A)Dongjin(野生型)和 RAD51C敲除植株在营养生长期没有明显差异。(B)Dongjin(野生型)和RAD51C敲除植株 的小花在外观上没有明显差别。(C)Dongjin(野生型)植株的花药饱满，而RAD51C敲除植 株的花药相对瘦瘪。(D)Dongjin(野生型)植株的花药中充满圆形花粉粒，而RAD51C敲除 植株的花药中花粉粒干瘪。(E)Dongjin(野生型)植株能正常散粉，而RAD51C敲除植株不 能正常散粉。(F)Dongjin(野生型)植株的花粉粒正常，而RAD51C敲除植株的花粉粒败育。

图4：T-DNA插入与不育性状的共分离分析。结实率为3个穗子结实率的平均值±标准 误。(A)一个RAD51C T-DNA插入突变体(4D-50016，Dongjin背景)与Dongjin杂交的 BC₁F₂群体的基因型以及结实率分析。对照为Dongjin。(B)另一个RAD51C T-DNA插入突 变体(4D-50016，Dongjin背景)与中花11杂交的BC₁F₂群体的基因型以及结实率分析。对 照为中花11。

图5：遗传转化载体pCAMBIA2301的结构。

图6：D203Or遗传转化植株(Dongjin遗传背景)T1家系的RAD51C基因与育性共分 离分析。用PCR引物39630-m-F和VectorR检测转基因的受体材料中RAD51C基因中插入了 T-DNA。用PCR引物2301-F和rad51-com-R扩增pCAMBIA2301载体的一部分区段以及 RAD51C的启动子区域的一部分来检测互补片段的导入情况。结实率为3个穗子结实率的平 均值±标准误。对照为粳稻Dongjin。(A)D203Or-52T1家系的结实率和基因型分析。(B) D203Or-55 T1家系的结实率和基因型分析。

图7：野生型(Dongjin)和RAD51C敲除植株的胚囊发育与形成过程。图中标尺为50μM。 (A)野生型植株的胚囊发育与形成过程。在野生型植株中，孢原细胞继续发育形成大孢子 母细胞(箭头所示)；大孢子母细胞进行减数分裂形成四分体(箭头所示)，近珠孔端的三个 大孢子(箭头所示)相继退化，只留下合点端的一个大孢子；胚囊中的功能大孢子(箭头所 示)继续发育形成单核胚囊。之后逐步形成二核(箭头所示)胚囊发育期，四核(箭头所示) 胚囊发育期，八核胚囊发育期[三个箭头所示分别为极核(PN)，反足细胞(AN)和助细胞(SY)]。 在胚囊成熟期，成熟的胚囊中可见极核(PN)，反足细胞(AN)和助细胞(SY)。(B)RAD51C 敲除植株的胚囊发育与形成过程。在RAD51C敲除植株能中，发育形成正常大孢子母细胞(箭 头所示)；在大孢子母细胞减数分裂期，大孢子母细胞减数分裂形成的四分体的核不清晰，而 且四分体的核全部开始降解(不能看到完全的四个核)；在功能大孢子形成期，四个大孢子全 部退化，不能形成功能大孢子；在成熟胚囊中没有形成正常的极核，反足细胞和助细胞，只 有一些降解的核的痕迹。

图8：野生型(Dongjin)和RAD51C敲除植株中花粉母细胞的减数分裂过程。图中标尺 为25μM。(A)野生型植株的花粉母细胞的减数分裂过程。在野生型植株中，进入减数分裂 的细胞在细线期，染色质浓缩为细而长的细线；在偶线期，同源染色体靠近并开始联会；到 粗线期，染色质进一步缩短变粗，同源染色体完成联会，呈较粗的线状结构，染色质进一步 缩短形成双价体；进入双线期，可在染色单体间看到交叉结；到终变期，染色体螺旋化程度 更高，可以清晰的看到12个双价体；随后减数分裂I进入中期I，各个双价体排列在赤道板 上；在后期I，同源染色体彼此分开移向两极；在末期I，同源染色体各自到达两极，细胞质 分裂，形成二分体；二分体中的每个细胞再进行一次分裂，形成四分体，其中在末期II，姐 妹染色单体分开移向两极。(B)RAD51C敲除植株的花粉母细胞的减数分裂过程。在RAD51C 敲除植株中，减数分裂细线期以及偶线期没有明显的异常；在粗线期，同源染色体并没有完 全紧密相贴；在双线期，可以看到明显的染色体片段；在终变期，出现染色体片段，没有形 成明显的12个双价体；在后期I转换期，细胞中有染色体片段，并有染色体桥出现；在后期 II，同样出现染色体片段，最后形成四分体。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，图1描述了鉴定和分离克隆RAD51C基因以及验证 RAD51C基因功能的流程。根据以上的描述和下面的实施例，本领域技术人员可以确定本发 明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修 改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆RAD51C基因和基因结构分析

1.从水稻品种Dongjin中分离克隆RAD51C基因的全长DNA片段

根据水稻全基因组序列数据库[RGAP(Rice Genome Annotation Project  http://rice.plantbiology.msu.edu/)]中提供的RAD51C基因(RGAP数据库位点名： LOC_Os01g39630)的结构设计PCR引物OsRAD51C-F(5′-ATGGAGATCGCCGACCTC-3′)和 OsRAD51C-R(5′-CATTACCCGGACTCGCTTG-3′)，采用反转录-PCR(reverse  transcription-PCR，RT-PCR)技术，从粳稻品种Dongjin(Oryza sativa ssp.japonica)中扩增 RAD51C的全长cDNA。具体操作方法是从Dongjin叶组织中抽提总RNA(Zhou等，2002)。 取1-5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染， 然后参照Zhou等(Zhou等，2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶 (美国Promega公司)进行反转录，获得总cDNA。以总cDNA为模板，用PCR引物 OsRAD51C-F和OsRAD51C-R扩增获得RAD51C基因的cDNA。利用OsRAD51C-F和 OsRAD51C-R引物和上述测序方法对RAD51C基因的cDNA进行测序。比较分析RAD51C基 因的基因组序列和cDNA序列，发现Dongjin中的RAD51C基因cDNA序列与GenBank数据 库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中粳稻品种日本晴的cDNA序列AK060971的对应区段完 全一致。

粳稻Dongjin中的RAD51C基因编码区的基因组片段由4600个核苷酸组成，被插入的8 个内含子分成9段(图2A)。第一段编码区由112个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1 的1-112bp处)；第一个内含子由248个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的113- 360bp处)；第二段编码区由105个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的361-465bp 处)；第二个内含子由283个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的466-748bp处)；第 三段编码区由123个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的749-871bp处)；第三个内 含子由240个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的872-1111bp处)；第四段编码区由 34个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1112-1145bp处)；第四个内含子由70个 核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1146-1215bp处)；第五段编码区由71个核苷酸 组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1216-1286bp处)；第五个内含子由79个核苷酸组成(位 于序列表SEQ ID NO：1的1287-1365bp处)；第六段编码区由227个核苷酸组成(位于序 列表SEQ ID NO：1的1366-1592bp处)，第六个内含子由196个核苷酸组成(位于序列表 SEQ ID NO：1的1593-1788bp处)；第七段编码区由132个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID  NO：1的1789-1920bp处)；第七个内含子由709个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO： 1的1921-2629bp处)；第八段编码区由67个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2630 -2696bp处)；第八个内含子由1728个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2697-4424 bp处)；第九段编码区由176个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的4425-4600bp处)。 序列表SEQ ID NO：1的4601-4603bp处终止密码。

2.RAD51C基因编码产物的分析

RAD51C基因的编码区由1047个核苷酸组成，编码一个长度为349个氨基酸的蛋白质。 根据Lin等(2006)的RecA/RAD51蛋白质家族进化分析，RAD51C属于RADβ亚类，包含 由230个氨基酸组成的RecA/RAD51A结构域；RecA/RAD51结构域包含保守的由 GXXXXGK(T/S)(“X”代表任意氨基酸)组成的Walker A模体和由hhhhDE(“h”代表疏 水氨基酸)组成的Walker B模体(Hanson等，2005)。

实施例2：RAD51C基因T-DNA插入突变体的验证

1.T-DNA插入突变体的获得及验证

利用RAD51C基因的启动子和编码区序列检索水稻突变体数据库RiceGE (http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)，发现这个突变体库中存在一个T-DNA插入的突变体， 其插入位点位于RAD51C基因的第三段编码区中(图2A)；该突变体编号为4D-50016，遗传 转化载体为pGA2772，遗传转化受体水稻品种是Dongjin(Jeong等，2006)。通过商业途径， 我们从这个水稻突变体库购得4D-50016突变体T₁代种子。种子经发芽后，获得5棵突变体 植株。

为了验证所获得突变体的正确性，本发明研究人员根据RAD51C基因的序列设计了一对 位于T-DNA插入位点两侧的RAD51C基因的PCR引物(图2A)：39630-m-F (5′-GCTCCCCAAGAAACTTTTCC-3′)和39630-m-R(5′-CCACTGTTCTTGGCATGTTG-3′)。另 外，根据T-DNA序列设计了PCR引物vectorR(5′-ACCTGTAAGATTTAGCACCC-3′)(Jeong 等，2002)。利用这3条PCR引物分析所获得突变体的T-DNA是否插入在RAD51C基因中。 这一分析的基本原理是：在4D-50016的纯合突变体(一对同源染色体中都有T-DNA的插入) 植株中，由于插入的T-DNA片段大约14kb(Wu等，2003)，利用RAD51C基因的引物 39630-m-F和39630-m-R、采用常规PCR方法无法扩增如此大的DNA片段，而用引物vectorR 和39630-m-R可以扩增出一段大小已知的水稻基因组和T-DNA的杂合DNA片段；在 4D-50016的杂合突变体(一对同源染色体中只有一条染色体中有T-DNA插入)植株中，用 引物39630-m-F和39630-m-R可以扩增一段大小已知的水稻基因组的DNA片段，用引物 vectorR和39630-m-R也可以扩增一段大小已知的水稻基因组和T-DNA的杂合DNA片段； 在4D-50016的阴性(突变体家系中分离出的没有T-DNA插入的)植株中，用引物39630-m-F 和39630-m-R可以扩增一段大小已知的水稻基因组DNA片段，但是用引物vectorR和 39630-m-R不能够扩增DNA片段。对5株4D-50016家系的T₁植株进行了上述PCR分析。 检测结果表明这5株中有4株为杂合植株(4D-50016-2、3、4、5)，1株为阴性植株(4D-50016-1)； 这些4D-50016杂合植株的后代用于其他实施例中的分析。

2.T-DNA插入突变体中RAD51C基因表达量分析

在4D-50016杂合植株的后代(T₂)中筛选纯合突变体株系。用RT-PCR的方法分析RAD51C 基因在突变体中的表达量。采用实施例1中的方法获得总cDNA，PCR分析的引物是 OsRAD51c-rt-f(5′-TATGGTGGACTTGGTGGGAA-3′)和OsRAD51C-rt-r(5′- TCCGGCTGGAGCCTTGT-3′)。用肌动蛋白(actin)基因的表达量作为样品量的参照；肌动 蛋白基因(GenBank注册号：X15865)的PCR引物是Actin-F (5′-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3′)和Actin-R(5′-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3′)。在 4D-50016纯合株系(M)中，没有检测到RAD51C基因的表达，说明这些株系中的RAD51C 基因表达被敲除(图2C)，下文中称4D-50016纯合株系为RAD51C敲除株系。

实施例3：RAD51C敲除植株的表型分析

对RAD51C敲除株系表型进行观察发现，在营养生长期与野生型(Dongjin，对照)没有 明显区别(图3A)。在生殖生长的抽穗期，RAD51C敲除株系与对照在穗型和小花形态方面 也没有明显差别(图3B)。但是野生型花药饱满，而RAD51C敲除植株的花药相对瘦瘪(图 3C)。取抽穗期的花药通过整体染色透明激光扫描共聚焦显微术方法(郭海滨等，2006)观 察，野生型花药中的花粉粒呈正常的圆形，而RAD51C敲除植株的花粉粒干瘪(图3D)。另 外，RAD51C敲除植株不能正常散粉，表现为完全不育，而野生型植株能正常散粉(图3E)。 取花药用1％的碘—碘化钾染色测定法(李自超等，1992)，显微观察显示，与野生型对照相 比，RAD51C敲除植株花药中是败育的花粉(图3F)。

为证实RAD51C敲除植株除了雄性不育外，是否还存在雌性不育。本发明的研究人员用 粳稻Dongjin(野生型对照)和RAD51C敲除(纯合4D-50016突变体)植株进行正反交。同 时用4D-50016突变体家系中分离出的阴性植株与Dongjin杂交作为对照。结果显示(表1)， 无论RAD51C敲除植株是作为父本还是母本，与Dongjin杂交后的杂种都表现为不育，而作 为对照的杂种的结实率为42％-60％。这些结果说明RAD51C敲除植株的雌雄都不育。

表1.Dongjin(野生型)和RAD51C敲除植株正反交杂种的结实率

实施例4：T-DNA与突变性状的共分离验证

由于T₁代单株数少且没有纯合植株，为进一步验证该突变表型与基因型的对应关系，用 从5株T₁单株(图2B)收获的T₂代种子进行共分离检测。每个T₂代家系种植20～40株。

其中4D-50016-1 T₁植株为阴性，其T₂家系全部是阴性植株，这些植株的育性与Dongjin (野生型)无明显差别。4D-50016-2、-3、-4、-5T₁植株都是杂合基因型，其T₂后代中阴性 植株的育性与Dongjin无明显差别，杂合植株大部分育性与Dongjin没有明显差异，而纯合植 株表现为完全不育。

进一步用RAD51C杂合植株为父本与Dongjin杂交，得到的阳性杂交植株再次与Dongjin 回交，得到的阳性BC₁F₁植株自交获得BC₁F₂种子。利用实施例2中涉及的39630-m-F、 39630-m-R和vectorR引物，对BC₁F₂植株的基因型和育性进行分析。图4A中的结果显示， 2、3、6、13、14、16和20号是纯合(即RAD51C敲除)植株，7和8号是阴性植株，其余 12株是杂合植株。对这些BC₁F₂植株的结实率考察发现，所有RAD51C敲除植株都表现为完 全不育，而杂合植株和阴性植株表现为可育(图4A)。采用同样的回交方法，用RAD51C杂 合植株为父本与水稻品种中花11杂交，对BC₁F₂植株的基因型和育性进行分析。图4B的结 果显示，19、22和23号是纯合(即RAD51C敲除)植株，2、3、5、7、8、11、13、16、18 和20株是阴性植株，其余12株是杂合植株。所有RAD51C敲除植株都完全不育，而杂合植 株和阴性植株可育(图4B)。

以上研究结果说明，突变体植株的不育是由于RAD51C基因中插入了T-DNA(基因功能 被敲除)造成的。

实施例5：采用遗传互补实验进一步验证RAD51C基因功能

根据RAD51C基因的序列和网站(http://www.genome.arizona.edu)上的水稻品种日本晴 细菌人工染色体(BAC)文库信息，确认BAC克隆OSJNBa0004A24包含RAD51C基因。从 购买的日本晴BAC文库(Chen等，2002)中获得OSJNBa0004A24克隆质粒，使用限制性内 切酶PstI和SacI完全酶切质粒后，电泳回收包括整个RAD51C基因的8.9kb片段(图2A)， 同时用PstI和SacI酶切后的载体质粒pCAMBIA2301(图5)，它是常用的水稻遗传转化载 体(Chang等，2009)。酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)抽提、纯化酶切产物。用 包含RAD51C基因的酶切片段和纯化好的载体做连接反应，连接产物通过电转化的方法导入 大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，通过酶切和测序验证阳性克隆，获得的重组质粒 被命名为D203O。

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D203O导入RAD51C敲除水 稻材料。获得的遗传转化植株被命名为D203Or。按照相同的遗传转化方法将空载体质粒 pCAMBIA2301导入RAD51C敲除水稻材料，获得的遗传转化植株作为对照，命名为D204Or。

本发明共获得60株独立D203Or遗传转化植株和12株独立D204Or遗传转化植株(对照)。 用上述PCR引物39630-m-R和vectorR以及2301-f(5′-CCAGGCTTTACACTTTATGCTTC-3′) 和rad51-com-R(5′-CGGGTCTCCGACTACTGTGC-3′)扩增检测阳性转化植株。结果显示，在 60株D203Or阳性植株中，48株表现不同程度的育性恢复(表2)；而8株D204Or阳性植株 和4株D204Or阴性植株仍然不育(表2)。进一步对两个D203Or植株的T₁家系(D203Or-52 和D203Or-55)的基因型和育性进行分析。在D203Or-52T₁家系中，第12号为遗传转化阴性 植株，表现为完全不育；其余的22株为遗传转化阳性植株，其育性为29.0％～58.1％(图6A)。 在D203Or-55T₁家系中，第1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、 20和21为遗传转化阳性植株，其育性为35.9％～53.1％(图6B)；而第2、4、18、22、23 为遗传转化阴性植株，表现为完全不育(图6B)。这些结果说明，转入RAD51C基因，可以 使RAD51C敲除植株的不育性状得到恢复，进一步证明RAD51C突变体(4D-50016-1)的突 变性状是由T-DNA插入到RAD51C基因中引起的。

表2.功能互补遗传转化植株(D203Or)和空载体遗传转化植株(D204Or)T₀代育性分析

实施例6：RAD51C敲除植株的胚囊形成和发育过程观察

参照郭海滨等(2006)描述的整体染色透明激光扫描共聚焦显微术方法，本发明研究人 员对照观察了RAD51C敲除植株和对照Dongjin(野生型)植株的胚囊形成和发育过程。在野 生型植株中(图7A)，孢原细胞在靠近珠孔一端的表皮下形成；然后，在大孢子母细胞形成 期，孢原细胞伸长长大形成大孢子母细胞；在大孢子母细胞减数分裂期，大孢子母细胞进行 减数分裂形成四个直线排列的大孢子；在功能大孢子形成期，近珠孔端的三个大孢子相继退 化最后留下合点端的大孢子，即功能大孢子；在单核胚囊形成期，功能大孢子伸长长大，接 着在胚囊有丝分裂期，功能大孢子进行三次有丝分裂，依次形成二核胚囊、四核胚囊和八核 胚囊；在八核胚囊发育期，两边各有一个核移向胚囊中间形成极核；最后在胚囊成熟期，胚 囊增至最大，其中包含反足细胞、极核和助细胞。

在RAD51C敲除植株中(图7B)，在大孢子母细胞形成期，能形成正常的大孢子母细胞； 但是，大孢子母细胞减数分裂形成的四个大孢子最后都会降解而不能形成正常的功能大孢子。 RAD51C敲除植株的胚囊发育受阻，观察不到正常的功能大孢子以后的发育时期，到了成熟 胚囊时期，胚囊中只能看到空的胚囊腔和一些降解的核的痕迹。

实施例7：RAD51C敲除植株的花粉母细胞减数分裂过程的观察

RAD51C敲除植株的胚囊形成和发育过程暗示它们的减数分裂过程不正常。为深入揭示 减数分裂发生异常的时期，利用压片法(卢龙斗等，2007)对照观察了RAD51C敲除植株和 对照Dongjin(野生型)植株花粉母细胞的减数分裂过程。野生型植株中(图8A)，在细线期， 染色质浓缩为细而长的细线；在偶线期，同源染色体靠近并开始联会；到了粗线期，染色质 进一步缩短变粗，同源染色体完成联会，在光学显微镜下呈较粗的线状结构；染色质进一步 缩短形成双价体，双价体的每一染色体含有两条染色单体；进入双线期，可在染色单体间看 到交叉结，交叉结的出现是发生交换的有形结果；到了终变期，染色体螺旋化程度更高，在 光学显微镜下，浓缩期染色体染色非常深；是观察染色体数目的最佳时期；随后从减数分裂 I进入中期I，各个双价体排列在赤道板上；在后期I，双价体中的同源染色体彼此分开移向 两极；在末期I，同源染色体各自到达两极，细胞质分裂，形成二分体；二分体中的每个细胞 再进行一次分裂，形成四分体。至此，减数分裂过程完成。四分体小孢子继续发育形成花粉 粒。

在RAD51C敲除植株中(图8B)，减数分裂前期Ⅰ的细线期时凝缩成细丝状，并在偶线 期时开始联会。在粗线期时RAD51C敲除植株出现明显的异常，此时的染色体也呈现粗线状， 但是凝缩的同源染色体配对不完全，没有形成典型的粗线期。在双线期染色体继续凝缩，出 现明显的染色体片段，并在终变体时期观察不到二价体，取而代之的是不可数的染色体片段； 到了中期I，染色体排列在赤道板上，部分染色体片段没有排列在赤道板上；在后期I，同源 染色体分离，可以看到细胞中许多断裂的染色体片段；在末期I，细胞质中分布有染色体片段； 在末期II，可以看到细胞中许多断裂的染色体片段。

这些结果说明，RAD51C敲除植株不育的最根本原因在于其染色体在减数分裂前期I时 开始出现染色体断裂的片段。敲除RAD51C后，减数分裂过程出现异常导致花粉不育和胚囊 不育。因此，可以采用器官或组织特异特异性启动子抑制RAD51C基因表达的办法创建雄性 不育或者雌雄不育材料，用于杂交水稻的生产，或者用于培育转基因植物的花粉不育材料， 消除转基因植物中外源基因逃逸的风险。

参考文献

郭海滨，卢永根，冯九焕，杨秉耀，刘向东(2006)利用激光扫描共聚焦显微术对同源四倍体 水稻胚囊形成与发育的进一步观察。激光生物学报15：111-117。

李自超，王象坤，库尔班(1993)碘—碘化钾鉴别水稻花粉育性可行性。北京农业大学学报， 9：109-110。

卢龙斗(2007)遗传学实验技术科学出版社，p.7-12。

缪颖，伍炳华，陈德海(2000)植株雄性不育基因工程德研究及应用。亚热带植物通讯 29：55-60.

宋江华，张立新(2008)植物花粉发育的基因工程研究进展。农业生物技术科学24：92-96.

Abdu U，Gonzalez-Reyes A，Ghabrial A，Schupbach T(2003)The Drosophila spn-D gene encodes  a RAD51C-like protein that is required exclusively during meiosis.Genetics 165：197-204.

Bleuyard JY，Gallego ME，Savigny F，White CI(2005)Differing requirements for the Arabidopsis  Rad51 paralogs in meiosis and DNA repair.Plant J.41：53-45.

Bleuyard JY，Gallego ME，White CI(2006)Recent advances in understanding of the DNA  double-strand break repair machinery of plants.DNA Repair(Amst)5：1-12.

Chang Y，Gong L，Yuan W，Li X，Chen G，Li X，Zhang Q，Wu C(2009)Replication protein A  (RPA1a)is required for meiotic and somatic DNA repair but is dispensable for DNA  replication and homologous recombination in rice.Plant Physiol.151：2162-2173.

Chen M，Presting G，Barbazuk W，Goicoechea J，Blackmon B，Fang G，Kim H，Frisch D，Yu Y， Higingbottom S，Phimphilai J，Phimphilai D，Thurmond S，Gaudette B，Li P，Liu J，Hatfield J， Sun S，Farrar K，Henderson C，Bamett L，Costa R，Williams B，Walser S，Atkins M，Hall C， Bancroft I，Salse J，Regad F，Mohapatra T，Singh N，Tyagi A，Soderlund C，Dean R，and Wing  R(2002)An integrated physical and genetic map ofthe rice genome.Plant Cell 14：537-545.

Couteau F，Belzile F，Horlow C，Grandjean O，Vezon D，Doutriaux MP(1999)Random  chromosome segregation without meiotic arrest in both male and female meiocytes of a dmc 1  mutant of Arabidopsis.Plant Cell 11：1623-1634.

Cui X，Brenneman M，Meyne J，Oshimura M，Goodwin EH，Chen DJ(1999)The XRCC2 and XRCC3 repair genes are required for chromosome stability in mammalian cells.Mutat.Res. 434：75-88.

Deans B，Griffin CS，Maconochie M，Thacker J(2000)Xrcc2 is required for genetic stability， embryonic neurogenesis and viabilityin mice.EMBO J.19：6675-6685.

Deng ZY，Wang T.(2007)OsDMC1 is required for homologous pairing in Oryza sativa.Plant Mol. Biol.65：31-42.

Ding ZJ，Wang T，Chong K，Bai SN(2001)Isolation and characterization of OsDMC1，the rice  homologue of the yeast DMC1 gene essential for meiosis.Sexual Plant Reproduct.13：285-288.

Durrant WE，Wang S，Dong X(2007)Arabidopsis SNI1 and RAD51D regulate both gene  transcription and DNA recombination during the defense response.Proc.Natl.Acad.Sci.USA  104：4223-4227.

Godthelp BC，Wiegant WW，van Duijin-Goedhart A，Scha¨rer OD，van Buul PPW，Kanaar R， Zdzienicka MZ(2002)Mammalian Rad51C contributes to DNA cross-link resistance，sister  chromatid cohesion and genomic stability.Nucleic Acids Res.30：2172-2182.

Hanson PI，Whiteheart SW(2005)AAA+proteins：have engine，will work.Nat.Rev.Mol.Cell  Biol.6：519-529.

Jeong DH，An S，Park S，Kang HG，Park GG，Kim SR，Sim J，Kim YO，Kim MK，Kim SR，Kim J， Shin M，Jung M，An G(2006)Generation of a flanking sequence-tag database for  activation-tagging lines in japonicarice.Plant J.45：123-132.

Jeong DH，An S，Kang HG，Moon S，Han JJ，Park S，Lee HS，An K，An G(2002)T-DNA  insertional mutagenesis for activation tagging in rice.Plant Physiol.130：1636-1644.

Lin Z，Kong H，Nei M，Ma H(2006)Origins and evolution of the recA/RAD51 gene family： evidence for ancient gene duplication and endosymbiotic gene transfer.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 103：10328-10333.

Lovett ST(1994)Sequence of the RAD55 gene of Saccharomyces cerevisiae：similar to prokaryotic  RecA and other RecA-like proteins.Gene 142：103-106.

Ma H(2005)Molecular genetic analyses of microsporogenesis and microgametogenesis in  flowering plants.Annu.Rev.Plant Biol.56：393-434.

Mercier R，Armstrong SJ，Horlow C，Jackson NP，Makaroff CA，Vezon D，Pelletier G，Jones GH， Franklin FC(2003)The meiotic protein SWI1 is required for axial element formation and  recombination initiation in Arabidopsis.Development 130：3309-3318.

Mercier R，Grelon M(2008)Meiosis in plants：ten years of gene discovery.Cytogenet.Genome  Res.120：281-290.

Pittman DL，Schimenti JC(2000)Midgestation lethality in mice deficient for the RecA-related gene， Rad51d/Rad51l3.Genesis 26：167-173.

Schwarzacher T(2003)Meiosis，recombination and chromosomes：a review of gene isolation and  fluorescent in situ hybridization data in plants.J.Exp.Bot.54：11-23.

Shinohara A，Ogawa H，T Ogawa(1992)Rad51 protein involved in recombination and repair in S. cerevisiae is a RecA-like protein.Cell 69：457-470.

Sonoda E，Takata M，Yamashita YM，Morrison C，Takeda S(2001)Homologous DNA  recombination in vertebrate cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：8388-8394.

Shu Z，Smith S，Wang L，Rice MC，Kmiec EB(1999)Disruption of muREC2/RAD51L1 in mice  results in early embryonic lethality which can be partially rescued in a p53(2/2)background. Mol.Cell Biol.19：8686-8693.

Wu C，Li X，Yuan W，Chen G，Kilian A，Li J，Xu C，Li X，Zhou DX，Wang S，Zhang Q(2003) Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.Plant J. 35：418-427.

Zhou B，Peng K，Chu Z，Wang S，Zhang Q(2002)The defense-responsive genes showing enhanced  and repressed expression after pathogen infection in rice(Oryza sativa L.).Sci.China Ser.C  45：449-467.