一种高富硒钝顶螺旋藻的培养及其检测方法

摘要

本发明公开了一种高富硒钝顶螺旋藻的培养及其检测方法，本发明在温度20～25℃、pH8～10、光照强度2000～2500lx、每天24h光照中培养，采用Zarrouk培养液，放在三角培养瓶中培养，接种密度为OD560=0.25～0.35，分次添加Na2SeO3至总硒量达270-300mg/L，待OD560为1.2～1.5时收集藻体，冷冻干燥，制得高富硒钝顶螺旋藻。本发明方法培养条件易于控制，而且螺旋藻繁殖快，生长周期短，成本低，总硒含量可达2.0mg-2.5mg/g，有机硒含量达68-80%，且必须氨基酸含量及免疫力均有较大提高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用于保健食品、医药领域的高富硒钝顶螺旋藻的培养及其方法。

背景技术

螺旋藻是至今为止发现的营养最丰富、最全面的绿色食品，尤其蛋白质含量较高，氨基酸平衡，还含有丰富的必需脂肪酸(如r一亚麻酸等)，其中藻蓝蛋白是螺旋藻含量最高的生物活性物质之一，可达藻体质量的20％左右，具有良好的抗氧化、抗肿瘤等作用。

硒是人体必需的微量元素之一, 其生理功能主要表现为硒蛋白和硒酶的抗氧化作用。我国通过人群补硒成功防治了多种疾病, 如克山病、大骨节病、心血管病、肝病及肿瘤等。利用生物转化途径生产具有较高生物活性的有机硒可避免无机硒的毒性, 并可协同天然活性分子的功能。因此, 利用生物体富集有机硒的研究受到广泛关注。而螺旋藻（Spirulina）易于大规模培养，作为硒生物有机化的载体前景将十分广阔。

何晓燕报道当亚硒酸钠浓度小于100mg/L时, 对藻体生长有一定的促进作用, 其生物量、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量有增加, 藻体硒含量及富硒系数有所增高。黄峙等也研究了加硒方式对藻体富硒的影响，在温度33～35℃，光照强度4000lx,光照时间24h,分步加硒，而且当亚硒酸钠为300mg/L时，得到总硒含量为0.46mg/g的螺旋藻体。同时研究表明不同种类的螺旋藻在不同的培养条件下具有不同的富硒能力。

而市场上有机硒的来源有限，目前已经开发比较成熟的是富硒量较高的富硒酵母，陈福生等研究表明富硒酵母中中总硒含量为1.895mg/g,但酵母本身营养价值较低，而螺旋藻本身极具营养价值且对无机硒的耐受能力较强，而富硒大米，富硒茶有报道含硒量为20-300μg/kg.同时市场上保健品如灵芝孢子分价格比较昂贵，因此迫切需要开发出低成本，高营养价值、高免疫力的高富硒的螺旋藻保健品。

鉴于以上研究，本发明探索了易于操作、成本低廉并且富硒量及有机硒含量较高的富硒螺旋藻培养及其检测方法。

发明内容  

    本发明的目的是获得高富硒的螺旋藻培养及其检测方法，以便开发出营养价值高、免疫力强的高有机硒的螺旋藻保健品，进一步提高使用者的免疫力。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：

一种高富硒钝顶螺旋藻的培养方法，其特征在于在温度20～25℃、pH 8～10、光照强度2000～2500 lx、每天24h光照中培养，采用Zarrouk培养液，放在三角培养瓶中培养，接种密度为OD₅₆₀ = 0.25～0.35，分次添加Na₂SeO₃至总硒量达270-300mg/L，待OD₅₆₀为1.2～1.5时收集藻体，冷冻干燥，制得高富硒钝顶螺旋藻。

高富硒钝顶螺旋藻的培养方法，包括以下步骤：将钝顶螺旋藻放在250ml的三角培养瓶中，采用Zarrouk培养液，在温度20～25℃、pH 8～10、最佳光照强度2000-2500lx、每天24h光照中培养，接种密度为OD₅₆₀ = 0.25～0.35，接种体积150ml,然后放在光照培养箱中，当OD₅₆₀为0.7～0.8时第一次加Na₂SeO₃ 13.5mg-15mg,当藻液OD₅₆₀为0.8-0.9时第二次添加Na₂SeO₃ 13.5mg-15mg，当藻液OD₅₆₀为0.9-1.0时第三次添加Na₂SeO₃13.5mg-15mg继续培养，待OD₅₆₀为1.2-1.5时收集钝顶螺旋藻，培养周期为11-13d，用蒸馏水洗2-3次钝顶螺旋藻，冷冻干燥后制得高富硒钝顶螺旋藻。

高富硒钝顶螺旋藻的检测方法，包括以下步骤：用原子荧光光谱法检测总硒及有机硒的含量；

（1）总硒测定：

取0.5g富硒螺旋藻，加9-11ml消化液摇匀后，所述的消化液为浓硝酸：高次氯酸=4:1配置得到，放置过夜，置于电热板上加热至有机物分解或色泽加深，补加1～3ml消化液继续消化，控制温度低于200℃，如此反复至消化液澄清，有HClO₄白烟冒出，继续加热至溶液1～3ml，用60%浓HCL定容在25ml容量瓶中，然后加0.5%NaBH₄至反应终点，用AFS-3100型双道原子荧光光度计测量总硒含量；

（2）无机硒的测定：

     取0.5g富硒螺旋藻，加10ml～20ml的蒸馏水，置于加热板上加热沸腾20min～30min，冷却离心，保存上清液，残渣再重复一次操作，合并上清液，上清液进行和总硒测定同样的方法消化测定，按4:1加消化液摇匀后，放置过夜，置于电热板上加热至有机物分解或色泽加深，补加1-2ml消化液继续消化，控制温度低于200℃，如此反复至消化液澄清，有HClO₄白烟冒出，继续加热至溶液1-2ml，用60%浓HCL定容在25ml容量瓶中，然后加0.5%NaBH₄至反应终点，用AFS-3100型双道原子荧光光度计测量无机硒含量，然后总硒减去无机硒即是有机硒。

（3）硒及氨基酸相对含量检测方法：

将0.2g藻粉放在共振盘上，通过手握传感器测定样品的微磁场的频率和能量，经仪器放大，计算机处理后和设与仪器内部的营养指标的标准“量子共振谱”比较，输出相应的由负到正的相对量价值。

本发明的有益效果：

（1）富硒螺旋藻中总硒及有机硒测定结果：在本发明条件下培养钝顶螺旋藻，添加亚硒酸钠累计270mg～300mg/L,每次按技术路线测富硒螺旋藻的总硒和有机硒含量，重复3次，结果表明总硒含量2mg/g～2.5mg/g,有机硒占总硒的比例为68%～80%。

（2）硒、必需氨基酸、免疫功能相对含量比较结果：量子共振法检测结果显示：培养得到的富硒螺旋藻比普通螺旋藻及灵芝孢子粉硒含量显著提高，且富硒培养后八种必需氨基酸的含量比着普通螺旋藻中的含量也明显提高，同时相对灵芝孢子粉中必需氨基酸含量而言，富硒螺旋藻中这些氨基酸的含量显著增高，而且富硒螺旋藻的免疫能力远远高于普通螺旋藻和灵芝孢子粉的免疫能力。这表明富硒培养不仅能够提高总硒及有机硒的含量，也可以使必需氨基酸、免疫能力得到提高。

表1  富硒螺旋藻中总硒及有机硒测定结果；表2  硒、必需氨基酸、免疫功能相对含量比较图。

表1：

重复次数  总硒（mg/g）有机硒（mg/g）有机硒/总硒(%) 第一次2.2～2.6  1.32～1.95  60～75 第二次2.0～2.4  1.36～1.92  68～80 第三次1.8～2.5  1.36～2.12  76～85  平均2.0～2.5  1.34 ～ 1.99  68～80

表2：

检测项目螺旋藻富硒螺旋藻灵芝孢子粉丙氨酸+3+5+4蛋氨酸+3+5+4赖氨酸+3+4+3亮白氨酸+2+5+4异亮氨酸+3+5+3缬氨酸+3+5+4苏氨酸+3+5+3色氨酸+3+4+3硒+3+7+3免疫功能+8+11+7

附图说明

　  图1  螺旋藻富硒技术线路示意图。

具体实施方式

实施例1：高富硒钝顶螺旋藻的培养方法：钝顶螺旋藻是在温度25℃、pH 8、最佳光照强度2500 lx、每天24h光照，采用Zarrouk培养液，放在250ml的三角培养瓶中，接种密度为OD₅₆₀ = 0.35，接种体积150ml,放在光照培养箱中，当OD₅₆₀为0.7时第一次加亚硒酸钠13.5mg,当藻液OD₅₆₀为0.8时第二次添加Na₂SeO₃15mg，当藻液OD₅₆₀为0.9时第三次添加Na₂SeO₃15mg继续培养，待OD₅₆₀为1.2时收集富硒螺旋藻，培养周期为11d,用蒸馏水洗3次螺旋藻， 冷冻干燥，制得富硒螺旋藻粉。

实施例2：高富硒钝顶螺旋藻的培养方法：钝顶螺旋藻是在温度20℃、pH 10、最佳光照强度2000 lx、每天24h光照，采用Zarrouk培养液，放在250ml的三角培养瓶中，接种密度为OD₅₆₀ = 0.25，接种体积150ml,放在光照培养箱中，当OD₅₆₀为0.8时第一次加Na₂SeO₃13.5mg,当藻液OD₅₆₀为0.9时第二次添加Na₂SeO₃13.5mg，当藻液OD₅₆₀为1.0时第三次添加Na₂SeO₃15mg继续培养，待OD₅₆₀为1.5时收集富硒螺旋藻，培养周期为13d,用蒸馏水洗3次螺旋藻， 冷冻干燥，制得富硒螺旋藻粉。

实施例3：高富硒钝顶螺旋藻的总硒检测方法：取0.5g富硒螺旋藻，加消化液（浓硝酸：高次氯酸=4:1）摇匀后，放置过夜，置于电热板上加热至有机物分解或色泽加深，补加1ml消化液继续消化，控制温度低于200度，如此反复至消化液澄清，有HClO₄白烟冒出，继续加热至溶液1ml，用60%浓HCL定容在25ml容量瓶中，然后加0.5%NaBH₄，原子吸收法测量总硒含量。

高富硒钝顶螺旋藻的有机硒检测方法：取0.5g富硒螺旋藻，加10ml的蒸馏水，置于加热板上加热沸腾20min.冷却离心，保存上清液，残渣再重复一次操作，合并上清液，上清液进行和总硒测定同样的方法消化测定，按比例加消化液摇匀后，放置过夜，置于电热板上加热至有机物分解或色泽加深，补加1ml消化液继续消化，控制温度低于200度，如此反复至消化液澄清，有HClO₄白烟冒出，继续加热至溶液2ml，用60%浓HCL定容在25ml容量瓶中，然后加0.5%NaBH₄，得到无机硒，然后总硒减去无机硒即是有机硒。

实施例4：高富硒钝顶螺旋藻的总硒检测方法：取0.5g富硒螺旋藻，加消化液（浓硝酸：高次氯酸=4:1）摇匀后，放置过夜，置于电热板上加热至有机物分解或色泽加深，补加2ml消化液继续消化，控制温度低于200度，如此反复至消化液澄清，有HClO₄白烟冒出，继续加热至溶液2ml，用60%浓HCL定容在25ml容量瓶中，然后加0.5%NaBH₄，用AFS-3100型双道原子荧光光度计测量总硒含量。

高富硒钝顶螺旋藻的有机硒检测方法：取0.5g富硒螺旋藻，加20ml的蒸馏水，置于加热板上加热沸腾30min.冷却离心，保存上清液，残渣再重复一次操作，合并上清液，上清液进行和总硒测定同样的方法消化测定，按比例加消化液摇匀后，放置过夜，置于电热板上加热至有机物分解或色泽加深，补加2ml消化液继续消化，控制温度低于200度，如此反复至消化液澄清，有HClO₄白烟冒出，继续加热至溶液2ml，用60%浓HCL定容在25ml容量瓶中，然后加0.5%NaBH₄，用AFS-3100型双道原子荧光光度计测量无机硒含量，然后总硒减去无机硒即是有机硒。