法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-03-19
授权
授权
2013-02-20
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20120929
实质审查的生效
2013-01-02
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种用于鉴别卵巢癌易感性的分子标记、试剂盒及其鉴别方法,具体地涉及 GADD45A基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)及其与卵巢癌的 相关性,及鉴别这些SNP的方法和试剂盒,属于分子生物学和医学领域。
背景技术
卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤,2008年全球新发病例225500人,死亡140200 人。由于起病隐匿,症状不明显,多数患者发现时已届晚期,晚期卵巢癌患者5年生存率仅 为30~45%左右,预后差,而早期卵巢癌患者5年生存率高达90%,这提示我们提高卵巢癌 患者预后和生存的关键是早诊、早治,因此探讨卵巢癌发生发展的生物学机制,寻找鉴定卵 巢癌易感人群的分子标记,卵巢癌患者分子分型和预后预测的分子标记,对于高危人群或易 感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。
现有技术中,虽然已经有超过200个候选基因和20个遗传区域的1100个遗传变异与卵 巢癌易感性相关,但是与卵巢癌相关性很强的遗传变异却很少。并且没有GADD45A基因与卵 巢癌相关性的报道,更没有GADD45A基因SNP与卵巢癌相关性的报道。因此,本领域急需进 一步寻找卵巢癌易感基因,开发检测卵巢癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒,以及相关 的治疗药物。
发明内容
针对上述现有技术,本申请的发明人经过深入而广泛的研究,对大量候选基因的SNP进 行了测定和分析,首次发现GADD45A和卵巢癌易感性密切相关,可作为卵巢癌易感性检测或 者早期诊断的分子标记,因此,本发明提供了一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒及其方法, 以及体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种用于鉴别卵巢癌易感性的分子标记,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其与正常 的GADD45A基因相比,区别在于:第1481位存在一个单核苷酸多态性:G>A,即第1481位 的碱基包括碱基G和碱基A两种情形,当为碱基G时,为正常的GADD45A基因,当为碱基A 时,为突变的GADD45A基因:
cagtggctgg taggcagtgg ctgggaggca gcggcccaat tagtgtcgtg cggcccgtgg 60
cgaggcgagg tccggggagc gagcgagcaa gcaaggcggg aggggtggcc ggagctgcgg 120
cggctggcac aggaggagga gcccgggcgg gcgaggggcg gccggagagc gccagggcct 180
gagctgccgg agcggcgcct gtgagtgagt gcagaaagca ggcgcccgcg cgctagccgt 240
ggcaggagca gcccgcacgc cgcgctctct ccctgggcga cctgcagttt gcaatatgac 300
tttggaggaa ttctcggctg gagagcagaa gaccgaaagg tgagtcggcc tgcggactct 360
tccggcccga acttctctta cctaccccgc gctccccggt gcagccgggc tgtggaaggc 420
ttgcagggga ggaagctaaa aagtttgcac agggcaactc ccgcccttgc tccctcggga 480
ctctccgtgg agctcccacg gactgaaaga gcgtgccccc caacccgaac gagccccgcc 540
ggggcctttg caaagggcag cagtggccgt cgctgcccgt gcggctcccg tggctggcag 600
cctgtggcag gggcactctc gggacttctc acgggacgcc cggtccttgg gcgtgcaggg 660
gtcatggggg gtgacggggc cgcgggagcg ccgggttttc gtagagccca ggtgcgcggt 720
ggtgcttgca ttcgagaggg aggggcgtgg taccggacga ggggggcggc gatggccccg 780
agggcaccgg ggctgacggg acccctcgcc cttgcccgcg tgtaggatgg ataaggtggg 840
ggatgccctg gaggaagtgc tcagcaaagc cctgagtcag cgcacgatca ctgtcggggt 900
gtacgaagcg gccaagctgc tcaacgtgta agtggggccc ttgcgcgtcc cccatggcac 960
cccttcccgc cccagcccgg gaggtcgcct tggctgggcg cccctcgccc ggccgcgcca 1020
cttcctgtcg cttttctgcc tgtctcggaa gggagggggc gagcgggccg ggcggcgacc 1080
cccagggacc cgggcagggg ttgagggcgc ccgcgcttct gcgctcactg gccccgcccg 1140
ctgcccccag cgaccccgat aacgtggtgt tgtgcctgct ggcggcggac gaggacgacg 1200
acagagatgt ggctctgcag atccacttca ccctgatcca ggcgttttgc tgcgagaacg 1260
acatcaacat cctgcgcgtc agcaacccgg gccggctggc ggagctcctg ctcttggaga 1320
ccgacgctgg ccccgcggcg agcgagggcg ccgagcagcc cccggacctg cactgcgtgc 1380
tggtgacggt aagggactgg gggactgcag cctgcagggt agagccccgg aaggacggga 1440
gtcagggctg ggttgcctga ttgtggatct gtggtaggtg rgggtcagga gggtggctgc 1500
1481
ctttgtccga ctagagtgtg gctggacttt cagccgagat gtgctagttt catcaccagg 1560
attttctgtg gtacagaaca tgtctaagca tgctggggac tgccagcagc ggaagagatc 1620
cctgtgagtc agcagtcagc ccagctactc cctacctaca tctgcactgc ctcccgtgac 1680
taattccttt agcagggcag attagataaa gccaaatgaa ttcctggctc acccctcatt 1740
aaggagtcag cttcattctc tgccagtcag agctaaaaat agaaattgtg taggagacaa 1800
accttgttaa ttccctagaa atacattaag aggatagagt ggaatttttt ttctctgcaa 1860
tcttgcattt ttttaatggc tctttttttt tttcctgata aaaacctttg gtaggtaggg 1920
aagttatgtt ttcaggggta aatgtgctac ttttgtcttc taaattttgc tcttttttga 1980
ctggtctagt caagtgacag cccgattatt ttgctactcc ttaaaagtac tattctgtct 2040
cttggagtat ggttgatggc aattccagtt aactgctgtg cagctctcat ctcattgtgc 2100
acacagcatg gaaatctttc tcaaaactgt ttcactcagg tcagggtaac aagtttggta 2160
gagcaaaccg gtgaatgata ctctcatgca aaactgaaca gatatgcaaa catatgtatg 2220
tggttcagct tgggttgcat gggttcagac tttgcaatgt gtagtttaat aggtaattac 2280
ccttaacgct tttgcaggga acccaactac cttgaagaaa ctttaatttt tttgtgcttc 2340
taatttgtct ccatgtcaca tagccaaaat atagaatgtt caagtgtttt ctcctcaaaa 2400
gtataattac tagaatatac tggtttttaa aataagttta tttttataaa tttgtttcca 2460
g 2461
一种用于鉴别卵巢癌易感性的试剂盒,包括特异性引物,该引物为一对,具有SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3的序列,能够特异性的扩增GADD45A基因的引物,能特异性地扩增出长度 200~2700bp。
进一步地,试剂盒还包括PCR反应液,PCR反应液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer组成。 PCR反应液中各组分的用量关系为常规的,对所属领域技术人员而言是公知常识。
一种体外鉴别样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法,步骤如下:
(1)用GADD45A基因特异性引物扩增样品的GADD45A基因,得到扩增产物;所述引物为 一对,具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列;
(2)对扩增产物进行序列测定,检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性:1481G>A; 1481G>A突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。
一种对个体的卵巢癌易感性或患病风险进行鉴别、检测或诊断的方法,步骤如下:
检测该个体的GADD45A基因、转录本和/或蛋白,并与正常的GADD45A基因、转录本和/ 或蛋白进行比较,存在差异就表明该个体患卵巢癌的可能性低于正常人群。所述差异是指是 否存在单核苷酸多态性:1481G>A;1481G>A突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。
本发明的用于鉴别卵巢癌易感性的分子标记、试剂盒及其方法,以及体外鉴别样品是否 存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法,检测简单、准确、快速,特异性强,对于高危 人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 GADD45A基因突变的检测及与卵巢癌的关联分析
1.1研究对象
选取卵巢癌患者139例,2008年9月~2011年4月于山东大学齐鲁医院确诊治疗,临床 资料从病历获得。年龄匹配的对照病人189例,为齐鲁医院健康体检中心健康查体妇女。大 部分受试者均为山东省内汉族居民。取受试人员外周血1.5ml,于-80℃冷藏保存。所有受 试人员均按照山东大学齐鲁医院伦理委员会要求征得同意。
1.2DNA提取
用常规酚氯仿法提取受试者外周血DNA,具体如下:
(1)取400ul血加于1.5ml离心管中。
(2)加入800ul PBS,混匀,3500g,15min,弃上清;重复一遍。
(3)加入400ul裂解液,37℃,1h。
(4)加入蛋白酶K 4ul,浓度200ug/ml。
(5)55℃水浴消化过夜(4-12h)。
(6)加入400ul的Tris饱和酚,混合摇动10min。
(7)5000g,15min,取水相。
(8)加入100ul NaAc,800ul无水乙醇,-20℃,20min。
(9)12000g,5min,弃上清。
(10)600ul 70%冰乙醇,12000g,5min,弃上清,重复一次。
(11)12000rpm离心,10分钟。弃上清,晾干。溶于100μl TE。
(12)测定浓度和纯度,分装,冻存于-80℃。
1.3引物、PCR扩增和测序
从GenBank下载GADD45A基因组序列(GenBank序列;AY135686.1;GI:22122007), 用primer premier5.0设计引物。具体引物详细信息见表1。
表1 引物序列表
PCR扩增条件:94℃ 3分钟,(94℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃ 40秒)×35,72℃ 7分钟,10℃保温。PCR扩增产物为1255bp。
PCR扩增产物送交上海博尚生物技术公司测序,测序结果应用软件Meglign 7.0和 Chromas 2.33进行检验和分析,本实施采用了反向测序,经分析,发现存在以下SNP:1481G>A。
1.4SNP分型和关联分析
应用卡方(X2)检验对受试人员位点的分布进行统计分析;当一个单元格的期望个数少 于5个时应用Fisher精确检验进行分析。所有P值均为双侧概率,当P<0.05时认为有显著 统计学意义。应用无条件逻辑回归分析对基因型频率、等位基因频率和卵巢癌患病之间的相 关性进行评估,计算其比值比(Odds ratio,OR)和95%可信区间(confidence interval, CI),并应用SPSS17.0软件(SPSS Inc.Chicago,Illinois,USA)进行统计分析。
结果发现SEQ ID NO:1中的rs2759219(1481G>A)位点与卵巢癌发病显著相关,其中加 性遗传模型(G/G vs.G/A vs A/A)的P值为0.0001。显性遗传模型(G/G+G/A vs A/A) 的P值为0.000024(OR=1.284,95%CI[1.132~1.456])。隐性遗传模型(G/G vs G/A+A/A, P=0.032)的P值为0.032(OR=1.431,95%CI[1.023~2.001]),A等位基因为易感性等位 基因(P=0.0001,OR=1.845,95%CI[1.353~2.516])。详细结果见表2。
表2 1481G>A位点基因型及等位基因在卵巢癌组和健康对照组中的分布
实施例2 卵巢癌易感性检测试剂盒
由于SEQ ID NO:1中1481G>A的突变与卵巢癌发表高度相关,因此可基于这个突变设计 GADD45A基因特异性引物再以病人的DNA为模板进行扩展检测。
制备一试剂盒(100人次),它含有如表3所示的物质:
表3
抽取受试者外周血2ml,常规方法提取DNA。利用卵巢癌易感性检测试剂盒进行PCR反应, 将反应产物进行测序,将测序结果利用Meglign 7.0和Chromas 2.33软件进行检验和分析。 检测结果含有rs2759219(1481G>A)的受试者卵巢癌易感性低于正常人群。
应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域的技术人员可以对本发明做各种修改 或改动,但这些改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。
机译: 用于鉴别癌的组织类型,鉴别试剂盒和鉴别方法的鸡尾酒抗体
机译: 用于基因扩增的引物,使用其的核酸鉴别方法以及核酸鉴别试剂盒
机译: 辐射能鉴别方法及用于该方法的鉴别试剂盒