一种耐重金属的根瘤菌及其促进尾矿区植物修复的方法

摘要

本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种耐重金属的植物内生根瘤菌及其应用。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年9月18日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2012357。该菌株液体制剂含有有效活菌数为10亿个以上/毫升，固体制剂含有效活菌数2亿个以上/克。该菌株能够分泌植物激素IAA和铁载体，耐受重金属铜和镉。在含重金属的湿润土壤或尾砂中种植植物，接种生物修复制剂，促进植物生长及其对重金属铜的吸收固定，提高植物修复效率，可以固定砂土，减少水土流失。

说明书

技术领域

本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种耐重金属的根瘤菌及其促进尾矿区植 物生长的方法。

背景技术

采矿、冶炼过程带来了生态景观遭破坏、土壤结构变差、养分水分缺乏、生物多样性锐减， 产生的废弃物（尾矿砂、矿石等）需要大面积的堆置场地，废弃地植被不能及时恢复，严重的 水土流失和重金属污染等诸多生态环境问题，从而导致矿区土地生态系统的严重破坏。据报道， 20世纪90年代以来，我国矿山废弃地生态恢复率仅8.75％。因此，加强矿业废弃地的治理和 植被恢复已成为我国当前所面临的紧迫任务之一。

尾矿区，多尾砂，常为凹凸不平、不规则的沙堆，粘性差、透水性强、抗蚀性小、保水保 肥力差，植物生长必需有机质和氮磷钾营养成分含量均相对较低，不利于植物的生长。植物促 生细菌是植物在漫长的进化过程中获得的有益的微生物类群，对植物抵抗外界不良环境具有重 要作用。国内外科研人员已开始将植物促生细菌用于废弃地和污染场地的植被重建。Bashan 等发现接种Azospirillum brasilense后，移植到城市废弃地的三种仙人掌生长加快。Wei等发现 与豆科植物内共生的根瘤菌属（Rhizobium）的一些菌种能够产生植物激素促进大豆生长，并 且提高了大豆对重金属的吸收。Petrisor等和Wu等已开始探索将PGPB应用在尾矿植物稳定方 面。因此，利用植物促生细菌来提高植物修复效率，防治矿区废弃地风蚀及水蚀造成的水土流 失及重金属污染，将是一种行之有效、环境友好的修复手段。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种耐重金属的根瘤菌。

本发明的另一目的是提供含有该细菌的生物修复制剂。

本发明的又一目的是提供该细菌和生物修复制剂的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种植物内生细菌W33，分类命名为Rhizobium sp.W33，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏日期为2012年9月18日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2012357。该植物内生细菌 W33是从中国江苏省南京市龙山生长的千金子(Leptochloa chinensis(Linn.)Nees)根际土壤中分 离得到，经鉴定为Rhizobium sp.。主要生物学特性为：G^-，幼龄时菌体为杆状，无芽孢。在YMA 培养基上生长良好，单个菌落圆形，边缘整齐，直径1～3mm，白色，不透明。能够利用葡萄 糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、山梨醇等，不能利用淀粉、明胶等。

一种含有所述的保藏号为CCTCC NO：M 2012357的植物内生细菌W33的生物修复制剂。

所述的生物修复制剂优选为液体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO：M 2012357的W33 菌株有效活菌数为10亿个/毫升以上。

所述的液体制剂是通过常规的液体深层发酵方法发酵W33菌株制备得到。

所述的生物修复制剂还可优选为固体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO：M 2012357的 W33菌株有效活菌数为2亿个/克以上。

所述的固体制剂是使用草炭、泥炭或其他载体吸附保藏号为CCTCC NO：M 2012357的W33 菌株发酵液配制成颗粒剂或粉剂。

本发明所述的保藏号为CCTCC NO：M 2012357的W33菌株在尾矿区植物修复中的应用。

本发明所述的保藏号为CCTCC NO：M 2012357的W33菌株在重金属污染土壤的植物修复 中的应用。

本发明所述的W33菌株的生物修复制剂在尾矿区或重金属污染土壤的植物修复中的应 用。

一种所述的含W33菌株的生物修复制剂用于土壤重金属污染的植物修复方法：在含重金 属的湿润土壤或尾矿区中播种植物种子，接种W33菌株生物修复制剂，每亩接种10⁸个细菌/mL 的生物修复制剂4-6kg，分1－2次接种。

有益效果

本发明所述的植物内生细菌W33菌株能耐受多种重金属（Cu、Pb、Cd的最小抑制浓度分 别为0.8、3.6、0.4mM）。

本发明所述的植物促生细菌及其强化植物土壤重金属污染修复的方法与现有技术相比有 如下优点：

（1）本发明所述的W33菌株能产生吲哚乙酸，IAA最高产量可达16mg·L^-1；具有溶磷特性， 有助于促进植物生长。高产铁载体，有助于提高植物抗逆性（抗旱、抗涝、抗盐碱、抗 病虫害）。

（2）利用植物促生细菌促进植物生长，提高植物重金属Cu含量，强化植物提取修复效率。

（3）可以固定砂土，减少水土流失。

生物样品保藏信息

植物促生细菌W33，分类命名为Rhizobium sp.W33，保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年9月18日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2012357。

具体实施方式

实施例1

本发明耐重金属的植物促生细菌W33菌株从南京龙山的千金子(Leptochloa chinensis (Linn.)Nees)根际土壤中分离纯化得到，分离鉴定方法如下：

用无菌镊子采取紧密附着在根系表面2mm左右土壤的根际土壤，称重10g，置于盛有90 ml无菌水的三角瓶中，充分振荡30min，静置10min，取0.1ml悬液，采用10倍系列稀释法， 涂布于含0.004％刚果红的YMA平板（蔗糖10.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.1g， CaCO₃ 3.0g，酵母膏5g，水1000mL，琼脂20g），28℃培养3d，挑取单菌落在YMA平板上 划线纯化后保存。将菌株接种于不加CaCO₃的YMA培养液中，28℃振荡培养18h，取1.5mL 菌液于Eppendorf离心管中，5000rpm离心5min收集菌体，按常规方法提取细菌总DNA，PCR 扩增细菌16S rDNA，扩增产物经测序后与GenBank中已知16S rDNA序列进行比对分析，与 Rhizobium lusitanum的16S rDNA序列相似性达到99.5％，将其鉴定为这个属。

实施例2

将W33（CCTCC NO：M 2012357）划线接种于含不同重金属浓度的YMA培养基，30℃培 养3d，观察其能否生长及生长情况。结果见表1。W33菌株能耐受多种重金属（Cu、Pb、Cd 的最小抑制浓度分别为0.8、3.6、0.4mM）。

表1菌株在含不同重金属浓度的YMA培养基上的生长情况

上表中“+”表示生长，“-”表示不生长。

实施例3

根据王平等的方法测定铁载体。将W33（CCTCC NO：M 2012357）接种于YMA液体培养 基中，30℃150rpm振荡培养48h。发酵液12000rpm离心5min，取上清液与等体积CAS检 测液充分混匀，显色1h后测定630nm波长处的吸光值(A)，以去离子水作对照调零。另以 等体积无菌YMA液体培养基与CAS检测液充分混匀的处理，同法测定吸光值即为参比值 (Ar)。A/Ar值<1，可被认为高产铁载体。结果表明W33（CCTCC NO：M 2012357）发酵液的 A/Ar为0.4，高产铁载体。

实施例4

根据Gordon和Weber(1951)的测定方法，用试管分装YMA液体培养基，每管4mL，121℃ 高温灭菌后加入过滤除菌的2.5mg/mL色氨酸溶液1mL，使培养基中色氨酸的终浓度为0.5 mg/mL。将W33（CCTCC NO：M 2012357）接种于上述培养基中，30℃摇床振荡培养3d。发 酵液于12000r/min离心5min，取上清液1mL，加入10mM的正磷酸50μL，再加2mL Sackowski's显色剂，充分混合，黑暗下25℃显色30min，于530nm波长下测定吸光值。无菌 培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、5、10、20、40、60mg/L的IAA标准液 同法作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度。结果表明W33（CCTCC NO：M 2012357）能产生 吲哚乙酸，IAA最高产量可达16mg/L。

实施例5菌株W33溶解磷酸三钙的能力

用接种环沾取YMA培养液中培养18-24h所得的W33（CCTCC NO：M 2012357）菌液，在 无机磷培养基(葡萄糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂ 5.0g，H₂O 1000ml，pH 7.0-7.5，115℃灭菌30min)上划线， 培养5d后，观察菌落周围有无透明溶磷圈。测定溶磷圈直径与菌落直径的比值。结果表明， 菌株W33（CCTCC NO：M 2012357）在无机磷培养基生长良好，菌落周围产生透明圈，能够溶 解培养基中Ca₃(PO₄)₂沉淀，溶磷圈直径与菌落直径的比值为1.6±0.2。

实施例6液体制剂

将YMA固体培养基培养48h所得的W33（CCTCC NO：M 2012357）斜面菌种接种于YMA 培养基（蔗糖10.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.1g，CaCO₃ 3.0g，酵母膏5g， 水1000mL，水1000mL，pH7.0-7.5）中，培养24小时后接入种子罐。种子罐为0.5吨，种子 罐培养基成分为蔗糖3.0kg，淀粉0.6kg，(NH₄)₂SO₄ 1.5kg，K₂HPO₄ 0.3kg，MgSO₄ 0.18kg，NaCl 0.07kg，CaCO₃ 0.4kg，酵母膏0.2kg，水0.3吨，淀粉酶5400U，大豆油50mL。种子罐须先 用蒸汽灭菌并冷却至28-30℃，接种量为体积比5％（以培养基体积为基准），种子罐培养温度 控制在28-32℃，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8，培养20小时后将种子液全 部接入生产罐。生产罐为7吨，投料量约为4.5吨，培养基成分为蔗糖40kg，淀粉8kg，(NH₄)₂SO₄15kg，KH₂PO₄ 4.0kg，MgSO₄ 2.4kg，NaCl 0.9kg，CaCO₃ 4kg，酵母膏2kg，水4.0吨，淀粉酶 64000U，大豆油400mL。生产罐预先用蒸汽灭菌并冷却至28-30℃，培养温度控制在28-32℃， 搅拌速度为200转/分，无菌空气通入量为1∶0.8。培养结束后培养液中菌体数量达到10亿/ml 以上。培养液即可灌装为生物修复制剂。

本实施例只是一种建议的生物修复制剂制备方法，实际上本发明生物修复制剂可通过常规 的Rhizobium sp.属微生物发酵培养方法制备得到，只要培养液中菌体数量达到10亿/ml以上即 可。

实施例7粉剂

将实施例6所得的培养液用草炭吸附，培养液与草炭之比为1∶3.5（L：Kg），搅拌混合、 粉碎，即得含W33（CCTCC NO：M 2012357）的粉剂。经检测，该固体生物修复制剂中W33 （CCTCC NO：M 2012357）菌株有效活菌数为2亿个/克以上。

实施例8W33接种印度芥菜提取土壤中的铜

采集重金属铜污染的土壤，风干磨碎，装入塑料盆钵，每盆2kg，加水使含水量为田间持 水量的60％，保持2d，每盆播入印度芥菜种子7粒。选用市售的印度芥菜Mix、Sin、Pur三 个品种。接种实施例6所得的以W33菌株（CCTCC NO：M 2012357）为有效成分的生物修复 菌剂10ml，对照接等量无菌水。植株生长期间每天以称重法加入蒸馏水，保持土壤湿度为田 间持水量的60％。生长30d后再接种实施例6所得的以W33菌株为有效成分的生物修复菌剂 10ml一次。播种60d收获，沿土面剪取植株地上部，同时洗出根系，在105℃下杀青，70℃ 烘干，称量根和地上部的干重，植物样品磨碎后用硝酸-高氯酸法消煮，原子吸收分光光度计 测定植株中重金属Cu含量。由表2可知接菌W33处理后印度芥菜的生物量均比对照提高，其 中Mix品种的植物地上部和根部干重显著增加80％和73％，Pur品种植物地上部和根部干重显 著增加64％和58％。Sin品种生物量增加最少。由表3可知，印度芥菜Mix和Pur品种Cu含量 较高，吸收重金属能力比Sin强，接菌W33处理后，Mix和Pur品种中Cu含量增加较少，而 Sin品种中Cu含量大幅提高增加31.6％-65.4％。由表4可知，三个品种的印度芥菜均能富集Cu， 接菌处理后，印度芥菜的地上部和根对Cu的富集量均比对照有所提高，其中Sin品种地上部 对Cu的富集量显著增加1.03倍，其次为Pur品种。

表2重金属Cu污染土壤中根瘤菌W33对印度芥菜的促生效应

植物品种 项目 接菌 对照 Mix 地上部干重（g/盆） 2.26±0.02 1.25±0.03   根重（g/盆） 0.45±0.01 0.26±0.03 Sin 地上部干重（g/盆） 1.90±0.32 1.81±0.16   根重（g/盆） 0.58±0.02 0.42±0.04 Pur 地上部干重（g/盆） 2.66±0.33 1.62±0.12   根重（g/盆） 0.52±0.17 0.33±0.02

表3重金属污染土壤中根瘤菌W33对印度芥菜Cu含量的影响

植物品种 项目 接菌 对照 Mix 地上部Cu含量（mg/kg） 90.8±4.2 97.5±18.3   根Cu含量（mg/kg） 485.9±16.5 493.7±25.9 Sin 地上部Cu含量（mg/kg） 65.6±5.7 49.8±1.9   根Cu含量（mg/kg） 449.9±2.4 272.0±1.3 Pur 地上部Cu含量（mg/kg） 89.0±2.3 92.4±3.9   根Cu含量（mg/kg） 536.8±10.3 491.8±4.9

表4重金属活化细菌强化印度芥菜提取土壤中的铜

植物品种 项目 接菌 对照 增加率％ Mix 地上部Cu富集量（μg/盆） 221.2±11.6 157.8±24.1 0.402   根Cu富集量（μg/盆） 201.7±23.6 118.1±8.3 0.709 Sin 地上部Cu富集量（μg/盆） 156.6±12.5 77.0±7.4 1.034   根Cu富集量（μg/盆） 261.8±7.5 187.3±25.3 0.398 Pur 地上部Cu富集量（μg/盆） 246.3±9.4 153.1±6.7 0.609

  根Cu富集量（μg/盆） 220.5±2.6 162.7±10.2 0.355

实施例9重金属污染土壤中根瘤菌W33促进苜蓿生长和结瘤的效应

采集重金属铜污染（总铜含量为850mg/kg）的土壤，风干磨碎，装入塑料盆钵，每盆2 kg，加水使含水量为田间持水量的60％，保持2d，每盆播入苜蓿种子20粒。接种实施例6所 得的以W33菌株（CCTCC NO：M 2012357）为有效成分的生物修复菌剂10ml，对照接等量无 菌水。植株生长期间每天以称重法加入蒸馏水，保持土壤湿度为田间持水量的60％。生长30d 后再接种实施例6所得的以W33菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml一次。播种60d收获， 沿土面剪取植株地上部，同时洗出根系，计数植物根系上的根瘤。将根系在105℃下杀青，70℃ 烘干，称量根和地上部的干重。由表5可知，菌株W33可以明显促进苜蓿在重金属污染土壤 中的生长，与接灭菌菌剂的对照相比，接种以W33菌株为有效成分的生物修复菌剂使得苜蓿 的株高显著增加1.7倍，根重和地上部干重分别增加2.7和2.4倍，达到极显著水平。并且， W33可以在苜蓿上结瘤，可见苜蓿是根瘤菌W33的有效共生宿主。

表5重金属污染土壤中根瘤菌W33对苜蓿的促生效应

项目 接菌 对照 株高（cm） 20.5±5.2 10.0±1.1 根重（g/盆） 0.84±0.32 0.23±0.05 地上部干重（g/盆） 1.46±0.49 0.43±0.06 结瘤量（粒/棵） 4.7±2.1 0.7±0.6

实施例10钨矿尾砂废弃地上耐重金属的根瘤菌W33促进植物生长效应

将实施例7所得的以W33菌株为有效成分的生物修复菌剂2kg与4kg钨矿尾砂、200g 弯叶画眉草种子拌匀后，播种于钨矿废弃地小区中，小区大小为1m×1m，重复3次。对照接 种灭菌W33生物修复菌剂。共设6个小区。待出苗生长1月后再次接种实施例7所得的以W33 菌株为有效成分的生物修复菌剂，将2kg菌剂与8kg土拌匀后撒施。定期浇水、除草。3个月 后收割，测量株高，烘干至衡重，测定生物量。结果见表6。菌株W33可以促进弯叶画眉草 株高和干重显著增加，分别比对照提高30％和43％。

表6钨矿废弃地上根瘤菌W33对弯叶画眉草的促生效应

实施例11稀土尾砂废弃地上根瘤菌W33促进弯叶画眉草生长效应

将实施例7所得的以W33菌株为有效成分的生物修复菌剂2kg与4kg稀土尾砂、200g 弯叶画眉草种子拌匀后，播种于稀土小区中，小区大小为1m×1m。对照接种灭菌W33生物 修复菌剂待出苗生长1月后再次接种实施例7所得的以W33菌株为有效成分的生物修复菌剂， 将2kg菌剂与8kg土拌匀后撒施。3个月后拔出植株，测量根长和株高。测定此时鲜重记为 W1，然后清洗去除沙砾，用吸水纸略微吸干后测定重量记为W2。根据公式W固沙=W1-W2计 算固沙量。结果见表7。菌株W33可以促进弯叶画眉草根长和株高显著增加，分别比对照提 高19％和46％。植物干重增加不显著。菌株W33（CCTCC NO：M 2012357）的接种使得植物根 系发达，固沙量显著增加98％，有利于稀土尾矿废弃地的水土保持。

表7稀土废弃地上根瘤菌W33对弯叶画眉草的促生效应