盐藻培养基、半连续培养方式及藻液中原生动物杀灭方法

摘要

本发明公开了一种盐藻半连续培养方式及藻液中原生动物污染的消除方法，涉及海洋微藻养殖领域。盐藻的培养传统上使用f/2培养液配方，生长速度慢，产量低。使用优化培养基培养盐藻生长速度快、β-胡萝卜素含量高、成本低，产量能够提高76％。塑料薄膜悬浮吊带培养代替传统的开放水泥池培养盐藻，易于操作、不易污染、易于掌控、灵活多样、不易划破、安全可靠，透光性好，成本低，生长快，产量高。按每升藻液加入0.6克(NH4)2CO3的量加入(NH4)2CO3，处理藻液12小时能有效杀灭藻液中的尖鼻虫、游仆虫、纤毛虫、变形虫等原生动物，而且操作简便，对盐藻细胞伤害很小。

说明书

技术领域

本发明属于海洋微藻养殖领域，尤其涉及一种盐藻半连续培养方式及藻液中原生动物污 染的消除方法。

背景技术

盐藻(Dunaliella salina)是一种双鞭毛单细胞绿藻，可耐高盐度(20-300‰)。盐藻在胁 迫条件下可大量积累β-胡萝卜素，最高可达干重的14％，为自然界所有生物之首，因此早在 1966年，Massyuk就提出可大规模培养盐藻生产β-胡萝卜素；另外盐藻含有的甘油可达干重 的40％，具有生产甘油的潜在前途；盐藻还是一种良好的水产动物饲料。我国具有漫长的海 岸线和众多的内陆盐湖，具有培养盐藻生产β-胡萝卜素得天独厚的自然条件。

海水中无机碳的存在形式以HCO₃^-为主(90％)，而游离的CO₂不足1％。过去人们一直认 为，水体中游离CO₂是藻类利用外源无机碳的唯一形式。张学成的工作表明，螺旋藻培养基 中添加50-100mmol/LNaHCO₃，不仅可以满足螺旋藻生长的需要，而且有助于保持藻体生长 的pH值。林惠民认为，NaHCO₃可作为藻类生长的碳源。我的研究结果表明盐藻可以利用 HCO₃^-作为碳源。

温度、光照、盐度、营养盐等对盐藻生长都有重要影响。氮在细胞代谢中是形成氨基酸、 嘌呤、嘧啶、卟啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是盐藻生长最重要的营养元素。 有研究认为硝酸态氮是盐藻生长的最佳氮源。我的研究显示NH₄NO₃用作氮源无论对盐藻细 胞密度的增加、叶绿素a的合成、β-胡萝卜素的积累等方面的效果均优于NaNO₃和NH₄Cl， 这可能是两种离子作用互补的结果。

海泥抽出液含有藻类生长所必需的各种无量元素和溶解有机物质及某些辅助生长物质； 具有类似络合剂的作用。在培养液中加入海泥抽出液，实际是解决了微量元素供应的问题。 碳水化合物是海泥的有机组成成分，可以补充碳源。陈振奋认为，海泥抽取液对牟氏角毛藻 生长的促进作用强于维生素。我的研究表明，每升培养液添加3-10mL的海泥抽取液对盐藻生 长有较好促进作用。人尿中95％是水，5％是可溶性无机盐，其中约2％是尿素。在藻细胞的氮 代谢中，氮必须以NH₄⁺的形式与细胞内的碳水化合物衍生的酮酸作用生成氨基酸，再合成蛋 白质。已经证实许多藻含有尿素酶，在它的催化作用下，尿素分解出氨被微藻利用，酶功能 的差异是造成各种微藻利用尿素能力差异的主要原因。孙凌毅指出微藻对铵盐和尿素的利用 强于硝酸盐。张贵杰等研究指出培养牟氏角毛藻以尿素效果最好，硝酸钠次之，氯化铵最差。 张青田等认为以尿素为氮源培养隐藻效果强于氯化铵。本人研究证实2-5mL的尿液对盐藻生 长有较好促进作用。

目前，盐藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长、易污染。合适 的培养基是实现盐藻高密度培养的基础。以前使用的培养基没有加入碳酸氢钠和海泥抽取液， 但大量实验表明，盐藻除了能利用空气中游离的CO₂，还能有效地利用培养液中的HCO₃^-作 为碳源。NaHCO₃不仅缩短了盐藻的倍增时间，而且延长了盐藻的生长时间。我的实验表明， 添加适量的NaHCO₃和海泥抽取液及f/2维生素溶液能大大提高生长速度，盐藻的产量能提 高76％。

关于盐藻的培养方式，以前是采用开放水泥池。缺点是易污染，洗刷不便，现在我用塑 料薄膜悬浮吊带培养代替开放水泥池，好处是成本低、易于操作、不易污染、易于掌控、灵 活多样、不易划破、安全可靠。

盐藻是耐高盐的广盐性单细胞绿藻，是自然界最耐盐的真核生物之一，可耐300‰的高 盐度。在实验室培养中一般不会造成原生动物等的污染。但在室外水泥池大面积培养中常发 生由耐高盐的原生动物(变形虫、卤虫、纤毛虫、盐生无泡纤虫)造成的污染，这些生物通 过直接捕食盐藻或争夺营养盐或生活空间而使盐藻的生长繁殖受到严重压抑，有时盐藻的密 度被限制在30×10⁴cell/mL以下(正常密度为70×10⁴-90×10⁴cell/mL)。研究发现，在较低的 盐度(60-120‰)下盐藻生长最快，在这种盐度下，污染原生动物的种类和数量更多。因此， 在盐藻的规模生产中，如何防治原生动物特别是变形虫造成的污染已成为一个亟待解决的问 题。虽然较高浓度的(NH₄)₂CO₃对盐藻和原生动物都有毒害作用，抑制其生长繁殖或直接将 其杀死，但我的研究发现，与盐藻相比，原生动物对(NH₄)₂CO₃更敏感，更易被杀死，这正 是本发明的理论基础。(NH₄)₂CO₃加入到培养基中发生电离并形成水解平衡

(NH₄)₂CO₃→2NH₄⁺+CO₃²⁺

CO₃²⁺+H₂O→HCO₃^-+OH^-

HCO₃^-+H₂O→H₂CO₃+OH^-

水解产生的大量OH^-使培养基p H值迅速上升，最高可达9.5。(NH₄)₂CO₃抑制或毒杀原 生动物的原理可能是：NH₄⁺的直接毒杀作用；迅速上升的pH值也可直接杀死原生动物。我 的研究表明，用0.6g/L的(NH₄)₂CO₃处理培养基12小时对杀灭原生动物有极好效果。

发明内容

为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐藻培养基配方，配方如下：

NH₄NO₃ 40毫克，KH₂PO₄ 1.2毫克，NaHCO₃ 450毫克，九二0植物生长刺激素(即赤霉素) 6国际单位，f/2维生素溶液1毫升，f/2微量元素溶液1毫升，人尿2毫升，海泥抽取液5 毫升，消毒海水1000毫升。其中f/2微量元素溶液配方：ZnSO₄·4H₂O 23毫克，MnCl₂·4H₂O 178毫克，CuSO₄·5H₂O 10毫克，FeC₆H₅O₇·5H₂O 3.9克，Na₂MoO₄·2H₂O 7.3毫克，CoCl₂·6H₂O 12毫克，Na₂EDTA 4.35克，纯水1000毫升；f/2维生素溶液配方：维生素B₁₂ 0.5毫克，维 生素B₁ 100毫克，维生素H0.5毫克，纯水1000毫升。

盐藻塑料薄膜袋半连续培养方法，包括如下步骤：

采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎 口。一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长约20 厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器。将此袋漂浮在盛有普 通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深＝600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后， 用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8-1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行 培养。每池吊袋6-8个。饱和卤水取自内陆盐湖，用蒸馏水稀释至盐度120‰，用次氯酸钠 消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到 10-20mg/L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定， 直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。按上述培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻 种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其 它杂藻、原生动物等。接种密度3×10⁴-4×10⁴cell/mL，室外培养，自然光照射，温度28 ±3℃，光强5000-10000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉 即可，充气管末端连两个气石。夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时， 重复进行。培养4-6天，密度达60×10⁴-120×10⁴cell/mL，采收藻液的1/3，补加相同体积 的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1/3，补加相同体积的新鲜培养基，继续 培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收。

杀灭藻液中原生动物的方法，其特征在于包括如下步骤：

当培养基使用了10天以上时，藻液中会出现很多纤毛虫等原生动物，这时按每升藻液加 入0.6克(NH₄)₂CO₃的量加入(NH₄)₂CO₃，连续充气4小时，使之充分溶解并混合均匀，这时藻 液中会出现大量沉淀，静置8小时，弃去沉淀物，将上清液移入到另一洁净的培养容器中， 加入4-5倍体积的新鲜培养液继续培养。

有益效果：盐藻的培养传统上使用f/2培养液配方，生长速度慢，产量低。使用优化培 养基培养盐藻生长速度快、产量高、β-胡萝卜素含量高、成本低，产量能够提高76％。塑料 薄膜悬浮吊带半连续培养方法培养代替传统的开放水泥池培养盐藻，易于操作、不易污染、 易于掌控、灵活多样、不易划破、安全可靠，透光性好，成本低，生长快，产量高。用0. 6g/L的(NH₄)₂CO₃处理藻液12小时能有效杀灭藻液中的尖鼻虫、游仆虫、纤毛虫等原生 动物，而且操作简便，对盐藻细胞伤害很小。

附图说明

图1为塑料薄膜袋半连续培养盐藻的示意图

其中，附图标记如下：1塑料薄膜袋 2水泥池 3藻液 4进气管 5出气管 6散气石 7 普通海水。

具体实施方式

培养基配制方法

1)九二0植物生长刺激素(即赤霉素)为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充 分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解1小时以上)，再按所需浓度兑水稀释；

2)加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生 化学反应；

3)各种营养盐特别是f/2微量元素溶液和f/2维生素溶液均需预先配成母液备用；但放 置时间不要超过7天，且最好4℃冰箱冷藏保存；

4)全部营养盐加完后再充气搅拌15分钟，即可接种；

5)人尿制备：取人尿1000毫升，烧瓶煮沸后冷却备用；

6)海泥抽取液制备：取比较肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2份淡水，充分搅拌均匀， 静置1-2分钟，取上层泥浆于铝锅中，按每1000毫升泥浆加1克NaOH的量加入NaOH，煮沸 20-30分钟。煮时需不断搅拌均匀，煮后静置24小时取上清液备用；

7)所有药品纯度均需化学纯级别；

8)此培养基配方对盐藻各培养阶段都适用。

9)向藻液加入(NH₄)₂CO₃时，(NH₄)₂CO₃需预先溶解并不断搅拌或充气，免得局部药物浓度 太高，伤害藻细胞。

盐藻培养基配方，配方如下：

NH₄NO₃ 40毫克，KH₂PO₄ 1.2毫克，NaHCO₃ 450毫克，九二0植物生长刺激素(即赤霉素) 6国际单位，f/2维生素溶液1毫升，f/2微量元素溶液1毫升，人尿2毫升，海泥抽取液5 毫升，消毒海水1000毫升。其中f/2微量元素溶液配方：ZnSO₄·4H₂O 23毫克，MnCl₂·4H₂O 178毫克，CuSO₄·5H₂O 10毫克，FeC₆H₅O₇·5H₂O 3.9克，Na₂MoO₄·2H₂O 7.3毫克，CoCl₂·6H₂O 12毫克，Na₂EDTA 4.35克，纯水1000毫升；f/2维生素溶液配方：维生素B₁₂ 0.5毫克，维 生素B₁ 100毫克，维生素H0.5毫克，纯水1000毫升。

盐藻塑料薄膜袋半连续培养方法，参见附图：

采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎 口。一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长约20 厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器。将此袋漂浮在盛有普 通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深＝600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后， 用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8～1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行 培养。每池吊袋6-8个。饱和卤水取自内陆盐湖，用蒸馏水稀释至盐度120‰，用次氯酸钠 消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到 10-20mg/L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定， 直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。按上述培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻 种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其 它杂藻、原生动物等。接种密度3×10⁴-4×10⁴cell/mL，室外培养，自然光照射，温度28 ±3℃，光强5000-10000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉 即可，充气管末端连两个气石。夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时， 重复进行。培养4-6天，密度达60×10⁴-120×10⁴cell/mL，采收藻液的1/3，补加相同体积 的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1/3，补加相同体积的新鲜培养基，继续 培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收。

杀灭藻液中原生动物的方法：

当培养基使用了10天以上时，藻液中会出现很多纤毛虫等原生动物，这时按每升藻液加 入0.6克(NH₄)₂CO₃的量加入(NH₄)₂CO₃，连续充气4小时，使之充分溶解并混合均匀，这时藻 液中会出现大量沉淀，停止充气，静置8小时，弃去沉淀物，将上清液移入到另一洁净的培 养容器中，加入4-5倍体积的新鲜培养液继续培养。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前 述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改 或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。