一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法

摘要

本发明公开了一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法，是以TVA基因序列619位的SNP位点为研究对象，进行PCR-RLFP分析，检测SNP位点是否发生突变，同时结合检测TVA基因序列305~308位的SNP位点是否有4个碱基的插入，两者检测结果相结合共同判定被检测鸡为遗传抗性型还是遗传易感型。本发明的抗性分型方法从源头上进行检测，省去了后期检测的麻烦，同时该检测方法快速准确，目的性强，操作简单，具有实践意义，可以对鸡进行遗传性状的快速选择以提高品系的抗病性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡抗病毒基因的分型方法，具体涉及一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法。

背景技术

我国是肉鸡生产大国和消费大国，肉鸡产量居世界第二位。2010年，我国优质鸡年出栏率达到50亿只，约占中国肉鸡产量的50%，中国成为世界最大的优质鸡生产基地和消费市场，优质鸡产业已成为最具有中国特色的家禽产业，在国际市场上优势地位明显。本课题组多年流行病学调查结果显示，禽白血病在优质鸡中的发病率高于快大型肉鸡，成为威胁优质鸡产业的主要疾病之一。

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus, ALV）引起的以造血细胞恶性增生为主的一类免疫抑制性传染病。ALV分为A-J 10个亚群，A、B、C、D为外源性病毒，E为内源性病毒（Bai, J., Payne, L.N. & Skinner, M.A. 1995.HPRS-103 (exogenous avian leukosis virus, subgroup J) has an env gene related to those of endogenous elements EAV-0 and E51 and an E element found previously only in sarcoma viruses  J Virol., 69: 779-784; Benson, S.J., Ruis, B.L., Garbers, A.L., Fadly, A.M. & Conklin, K.F. 1998.Independent isolates of the emerging subgroup J avian leukosis virus derive from a common ancestor  J Virol., 72: 10301-10304; Payne, L.N., Gillespie, A.M. & Howes, K. 1992.Myeloid leukaemogenicity and transmission of the HPRS-103 strain of avian leukosis virus  Leukemia, 6: 1167-1176）。在鸡群中A亚群病毒最常见，B亚群病毒次之。宿主范围广泛、感染率高、传播速度快和致死率高等特点。目前禽白血病的防控主要方法是通过淘汰阳性鸡来净化种群，没有疫苗进行免疫防控。ALV的清除是一项极其费力、费时且花费巨大的工作，鸡群中ALV的净化可能需要多年坚持不懈的努力。

培育ALV抗性鸡是未来替代传统净化鸡群方法的必然趋势。制约ALV抗性育种的根本原因是没有切实可行的ALV抗性育种方法。遗传抗性和免疫接种是降低疾病危害的基本策略, 而遗传抗性显然更符合可持续发展的要求, 并且在一定程度上具有一劳“永”逸的意义。

显然，从遗传角度选育对禽白血病具有抗性的鸡是完全可行。在鸡ALV的遗传抗性研究上，Zhang的团队研究了ALV-B\D\E抗性鸡与易感鸡的禽白血病受体基因情况，建立了快速监测ALV-B\D\E抗性鸡和易感鸡的方法(Zhang, H.M., Bacon, L.D., Cheng, H.H. & Hunt, H.D. 2005.Development and validation of a PCR-RFLP assay to evaluate TVB haplotypes coding receptors for subgroup B and subgroup E avian leukosis viruses in White Leghorns  Avian Pathol., 34: 324-331)，为ALV-B\D\E的抗性育种和本项目的深入研究打下基础（Zhang et al, 2005）。Zekarias 等（Zekarias, B., Songserm, T., Post, J., Kok, G.L., Pol, J.M., Engel, B. & ter, H.A. 2002.Development of organs and intestinal mucosa leukocytes in four broiler lines that differ in susceptibility to malabsorption syndrome  Poult.Sci., 81: 1283-1288）认为鸡的遗传抗性主要由免疫系统及一些生理和环境因子来控制。在获得性免疫反应中, 抗原的特异性识别、抗原递呈细胞(APC)-抗原肽-主要组织相容性复合体(MHC)之间关系、T细胞和B细胞的激活都可以影响免疫应答。MHC、T细胞亚群、免疫球蛋白和细胞因子等的网络调节作用很大程度上决定了鸡的天然抗病力的强弱。因此，负责编码这些蛋白成分的基因的内在多态性直接影响着机体的抗病能力。目前所发现的与鸡综合抗病力有关的基因不多，研究主要围绕主要组织相容性复合体(MHC)、天然抗性相关巨噬蛋白l(NRAMPl)、模式识别受体编码基因、干扰素基因(IFN)和鸡的免疫球蛋白编码基因等（刘红等，2006）。鸡中存在着一些可调节机体对某些特定病原(禽白血病病毒、马立克氏病病毒、沙门氏菌、传染性法氏囊病病毒、球虫等)不易感的基因；白细胞介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子及生长因子等均可被当成机体抗病性的候选基因而加以利用, 这方面的报道目前主要以揭示人类疾病发生的遗传控制机理为主（刘红,廖明,曹伟胜.2006.抗性基因在鸡抗病育种中的研究进展.中国家禽, 28(17):55-57；Kramer, J., Malek, M. & Lamont, S.J. 2003.Association of twelve candidate gene polymorphisms and response to challenge with Salmonella enteritidis in poultry  Anim Genet., 34: 339-348）。对于这些因子与疾病的联系, 虽然对畜禽尚无多少成果报道, 但可以借鉴人类的研究成果来揭示畜禽疾病的遗传控制机理。如何通过遗传标记辅助选择将抗性基因运用于抗病育种, 并发现新的与抗病性状连锁的遗传标记将是优质鸡抗病育种的热点。

鸡抗病性的遗传基础研究，建立鸡的抗性基因分型育种方法，快速选育抗性个体更是优质鸡产业发展极其紧迫的工作。2000年，欧洲5个学术团体和2个公司合作开始了一个大规模的合作，目的是了解鸡抗病性的遗传基础，并且能建立快速简单地发现抗性个体的遗传实验，这项计划被称为IMAGE，是第一个对家禽免疫表达基因进行测序，也是唯一的聚焦于研究疾病领域的遗传基因功能研究。他们主要集中于三种疾病的抗病性研究（传染性法氏囊病、马立克氏病和球虫病），研究结果发现在正常鸡和具有抗病性的鸡之间某些基因的表达有明显差别。项目负责人指出，接下来的研究主要集中于研究由免疫产生的抗病力和天然抗病力的区别。一般抗病力受多基因或环境影响。鸡一般抗病遗传力估计在0.1以下（Bacon, L.D., Hunt, H.D. & Cheng, H.H. 2000.A review of the development of chicken lines to resolve genes determining resistance to diseases  Poult Sci, 79:1082-1093），而特殊抗病遗传力常常较高（Govora, J.S., Spencer, J.L., Okada, I. & Grunder, A.A. 1990.Correlation of genetic resistance of chickens to Marek's disease viruses with vaccination protection and in vivo response to phytohemaglutinin  Genet.Sel.Evol., 22: 457）。

不同遗传背景的鸡对ALV-A亚群的易感性不同，选育LVA-A亚群抗性鸡是防控禽白血病的主要手段之一。Elleder D等（Elleder, D., Melder, D.C., Trejbalova, K., Svoboda, J. & Federspiel, M.J. 2004a.Two different molecular defects in the Tva receptor gene explain the resistance of two tvar lines of chickens to infection by subgroup A avian sarcoma and leukosis viruses  J.Virol., 78: 13489-13500）研究得出禽白血病病毒(ALV)是通过特定膜蛋白作为受体位点吸附进入细胞的，其中ALV-A亚型受体为tva，相应的编码基因属于低密度脂蛋白受体家族成员；ALV-B、ALV-D、ALV-E亚型受体是tvb，相对应的编码基因是肿瘤坏死家族的成员；ALV-C亚型的受体是tvc。Elleder D等（Elleder, D., Plachy, J., Hejnar, J., Geryk, J. & Svoboda, J. 2004b.Close linkage of genes encoding receptors for subgroups A and C of avian sarcoma/leucosis virus on chicken chromosome 28  Anim Genet., 35: 176-181）研究发现易感鸡的DT40细胞能通过同源重组破坏tvc等位基因而抗ALV-C的感染。Zekarias B等（Zekarias, B., Songserm, T., Post, J., Kok, G.L., Pol, J.M., Engel, B. & ter, H.A. 2002.Development of organs and intestinal mucosa leukocytes in four broiler lines that differ in susceptibility to malabsorption syndrome  Poult.Sci., 81: 1283-1288）表明，一些内源性反转录病毒基因表达的膜糖蛋白(如gp85)可阻断ALV受体，使机体产生抗ALV抗性，而且这种抗性可垂直传播。ALV的抗性基因的挖掘和抗性育种方法的建立具有极为重要的意义和价值。

目前ALV还没有好的疫苗可用于该病的防控，而且没有关于优质鸡抗禽白血病A的抗性基因的任何报道，没有一个成熟的抗性基因可应用于优质鸡抗ALV-A的遗传抗病性选育，更没有相关的优质鸡抗禽白血病A抗性分型育种方法的建立，这对优质鸡ALV抗病育种提出了巨大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明根据ALV-A的受体基因TVA为研究对象，发现该TVA基因的第619位核苷酸具有多态性，因而设计PCR-RFLP实验，同时结合TVA基因序列305~308位是否有4-base（CGCT），来对鸡进行A亚群禽白血病病毒抗性基因分型。

一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法（以下简称抗性分型方法），以TVA基因序列619位的SNP位点为研究对象，进行PCR-RLFP分析，检测SNP位点是否发生突变，同时结合TVA基因序列的测序检测305~308位点是否有4个碱基的插入；

按如下标准进行基因抗性分析：

遗传易感型：TVA基因序列两个等位基因619位的SNP位点均未发生突变且305~308位点无4个碱基的插入、TVA基因序列其中一个等位基因619位的SNP位点发生突变且305~308位点均无4个碱基的插入，或TVA基因序列其中一个等位基因619位的SNP位点未发生突变且另一个等位基因305~308位点有4个碱基的插入；

遗传抗性型：TVA基因序列619位的SNP位点均发生突变且305~308位点无4个碱基的插入、TVA基因序列其中一个等位基因619位的SNP位点发生突变且另一个等位基因305~308位点有4个碱基的插入，或TVA基因序列两个等位基因305~308位点均有4个碱基的插入。

作为一种优选方案，上述抗性分型方法中所述SNP位点发生突变是由C突变为G，4个碱基为CGCT。

作为一种优选方案，上述抗性分型方法中所述PCR-RLFP分析中，以鸡全基因组DNA为模板，引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示，PCR方法扩增包含TVA基因619位点的片段（以下简称TVA619片段），扩增产物用Ear I酶进行酶切。

作为一种优选方案，上述抗性分型方法中，在进行PCR-RLFP分析后还有一个焦磷酸测序步骤，验证SNP位点是否发生突变，测序引物核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

作为一种优选方案，上述抗性分型方法中，TVA基因序列的测序首先以SEQ ID NO:4~5所示核苷酸序列为引物，PCR方法扩增包含TVA基因305~308位点的片段（以下简称TVA223片段），扩增产物用焦磷酸测序方法进行测序。焦磷酸测序的引物核苷酸序列优选如SEQ ID NO:6所示。

本发明的实验原理如下：

1. 根据已知TVA基因的mRNA序列(GenBank登录号：AY531262.1，该基因DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)上的619位核苷酸多态性设计PCR-RFLP实验。具体方法为：根据TVA基因mRNA序列上的619位的SNP位点（C/G），设计PCR-RFLP的扩增引物序列例如TVA6195、TVA6193，引物TVA6193用生物素标记。在TVA6195序列的5’端带有Ear I酶切位点CTCTT，引物序列见表1。抽提鸡的基因组DNA，用引物TVA6195和TVA6193扩增的片段长69bp。然后用Ear I酶切，上述PCR的产物用Ear I内切酶酶切可以看到不同大小的酶切条带，分别为69bp、38bp、31bp。如果该PCR产物能被Ear I酶完全或不完全切开，则该SNP位点的核苷酸为C或含有C，如为遗传易感型（完全切开定义为TVA*S，不完全切开定义为TVA*S/R1）；如不能切开，则该位点的核苷酸为G，为遗传抗性型（定义为TVA*R1）。

2. 同时用619位SNP位点的焦磷酸测序（Pyrosequence）方法进行SNP测序验证，测序引物Pyro-primer619（见表1）。TVA619 SNP位点的pyrosequence测序的引物和位置见图1。如果619位点的核苷酸为C，为遗传易感型（上述的TVA*S），若果619位点的核苷酸可能是C或G，则为杂合易感型（上述的TVA*S/R1）；如该位点的核苷酸为G，为遗传抗性型（上述的TVA*R1）。

3. 本发明根据TVA基因的mRNA序列（GenBank登录号：AY531262.1）的305~308位4-base插入的情况设计焦磷酸测序（pyrosequence）实验。TVA的305~308位有4-base的插入，则该鸡为ALV-A的遗传抗性型；反之为遗传易感型。根据TVA基因的mRNA序列设计引物，例如TVA2235、TVA2233和 Pyro-primer223,引物TVA2233用生物素标记。引物序列见表1。TVA619 SNP位点的pyrosequence测序的引物和位置见图2。抽提鸡的基因组DNA，用引物TVA2235和TVA2233扩增样品的PCR产物为223bp，然后用焦磷酸测序（pyrosequence）测序仪进行4-base插入位点的测序。若有4-base插入，则为遗传抗性型（定义为TVA*R2）；如没有4-base插入，则为遗传易感型（同样属于TVA*S）。

4. 本发明根据PCR-RFLP和4-base pyrosequence测序的结果，制定判定鸡抗A亚群禽白血病病毒（ALV-A）的基因型的标准。TVA是ALV-A亚型禽白血病病毒进入宿主的受体基因。本发明定义的TVA抗性有三个等位基因，即TVA*S, TVA*R1和 TVA*R2。所以就有六种基因型，TVA*S/S、TVA*S/R1、TVA*S/R2、TVA*R1/R1、TVA*R1/R2、TVA*R2/R2。一只鸡如果带有一个或两个TVA*S等位基因，这只鸡将是ALV-A的易感型，即遗传易感型。一只鸡如果带有一个TVA*R1和一个TVA*R2、或者两个TVA*R1或两个TVA*R2等位基因， 那么，这只鸡就是抗ALV-A的基因型，即遗传抗性型。基因型分型判定如表2。

5、结合2、3的方法，按照4的标准，建立鸡抗A亚群禽白血病病毒（ALV-A）的抗性基因分型方法。

表1 PCR扩增和焦磷酸测序引物

序列编号引物名称SNP位点引物序列^ASEQ ID NO:1TVA61956195’-AAACCGACTGCTACCCGCTGGAGTGGC TCTT-3’SEQ ID NO:2TVA61936195’-ACTCGTCCCGTCCATCGT-3’SEQ ID NO:3Pyro-primer6196195’-CGCTGGAGTGGCTCT-3’SEQ ID NO:4TVA22354-base5’-CATGGTGCGGTTGTTGGAGC-3’SEQ ID NO:5TVA22334-base5’-GGGGAACGCGGGGTGC-3’SEQ ID NO:6Pyro-primer2234-base5’-GCTGCGCGCCGTCCG-3’

表2 基因分型判定

^a为PCR-RFLP实验；^b为4-base的焦磷酸测序（Pyrosequencing）方法，“----”代表没有插入，^C遗传易感型的鸡通过杂交，其下一代可以继续获得遗传抗性型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1） 目前在鸡的保种上存在禽白血病的严重困扰，保留的种鸡是ALV易感鸡还是抗性鸡都不清楚。而目前控制禽白血病的方法是采用淘汰阳性鸡的净化方法，大量使用如IDEXXP27抗原试剂盒，对所有的种鸡一一进行检测，淘汰阳性鸡个体。这样费钱费力费时，不可能从根本上控制ALV的发生和流行，以及消除潜在地大规模爆发的威胁。用本发明的方法则可以从保种的源头上进行检测，保留对ALV-A的抗性基因型鸡，淘汰掉易感基因型鸡，这样留下来的鸡基本上都是抗ALV-A的。省去了后期众多鸡的一一检测的麻烦，也能从源头上控制禽白血病的感染。

（2）生产上通过表型性状进行的直接或间接选择的禽白血病抗性鸡，这种抗病育种实践耗费的育种成本很高，而且抗病力性状往往都是低遗传力的，很难很快选到很好的抗病品系。用本发明的方法则可以很快速的筛选到对ALV-A有抗性的鸡，这种抗性育种方法目的性强，操作性强，具有实践意义。

（3）与目前的而转基因技术相比，本发明具有安全性和推广性。目前的转基因方法，即插入某一必需基因或基因修补或转入防御因子或病原体片段，还停留在试验阶段，况且转基因产品或许还存在生态安全和食品安全问题，需要长期地跟踪其在大自然中遗传变异的情况和产品安全问题；利用转基因鸡进行繁育来抗禽白血病，则需要的时间更长。

（4）目前尚没有看到国内关于鸡以基因型选择、遗传标记辅助选择、或基因组型选择为抗性育种方法的研究报道。商业化育种公司的抗病育种还仍然停留在传统的或略有改进的育种方法上，即主要通过某种表型的选择以提高品系的抗病性。由于抗病性状遗传力低，且受营养、管理和环境影响大，选育的效果不明显，往往是事倍功半。使用本发明，则可以快速达到预期的效果。   

附图说明

图1. TVA基因619位SNP位点的pyrosequence测序的引物和位置。

图2. TVA基因305~308位的 4-base 插入的pyrosequence测序的引物和位置。

图3. TVA619片段的PCR扩增图，1、2、3和4均为不同样品的PCR产物。

图4. TVA619片段的PCR产物用Ear I酶切后的电泳模式图(P1, P2,和P3)。P1：TVA619的PCR产物可以被Ear I酶完全切开，出现38bp，31bp条带，但38bp和31bp条带电泳分不开；P2：TVA619 PCR产物不完全切开（等位基因为杂合子），出现69bp，38bp，31bp条带，但38bp和31bp条带电泳分不开；P3：TVA619的PCR产物不能被Ear I酶切开，仅出现69bp条带；P为TVA619的PCR产物，不经过酶切，作为对照。

图5. TVA基因619 片段SNP位点的焦磷酸（Pyrosequence）测序图谱，展示SNP位点的（C/C,C/G,G/G）三种基因型的实测焦磷酸测序图谱。

图6. TVA基因305-308位4-base插入的焦磷酸（Pyrosequence）测序图谱，展示SNP位点的（CGCT/CGCT,CGCT/----,----/----）三种基因型的实测焦磷酸测序图谱。

具体实施方式

以下结合实施例进一步解释本发明，实施例中除有特殊说明外，均为本领域常规实验方法和步骤。

实施例1 PCR-RFLP的建立

1. TVA619片段的PCR扩增

根据已知TVA基因的mRNA序列（GenBank登录号：AY531262.1）上的619位的SNP位点（C/G），设计PCR-RFLP的扩增引物TVA6195（5’-AAA CCG ACT GCT ACC CGC TGG AGT GGC TCT T-3’，SEQ ID NO:1），TVA6193（5’-ACT CGT CCC GTC CAT CGT-3’，SEQ ID NO:2），在引物TVA6195序列的3’端带有Ear I酶切位点CTCTT。抽提鸡的基因组DNA，用引物TVA6195和TVA6193进行PCR扩增。PCR反应体系组成如下：基因组DNA模板1μL，10×buffer 10μL，dNTPs 8 μL，引物TVA6195 1 μL，引物TVA6193 1μL，Bland Taq 1 μL，ddH₂O补至100μL。PCR反应程序：94℃预变性3min，1个循环；94℃ 40s，67℃ 40s，72℃ 1min，35个循环；72℃后延伸10min。PCR产物在3.5％琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到69bp左右的特异性条带，见图3。

2. PCR产物的Ear I酶切

上述PCR的产物用Ear I限制性内切酶(Invitrogen公司)酶切，反应体系：10×buffer M 10μL，Ear I 5μL，PCR产物30μL，ddH₂O补至100μL，37℃作用3h，用3.5%的琼脂糖凝胶电泳检测时可以看到不同大小的酶切条带，分别为69bp、38bp和31bp，如图4。如该PCR产物能被Ear I酶完全或不完全切开，则该SNP位点的核苷酸为C或含有C，如图4的P1、P2模式，为遗传易感型（定义为TVA*S或TVA*S/R1）；如不能切开，则该位点的核苷酸为G，如图4的P3模式，为遗传抗性型（定义为TVA*R1）。

 3. TVA 619位SNP位点的焦磷酸测序

同时用焦磷酸测序仪（PSQ 96MA，瑞典）进行619位SNP位点的焦磷酸测序（Pyrosequence）方法对PCR产物进行SNP测序，测序引物（sequence primer）Pyro-primer619为：5’-CGCTGGAGTGGCTCT-3’（ SEQ ID NO:3）。 测序图谱如图5。若TVA 619位的核苷酸是C/C，C/G，则该鸡对ALV-A为遗传抗性型；该位点的核苷酸序列为G/G，则为遗传易感型。

实施例2 4-base的焦磷酸测序（Pyrosequence）方法的建立

1. TVA223片段的PCR扩增

根据已知TVA基因的mRNA序列(GenBank登录号：AY531262.1) 上的305-308位的4-base插入或缺失位点（GCTC/----），设计PCR的扩增引物TVA2235（5’-CATGGTGCGGTTGTTGGAGC-3’，SEQ ID NO:4），TVA2233（5’-GGGGAACGCGGGGTGC-3’， SEQ ID NO:5）），TVA2233引物用生物素标记。抽提鸡的基因组DNA，用引物TVA2235和TVA2233进行PCR扩增。PCR反应体系组成如下：基因组DNA模板1μL，10×buffer 10μL，dNTPs 8 μL，引物TVA2235 1 μL，TVA2233 1μL，Bland Taq 1 μL，ddH₂O补至100μL。PCR反应程序：94℃预变性3min，1个循环；94℃ 40s，62℃ 40s，72℃ 1min，35个循环；72℃后延伸10min。PCR产物片段长223bp，直接用于焦磷酸测序。

2. 焦磷酸测序（Pyrosequenc）方法

    根据TVA上4-base插入或缺失位点设计Pyrosequence测序的测序引物（sequence primer，Pyro-primer），Pyro-primer223: 5’-GCTGCGCGCCGTCCG-3’（SEQ ID NO:6）。再用上述TVA223片段的PCR产物通过Pyrosequence仪器进行4-base的测序。测序图谱如图6。

通过测序，若TVA基因有4-base插入，即图谱上出现CGCT/CGCT或CGCT/----，该鸡为遗传抗性型（定义为TVA*R2）；如没有4-base插入，即出现----/----，则为遗传易感型（同样属于TVA*S）。

实施例3 TVA基因分型的判定标准建立

    本发明根据PCR-RFLP和4-base pyrosequence测序的结果，制定鸡抗A亚群禽白血病病毒（ALV-A）的抗性基因分型的判定标准。本发明定义的TVA抗性基因有三个等位基因，即TVA*S, TVA*R1和 TVA*R2。不同鸡品系的TVA基因就有六种基因型，TVA*S/S、TVA*S/R1、TVA*S/R2、TVA*R1/R1、TVA*R1/R2、TVA*R2/R2。遗传抗性分型的标准是：如果一只鸡带有一个或两个TVA*S等位基因，这只鸡将是ALV-A的易感型，即遗传易感型；如果一只鸡带有一个TVA*R1和一个TVA*R2、或者两个TVA*R1或两个TVA*R2等位基因，那么，这只鸡就是抗ALV-A的基因型，即遗传抗性型。基因型分型判定如表2。

实施例4  用ALV-A攻毒实验

取63、72、LinC以及他们互相交配的F2代鸡283只，隔离饲养于隔离房内，第1天和第5天分别用A亚群禽白血病病毒(LX0101)攻毒（剂量800 cfu/mL），饲养至5月龄，检查每只鸡的肿瘤形成情况，并记录饲养过程中发病死亡的数量。表型（发病死亡和出现肿瘤）结果见表3。

表3  ALV-A抗性分型方法鉴定与表型数据的比较

实施例5 临床样品的ALV-A的抗性基因分型鉴定

用建立的鸡抗ALV-A的抗性基因分型方法检测所有样品（即实施例4的283只鸡的DNA样品），结果为：易感型（包括基因型S/S,S/R1,S/R）为247只（就是理论上应该死亡或出现肿瘤），抗性型（包括基因型R1/R1，R1/R2，R2/R2）为36只。与实施例4的结果相比看出，基因型数据：表型数据 =247:243，相差4只。可能是表型数据判断误差造成的。结果见表3。该方法具有非常好的应用价值。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法

 

<130> 

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

aaaccgactg ctacccgctg gagtggctct t                                    31

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

actcgtcccg tccatcgt                                                   18

 

 

<210>  3

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cgctggagtg gctct                                                      15

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

catggtgcgg ttgttggagc                                                 20

 

 

<210>  5

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ggggaacgcg gggtgc                                                     16

 

 

<210>  6

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gctgcgcgcc gtccg                                                      15

 

 

<210>  7

<211>  3607

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

gggagaacct cacgaggttc agcagatcct catctcccga ccctggcagc agccaaggtc     60

 

acgcacgccg aggcggctcg ggccgcgccg cgatgtcccg cggagggggc ggggcctcga    120

 

ggagggggcg gggcctcctg acggttcgcg cgccagctcg aggtcgtcca ttggccgagg    180

 

ggcggagcgg cgcgcacgcg ccctgcccgc ccgcggcccg ctttataggc gttggggccg    240

 

gcgggcccgg ggccggcatg gtgcggttgt tggagctgct ggtgctgctg cgcgccgtcc    300

 

gcccgctgcc cacccccacc tccgcgcccg gcaacggtga gtgcaggcgg ccgcggctcc    360

 

cgccgtcctc tccccacgtt ggatccctgc gcacgccctt cgctctcatt ggccggcgcc    420

 

gctcgcggct ctctcgctct cattggccgg cgctgagccg cgcgcacccc gcgttccccg    480

 

ttgcggggtt ccgctccgct ccgctcaccc cgccccgccc cgccccgcag gttctttggc    540

 

gcagtgctca cccgagcagt tccactgttc ggagccgcgc gatccccaaa ccgactgcta    600

 

cccgctggag tggctctgcg acgggcatcc cgactgcgac gatggacggg acgagtgggg    660

 

ctgcggagcg agcgggagcc ccgcggtgcc caccgccggc ggcacaggta cgggcgggcc    720

 

tgctgggggg gctgcgctcg ggctcggggg ggggatggga gcccctccgg gagggctctg    780

 

atcggtaccc gcggtgcggg gtcagcaggg cggggcggtg cagcccgcgg tgttccggat    840

 

ggacgcgggg gagaacgtcg tgcggagagg tgcggagccc cggcacgaac cgcccgcagc    900

 

ggcggggcgc tccccttctc cgcgatcccc gcatccctcc ggggtgctcc gctgtgcggc    960

 

cgctgccgcg gggggtcggg gtggggcgcc tccggcggtc cgttcccgcg gttcggtgtg   1020

 

tcctcccggc tgtcataaag ctcagctgca gcggaacggc tttgtagtgc tgttataaag   1080

 

ataagagctg cggctctccg acggcgcctt ccctccgcgc ggctttcggc ccctctgaag   1140

 

cggcctcatc catcacacct cggccggggc tgcgctcacc catccgagca caggacgtgc   1200

 

tgagcagccc accttctgtg cggcattcgg gcgccgcggg cttcctcagg aagagctttg   1260

 

aagtgtctgc ttccctgccc gccgtgctgg ctgcctcaca gccctcttag atcgcacaat   1320

 

ggcccgggtt ggaagagacc tccgggatca cgaagctcca acccccccca ccgcaggcag   1380

 

ggccaccaac ctccacattt aattccagcc caggctgtcc agggccccat ccaacctggc   1440

 

cttgaacacc tccagggatg gatggggcat ccacagcccc tctgggcagc tgttcggcac   1500

 

ctccccactc tcataggaaa gaactcatcc tcgggctctg tgctccctga ccctatgggc   1560

 

acaatgggtg cagctgcctt gcttcaggat ccacttttaa tcaagctttc ctgcttgctt   1620

 

ggtttactta ttgactttgt ctcctcctac cctaacagtc ctcccagtct atgagaggtg   1680

 

aggaacgttt cccagctgct ggcgtgggct aatggcagta acagcagata aggctttgct   1740

 

tcagcctata cagtcctgct ggcactcctg agcgagctgg gaacctgttt gggtttgtgc   1800

 

tgagggctgc tgtgtgcatt gcctgggagc ctggcggact tcttgctttt ctccctccca   1860

 

gagacttcag ctgtccctgt gcctgggcgt gctctgccat ccaggaacca cggccgcatg   1920

 

tggatgctga tcgttgcagg tatgtgggac tcagagcaca ggtatgggca ggtttcccca   1980

 

ttgcaagaag tgcctacatg accagcgtgg tgagggatgg ggtctgtgtg tcccctgtct   2040

 

cagttagagg aaggaggtga tgctaccctt ctgcacgtgc acaaatgcaa gtcccaccta   2100

 

ttcccccctc acttgcaaac cactcctatg tatgtgaaat gcaccttttt gcagtaaata   2160

 

tgagggctgt gactcagtgg tctgctgagt acccaccaca caaatattgc tgggttggaa   2220

 

actgctggag ttgagggtgg tggtctggat tttccttccc cccctccgat ccaatctctt   2280

 

ttcctcttcc cttatctcat ttctctcttc ttctctcagt ttcaagctaa attaggacgt   2340

 

aacacaaggc atctgatcac acttcatcac caataacttt catccctgga ggcatccaag   2400

 

gccaggctgg atgtggctct gggcagcctg ggctgctggt tggtgaccat cacatagcag   2460

 

ggggttggag ctggatgagc actgctgtcc ttttcaaccc gttctatgat tctatgaaat   2520

 

acgttctatc tgcattttgt gctcggtgtc acagtgcagc gcaaatcaac atcgaagcaa   2580

 

ttgtttggca gtggttcacc ttaattaccc tgagggaatg tccaaacctc agaggtcccc   2640

 

ccctaaggcg ccccgctcca tgcagtctgg ctgtaacact tccatgctca ttgcccattg   2700

 

ctcttcaggc tgctgctctc tgttgactaa tgctatcgag cagcagagcc gggtgcagat   2760

 

atccaggcca ggcgcagtga gtggttctct gcttatgcac tcttctcttt agtgctcctg   2820

 

agctgcctgg tagctgtggg tggtattgct gcatggggga agtccaaagc aaaaagcagg   2880

 

tctgacatct tcggtctcga aagcgtatcc agggagcagt tggtgcctga caagagccag   2940

 

gcagacttgt tctcctgaga ggtaagttct ttgccccccc acgggaggga gcagtgatcc   3000

 

tgccctgcgt ttctagcagt agagctttcc cctcgggtag cttttcccag ctctccctgc   3060

 

tgctgctcag ccccacacct gtggtttcag tttgccctga agcagcagaa ctctcccctt   3120

 

ccttcctcac taccggacat gagagcccta ttttggctgc agggatcact gcatgaccta   3180

 

ctgtgagaag gtgctgcctt ctttcagtac tcttatgtcc ttcctttgct gctgagggct   3240

 

ctgagcactc atgccaagac atttcctggt gtgggttatt tcccaaactt cttgcaatct   3300

 

gaagtaaaac tggattccat ggcaaaaagg ctgccagcag ccacgtggtc ttgtttcctg   3360

 

tcacagggat ctttcactgt gaggtggtaa gatgggactg aactgctctc cctgctgctg   3420

 

accgtggaac ctggctgaat ttggacacga gctctcgaat ctggtttgct gttacactcg   3480

 

gatgctcctg ttgcaaatga gtcctggatg gtggcactgt gccacttgaa ataggacagg   3540

 

gccttcccca gtgctgtgaa atctcccccc cttaaaggtg acaggaattc cctcactctt   3600

 

tttgcct                                                             3607