链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B及其应用

摘要

一个链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B及其应用，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，上述基因编码的内切葡聚糖酶Cel5B，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，以及该酶在分解纤维素中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一个链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B，该基因编码的蛋白质在 降解纤维素中的应用。

背景技术

纤维素是植物中最广泛存在的骨架多糖，是世界上最丰富的可再生的天然 有机物（高洁，汤烈贵，1996，纤维素科学，科学出版社，27-28.）。纤维素具 有由β-1,4-糖苷键连接单糖而形成晶体结构，必须转化成微生物可利用的形式 （如葡萄糖、乙醇等化合物）才能生物转化成能源或生物化工产品（李旺，刘 辉，李恒新等，2007，纤维素酶产生菌DR的筛选和优化培养，江苏农业科学， 3：170-172.）。用纤维素酶水解纤维素对环境没有任何污染，使得丰富的生物 质资源可以通过生物转化变成绿色能源或可再生的生化产品（Rizzatti ACSA， Jorge JA，Terenzi HF，et al，2001，Purification and properties of a thermostable  extracellularβ-D-xylosidase produced by a thermotolerant Aspergillus phoenicis. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,26:156-160.）。

纤维素结构复杂，任何一种单一的酶都难以高效地水解它，能降解天然纤 维素的纤维素酶是一个复杂的多酶体系。

自然界中广泛地存在着能降解纤维素的微生物，它们种类繁多，包括细菌、 真菌和放线菌等（杜风光，史吉平，张龙等，2009，纤维质生产燃料乙醇产业 化研究进展，29：72-73.）。细菌类有红黄纤维弧菌（Cellvibriofulvus）、普通 纤维弧菌（C.vulgaris）等。细菌产生的纤维素酶一般为胞内酶，并且产量比较 低，主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。纤维单胞菌和高温单胞菌是被广 泛研究的两种产生纤维素酶的细菌（李明华，张大伟，楚杰等，2006，饲料纤 维素酶的研究与应用进展，新饲料，7：65-68.）；放线菌类有链霉属（Streptomyces） QMB814、高温放线菌属（Thernoactinomycete）和Theremomonospora curvata等； 真菌类有黑曲霉（Aspergillus niger）、血红栓菌（Trametes sanguinea）、卧孔 属（Poria）、绳状青霉（Penicillium funiculosum）、绿色木霉（Trichlderma viride）、 里氏木霉（T.reesei）等，其中里氏木霉和黑曲霉是目前应用最广的纤维素酶生 产菌（Tang B,Pan H B,Zhang Q Q,et al,2009,Cloning and expression of cellulose  gene EGI from Rhizopus stolonifervar.reftexus TP-02in Escherichia coli. Bioresource Technology,100:6128-6132.）。除此之外，国内外还尝试了应用基 因工程技术来改造和构建高效纤维素降解菌（林丽华，秦国梅，韦宇拓等，2009， 台湾家白蚁内切葡聚糖酶活性中心氨基酸的饱和突变，生物工程学报，25（6）： 927-931.），同时发现部分动物体内也可以产生纤维素酶,如牛的胃、木蠹蛾的 唾液和蜗牛的胃液等都含有丰富的纤维素酶（Duan CJ,Feng JX.,2010,Mining  metagenomes for novel cellulase genes.Biotechnol Lett.32(12):1765-75.）。

纤维素酶是能够将纤维素降解成葡萄糖的一组酶的总称，它是一类复杂水 解酶的复合物，称为纤维素酶系（宋波，邓晓莑，2003，纤维素酶的研究进展， 22（7）：419-495.）。一般可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖 苷酶。（1）内切葡聚糖酶：是从纤维素分子非结晶区域羧甲基纤维素水解产生 大量小分子纤维素；（2）外切葡聚糖酶是从纤维素链末端水解产生纤维二糖分 子；（3）β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖分子和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。学者 普遍认为：纤维素被纤维素酶彻底水解是这三种酶协同作用的结果（Kudo H, Cheng KJ,Costerton JW,1987,Electron microscopic study of the methylcellulose -mediated detachment of cellulytic rumen bacteria from cellulose fibers,33: 267-270.）。

目前，纤维素酶已经被广泛地应用于多个领域，主要有食品、酿酒、环保、 饲料加工、纺织、农业、日化等方面。在水果和蔬菜加工中由于植物细胞壁的 主要成分是果胶、纤维素和半纤维素等，因此，在水果与蔬菜加工的过程中适 当使用纤维素酶，可将纤维素水解成葡萄糖等有效成分。另一方面，还可使植 物细胞壁发生不同程度变化，如软化、膨胀、崩溃等，提高果蔬的可消化性， 并使其口感更好；在白酒及其酒精生产中以纤维素为原料发酵生产酒精，使用 的是二段法，即先用纤维素酶将纤维素糖化，再经酵母发酵成酒精；在茶叶加 工中用酶法低温抽提，即先用纤维素酶将茶叶的细胞壁裂解抽提其中的有效成 分，最后将含有有效成分的抽提液浓缩干燥便可制成可溶性茶。与传统的热浸 提法相比，此方法可提高有效成分的得率，同时还可保持茶叶原有的色香味； 在活性物质的提取中，如淀粉、蛋白质、活性多糖等物质的提取过程中，加入 纤维素酶能大幅提高产品的收率（杜翠娇，任河，杜建敏等，2011，纤维素酶 及其应用，食品工程，2：6-7.）

以内切葡聚糖酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现69 项发明专利。其中有23项发明专利是描述编码内切葡聚糖酶的基因及其应用， 而其他46项是与内切葡聚糖酶在各种领域上的应用有关。在这23项与编码内 切葡聚糖酶的基因及其应用相关的发明专利中的内切葡聚糖酶基因分别来自于 各种细菌、霉菌、未培养微生物或人工合成的，在这23项专利中还没有一个内 切葡聚糖酶基因是来自于链霉菌的。

发明内容

本发明从广西南宁筛选到的链霉菌GX6的基因组中克隆到一个来自链霉菌 的内切葡聚糖酶基因，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产内切葡聚糖酶， 并能以纤维素为原料降解生成葡萄寡糖。

本发明涉及一个来自链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B，具有序列表中SEQ ID NO：1所述的碱基序列，是从链霉菌GX6的基因组中克隆得到。该内切葡 聚糖酶基因Cel5B的序列是由1389个碱基组成，含有完整的内切葡聚糖酶基因 Cel5B的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF），Cel5B基因的起始密码子为 ATG，终止密码子为TGA。

SEQ ID NO：2的蛋白质是基因Cel5B编码的内切葡聚糖酶产物Cel5B，由 462个氨基酸组成，和Cel5B催化功能域同源性最高的是与Streptomyces sp.e14 （链霉菌e14）的endoglucanase CelA（内切葡聚糖酶CelA），两者的一致性= 402/467(86%),相似性=419/467(90%)。

基因Cel5B在大肠杆菌中表达的重组产物Cel5B能够分解纤维素。

本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。

本发明提供了一个来自链霉菌的内切葡聚糖酶基因，该基因所编码的内切 葡聚糖酶具有分解纤维素的用途。

附图说明

图1是筛选含有内切葡聚糖酶基因Cel5B重组菌株的CMC选择平板图。

图2是内切葡聚糖酶Cel5B的SDS-PAGE图。

从图1了解到，含有内切葡聚糖酶基因Cel5B的重组菌株能够在CMC选平 板上形成透明圈。

图2了解到，内切葡聚糖酶Cel5B纯化物的分子量为49.2kDa。

具体实施方式

下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的 目的。

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌（Escherichia coli）株系 XL1-blue（购自TaKaRa公司），表达载体pQE30和表达宿主M15（购自Qiagen 公司），CMC（carboxylmethylcellulose，羧甲基纤维素钠，购自Sigma公司）以 及购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。

下面将通过实施例对本发明作详细描述：

1）链霉菌Streptomyces GX6基因组DNA的提取

链霉菌Streptomyces GX6的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组 DNA提取试剂盒Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit（目录号BSC12S1） 的使用说明来提取的。

将提取好的链霉菌Streptomyces GX6的基因组DNA送华大基因公司测定基 因组序列。

2）链霉菌Streptomyces GX6的基因组序列中编码内切葡聚糖基因序列的分析

将获得的链霉菌Streptomyces GX6的基因组序列用NCBI（National Center  for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上的软件ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和 Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行分析。结果共获得3个与内切葡聚 糖酶具有较高同源性的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），本发明只涉 及其中一个ORF。

3）内切葡聚糖酶基因Cel5B的核苷酸序列分析

基因Cel5B的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）由1389个核苷酸组 成，序列如SEQ ID NO：1。其中，Cel5B基因的起始密码子为ATG，终止密码 子为TGA。

4）内切葡聚糖酶基因Cel5B编码的产物Cel5B的氨基酸序列分析

内切葡聚糖酶基因Cel5B编码一个含462个氨基酸的蛋白质，用DNAStar 软件预测该蛋白质的理论分子量大小为49255.09道尔顿。

用简单组件结构研究工具（Simple Modular Architecture Research Tool, SMART,http://smart.embl-heidelberg.de）分析内切葡聚糖酶Cel5B的组件结构， 结果是自N端的1－32位氨基酸残基为信号肽序列、36－136位氨基酸残基为 碳水化合物结合功能域II（CBD_II）、166－424位氨基酸残基为纤维素酶功能域 （Pfam：Cellulase）。

5)内切葡聚糖酶基因Cel5B的克隆和表达

使用上游引物5’-ATAGGATCCGCCACCGGCTGCCGGGTCGACTACAC -3’（含有BamHI位点）和下游引物5’-AGTAAGCTTTCAGTTGGTGGGGAA GTTGTCCGGAG-3’（含有HindIII位点），通过聚合酶链式反应（PCR）扩增内 切葡聚糖酶基因Cel5B，用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切内切葡聚糖酶基 因Cel5B后，与经BamHI和HindIII酶切的表达载体pQE30进行连接。再将连 接产物用CaCl₂法转化到大肠杆菌XL1-blue中，涂布到含100μg/mL氨苄青霉素 的LA平板上。转化得到的单菌落点板至含有100μg/mL氨苄青霉素和0.5% （W/V）CMC（羧甲基纤维素钠）的LA平板上，将平板置于37℃恒温箱培养 5小时，对每个转点菌落逐个滴加1μl1%（W/V）的IPTG诱导表达，然后将平 板置于37℃恒温箱继续培养5小时。时间到后，进行氯仿熏蒸破胞，再把平板 置于37℃恒温箱使表达的Cel5B酶与CMC反应8小时。用0.1%的刚果红溶液 染色15分钟后，再用1M的NaCl溶液脱色。观察选择平板。

然后进一步提取在选择平板上能形成透明圈的克隆子的质粒DNA，并将其 命名为pQE-Cel5B，用限制性内切酶BamHI和HindIII完全酶切pQE-Cel5B后， 进行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，结果pQE-Cel5B除有一个约3.4kb的DNA片 段外，还有一条大小约为1.3kb的DNA片段。

将质粒pQE-Cel5B用CaCl₂法转化入大肠杆菌表达宿主M15中，涂布到含 100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LA平板上。挑取转化得到的单 菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃ 振荡培养，待OD₆₀₀为0.4时，加入IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，37℃、180 转诱导8小时。11000rpm离心3min，收集菌体，用4mL pH7.0100mmol/L的 磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000rpm离心20min，取上清进行 后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入1mL50%的镍亲和层析胶体，在4℃ 用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加1mL冲洗缓冲液（50 mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0）到柱子里，缓 慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液（50mmol/LNaH₂PO₄， 300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH8.0）洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质 溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证，发现有目的大小的蛋 白质条带。

6)内切葡聚糖酶Cel5B酶活力的测定

取2μl内切葡聚糖酶Cel5B的纯化物，加入250μl100mmol/L的pH7.0磷酸缓 冲液，与250μl2％CMC溶液混合，在37℃作用10分钟后，加入1000μl DNS溶液， 放置沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD₅₃₀。吸光度测定值 与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。所述DNS试剂配制： 称取1克NaOH用约40mL ddH₂O溶解，再称取1克二硝基水杨酸、0.2克苯酚、0.05 克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30mL ddH₂O中，两种溶 液混合，定容到100mL。

内切葡聚糖酶的酶活力单位（IU）定义为：每分钟催化产生1μmol还原糖 所需的酶量。内切葡聚糖酶的比活力的定义：每mg蛋白质所含的酶活力（U/mg）。 内切葡聚糖酶Cel5B的水解CMC比活力为28.4U/mg。