一种基于固定化酶的毛细管电泳柱后检测接口

摘要

本发明提供了一种基于固定化酶的毛细管电泳柱后检测接口，包括检测接口盖、透明窗片和位于检测接口盖和透明窗片之间的密封垫片，所述密封垫片上设有镂空的反应通道，所述检测接口盖与密封垫片之间设有盖在所述反应通道上的固定化酶的膜，且检测接口盖设有分别与反应通道两端相通的反应液入口和废液出口，所述检测接口上还设有与所述反应通道相通并用于插入毛细管的毛细管接口，所述毛细管接口位于反应通道的反应液入口，该检测接口能显著减少酶的用量，提高酶的稳定性和活性，能有效防止反应通道中死体积和稀释效应的产生，提高检测灵敏度，为固定化酶的毛细管电泳柱后检测提供了一个理想的检测接口，可用于酶催化反应的毛细管电泳柱后检测。

说明书

技术领域

本发明涉及毛细管电泳技术领域，特别涉及一种基于固定化酶的毛细管电泳柱后检测接口。

背景技术

毛细管电泳是20世纪80年代发展起来的一种新兴分离技术，其具有高效、快速、消耗量低等优点，已成为近年来分析化学最活跃的研究方向之一。从技术水平来说，毛细管电泳已经发展为不同的分离模式，从而满足不同性质样品在管内的最佳分离。常用的毛细管分离模式有：毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管电色谱。毛细管的进样量在纳升级，非常适用于微量生物样品的分析，但同时也对检测的灵敏度提出了更高的要求。虽然激光诱导荧光，质谱等检测技术满足了毛细管电泳检测的要求，但是昂贵的仪器价格和复杂的检测程序限制了它们的应用范围。将具有独特高催化效率的酶应用到毛细管电泳中放大检测信号提高灵敏度，已得到越来越多的关注。

酶催化反应在毛细管电泳中的应用可分为三种模式：柱前、在柱、柱后酶反应。柱前酶反应模式中，游离酶和固定化酶放入样品小管中，酶催化反应在样品进入毛细管前发生，毛细管只用作分离通道。这种方法酶消耗量较大，尤其是采用游离酶，酶一次性使用不能回收，造成了试剂的浪费。在柱酶反应模式中，酶填充到毛细管中，酶反应和分离过程同时在毛细管中进行。自从1992年，Bao等（Bao J.；Regnier F. E. J. Chromatogr. 1992，608，217）首次将游离酶应用到毛细管电泳在柱酶反应体系中，在过去20年里涌现了大量关于各种在柱游离酶反应在毛细管电泳中应用的报道。此外，酶也可以固定在毛细管柱中。例如，Tang等（Tang Z. M.；Kang, J. W. Anal. Chem. 2006，78，2514）采用离子键合技术固定血管紧张素转换酶在毛细管入口端筛选治疗高血压和糖尿病的药物。Wojcik 等（Wojcik，R.； Vannatta，M.；Dovichi，N. J. Anal. Chem. 2010，82，1564）将碱性磷酸酶固定在第一根毛细管末端设计的二维毛细管电泳，简化了样品在两维间的处理。但是由于毛细管内壁十分狭小，需要使用复杂的固定技术，并且这种在柱酶反应技术往往不能同时满足酶反应和毛细管电泳分离的最佳条件，电泳时毛细管内产生的焦耳热严重影响了酶的活性和稳定性。不稳定的酶反应产物（如化学发光检测中使用的活性氧，电化学检测中使用的自由基），由于其反应后易分解丧失检测活性不能采用以上两种模式进行分析。同时，这两种模式中酶反应有关的共反应剂和反应产物增加了毛细管电泳分离的负担。柱后酶反应模式中，酶载入柱后反应池中，在毛细管出口端与底物反应立即产生检测信号，避免了因不稳定产物和电泳过程产生的弊端。但这种模式多使用游离酶，由于分离和检测步骤带入杂质，酶溶液不能回收，大量游离酶的使用造成了不可避免的试剂浪费。

为了进一步扩展酶催化检测在毛细管电泳中的应用，设计了基于固定化酶的毛细管电泳柱后检测接口。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛细管电泳柱后固定化酶检测接口，解决了现有技术中显著使用游离酶造成酶试剂浪费，酶稳定性差、活性低的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

基于固定化酶的毛细管电泳柱后检测接口，所述检测接口包括检测接口盖、透明窗片和位于检测接口盖和透明窗片之间的密封垫片，所述密封垫片上设有镂空的反应通道，所述检测接口盖与密封垫片之间设有盖在所述反应通道上的固定化酶的膜，且检测接口盖设有分别与反应通道两端相通的反应液入口和废液出口，所述检测接口上还设有与所述反应通道相通并用于插入毛细管的毛细管接口，所述毛细管接口位于反应通道的反应液入口端。 

该检测接口适用于柱后检测，提高了酶的稳定性，同时降低酶在流动检测体系的消耗。该检测接口可用于各种毛细管电泳分离模式，包括毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管电色谱，同时也可与各种酶反应相关的检测器联用，如激光诱导荧光检测器、紫外可见吸收光谱检测器、电化学检测器。

优选的，所述反应通道容纳的体积为2.5 μL~10μL。

为了提高检测的灵敏度，所述反应通道为条形，且两端呈圆弧形，能有效减少液体积存。

优选的，所述反应通道为高为0.01 ~ 0.05 cm，长为1.5 cm~3.0 cm，宽为0.10 cm~ 0.15 cm。

优选的，所述反应液入口与废液出口之间的距离与反应通道长度一致，反应液入口与废液出口的直径为0.05 cm~0.10 cm。

优选的，所述检测接口盖的材料为聚四氟乙烯。

优选的，所述密封垫片（2）为弹性材料。

更优选的，所述弹性材料为硅胶或橡胶。

优选的，所述透明窗片为透明无色有机玻璃。

本发明中，固定化酶膜可以使用常规的酶固定化技术，如交联法和结合法等，将水溶性酶或不溶于水的酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，经化学方法处理后，固定于反应通道上方。

优选为，固定化酶膜的制作过程如下：将酶溶液滴加到醛基活化的UltraBind膜（长宽与检测通道一致）上，酶上的氨基与UltraBind膜上的醛基形成可逆的Schiff碱，然后再滴加还原试剂使酶与UltraBind膜之间形成牢固的共价键，然后晾干后即可使用。

本发明的有益效果：（1）本发明的基于固定化酶的毛细管电泳柱后检测接口最大程度地降低了酶在流动检测系统中的消耗，显著增强酶的稳定性和活性，从而有效提高检测灵敏度。（2）本发明设计的柱后固定化酶反应通道体积小，最低加入体积为2.5 μL，无稀释效应及死体积存在。酶反应一经发生就立即被检测到，适用于不稳定酶反应产物的检测。同时，柱后酶反应模式避免了柱前、在柱酶反应中焦耳热及分离组分复杂对整个体系的影响。（3）本发明的毛细管电泳柱后固定化酶检测接口装置可用于毛细管电泳各种分离模式，包括毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管电色谱，同时也可与各种酶反应相关的检测器联用，如激光诱导荧光检测器、紫外可见吸收光谱检测器、电化学检测器。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明的毛细管电泳柱后固定化酶检测接口的结构示意图（1：检测接口盖，2：密封垫片，3：透明窗片，4：固定化酶的膜，5：毛细管）。

图2为含本发明检测接口的毛细管电色谱化学发光装置图（6：检测接口，7：微流注射泵，8：铂电极，9：缓冲液蓄池，10：废液池，11：光电倍增管，12：暗盒）。

图3为本发明的检测接口毛细管出口端酶催化的化学发光原理图（HRP：辣根过氧化物酶；BPB：溴酚蓝，1：检测接口盖，2：密封垫片，3：透明窗片，4：固定化酶的膜，5：毛细管）。

图4为本发明的检测接口运用到毛细管电色谱化学发光中检测甘氨酸的工作曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

基于固定化酶的毛细管电泳柱后检测接口，如附图1所示，包括检测接口盖1、透明窗片3和位于检测接口盖和透明窗片之间的密封垫片2，检测接口盖1使用聚四氟乙烯最佳，密封垫片2上设有镂空的反应通道，检测接口盖1与密封垫片2之间设有盖在反应通道上的固定化酶的膜4，且检测接口盖1设有分别与反应通道两端相通的反应液入口和废液出口，在检测接口上还设有与所述反应通道相通并用于插入毛细管5的毛细管接口，毛细管接口位于反应通道的反应液入口端。 

为了提高检测的灵敏度，避免稀释效应及死体积存在，反应通道设置为条形，并将条形两端呈圆弧形，体积优选为2.5 μL~10 μL，更优选为4.5 μL，反应通道高为0.01 cm~0.05 cm，长为1.5 cm~3.0 cm，宽为0.10 cm~0.15 cm。进一步，将检测接口盖1上的反应液入口与废液出口之间的距离与反应通道的长度一致，反应液入口与废液出口的直径为0.05 cm~0.10 cm，优选为0.08 cm。密封垫片具有将反应池封闭的作用，选用弹性材料密封效果更好，硅胶或橡胶制成的密封垫片最佳。透明窗片选用透光性的材料，优选为透明无色的有机玻璃。为了使检测接口能够配合现有的仪器使用，可以将检测接口的大小设置与现有仪器匹配的尺寸。本实施例将检测接口盖1设置为长4.0 cm，宽为2.5 cm，厚度为0.8 cm；透明窗片3的长为4.0 cm，宽为2.5 cm，厚度为0.3 cm。

实施例2

毛细管电色谱化学发光装置，如图2所示，将毛细管5与检测接口的毛细管接口连接，以修饰了纳米金的毛细管的毛细管电色谱柱为例，将长为60 cm，内径为75 μm的毛细管电色谱柱一端用火烧掉0.5 cm的聚丙酰亚胺涂层，插入检测接口反应通道，毛细管电色谱柱另一端放入缓冲液蓄池9中。然后将检测接口6置于光电倍增管11上方，并使透明窗片3的面与光电倍增管11检测面接触，再将检测接口6和光电倍增管11都置于密闭的暗盒12中，以避免外界光线的干扰。检测接口6的反应液入口与微流注射泵7连接；废液出口与废液池10连接，将缓冲液蓄池9与废液池10之间放入铂电极8，整个流通系统中用聚四氟乙烯管接通，内径优选为0.08 cm。电泳时通过铂电极8在毛细管电色谱柱的两端形成电压，由于不同物质的带电量不同，从而达到分离物质的效果。

实施例3

毛细管电色谱化学发光装置检测甘氨酸：

固定化酶纸膜制备方法如下：将30 μL浓度为5.0 mg/mL辣根过氧化物酶溶液滴加到醛基活化的UltraBind膜（2.7 cm × 0.20 cm）上，在湿润的环境下室温放置2h，然后滴加1.0 mg/mL NaCNBH₃ 溶液，室温下反应40 min后取出晾干。制作好的酶纸膜用双面胶紧贴于聚四氟乙烯盖内侧中心。毛细管电色谱柱固定于酶纸膜下方，毛细管出口伸入反应通道0.5 cm；各部分通过螺丝紧紧固定在一起，形成一个约为4.5 μL的反应通道。

检测时，将光电倍增管的工作电压设置为-800 V，微流注射泵以20 μL/min的流速将含6.2 μM溴酚蓝的磷酸缓冲液（12 mM，pH 9.0）导入到反应通道中，作为固定化酶反应的共反应剂。含0.75 mM过氧化氢的磷酸缓冲液（5.0 mM，pH 8.5）作为毛细管分离缓冲液，盛入缓冲液蓄池9，通过12 KV的电压差产生的电泳驱动力进入毛细管中。待化学发光信号基线稳定后，通过20 cm高度差的重力驱动进样15 s完成毛细管进样。在反应通道入口处，甘氨酸和含过氧化氢的磷酸缓冲液从毛细管柱中流出与共反应剂反应，在固定化辣根过氧化物酶的催化下产生化学发光信号，其检测原理如附图3所示。光信号一经发射就能立即被光电倍增管11捕捉到，并将其转换为电信号。

样品预处理：甘氨酸本身不能发生化学发光，检测中采用乙二胺催化法使用N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺衍生甘氨酸，使甘氨酸分子带上化学发光属性基团。具体步骤为：（1）将200 μL 0.50 mM的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺加入到同体积的0.50 mM的N, N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶液中，混合溶液经涡流混合后于室温下反应2小时。（2）将100 μL甲醇溶解的样品与20 μL的0.15 M 乙二胺甲醇溶液一起加入到步骤（1）反应得到的溶液中，同样经涡流混合后于室温下再反应2小时，得检测样品。然后将检测样品用水稀释10倍后按上述的方法重力进样。

在上述实验方法和条件下，测定了浓度为0.5 μM、1 μM、10 μM、30 μM、50 μM、100 μM和200 μM的甘氨酸标准溶液，结果如图4所示。结果表明，甘氨酸浓度在0.5 μM~200 μM范围内与化学发光峰高呈良好的线性关系，拟合线性回归方程为：I (a. u.) = 66.15 C (μM) + 812.84 (R² = 0.9921)，I代表化学发光强度，C代表甘氨酸的浓度，其检测限（S/N=3）为0.12 μM。连续五次检测50 μM 甘氨酸，甘氨酸的迁移时间和出峰强度的相对标准偏差分别为7.5%和5.4%，显示了该方法良好的重复性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明。