附子或川乌总生物碱提取物的制备方法

摘要

附子或川乌总生物碱提取物的制备方法。将含有附子或川乌提取物的水溶液，用大孔吸附树脂吸附后，用水或pH8~10的碱性水溶液洗涤除杂质后，至少用pH≤5和乙醇体积含量为50~90%的酸性乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，即得到附子或川乌总生物碱提取物。由所说提取物的粗品采用该方法制备纯化的提取物，既能达到除杂完全，又不损失和破坏所需的生物碱成分，而且对相应生物碱成分洗脱充分，回收率高，有效解决了传统方法生物碱损失严重的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种附子或川乌总生物碱提取物的制备方法，特别是对由各种方法得到的附子或川乌总生物碱提取物粗品制备其纯化提取物产品的方法。

背景技术

    附子、川乌为常用中药，分别为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根和母根，其主要有效成分为多种生物碱成分，包括双酯型生物碱（乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等）、单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等）和醇胺型生物碱（乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱）等。

目前对附子或川乌中生物碱成分已有报道和/使用的分离纯化方法，均为将其水煎液或其水溶液经大孔吸附树脂柱吸附后，先用水洗脱除杂，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，得到经分离纯化后的附子或川乌的总生物碱成分。如赵镭等报道，将附子提取物通过D101大孔吸附树脂纯化，水、体积分数为10%、80%的乙醇溶液梯度洗脱，收集体积分数为10%的乙醇洗脱部分浓缩干燥，即得附子总生物碱（附子总生物碱的提取纯化工艺，沈阳药科大学学报，2007,24(7):433）。万里翔等报道，将附子提取物上D101大孔吸附树脂柱，以蒸馏水除杂，再用95%乙醇洗脱，浓缩蒸干洗脱液，即得附子总生物碱（乌头总碱的纯化工艺及中乌头碱的纯化研究，安徽农业科学，2008,36(12):5044）。吴平报道了一种附子生物碱的提取分离纯化方法，将生附子用酸水提取，提取液经大孔树脂柱吸附，先用水洗去杂质，再用60%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，经进一步处理得到附子生物碱提取物（成都中医药大学硕士学位论文，2007年）。

申请人经研究发现，对附子或川乌的水煎液，或其乙醇等其它溶剂提取物的水溶液，采用大孔吸附树脂柱分离纯化时，经水洗脱除杂后，再用30~95(v)%的含水乙醇洗脱（解吸附），均不能充分洗脱回收相应的生物碱成分，导致生物碱的损失严重，损失率可达30~50%，浪费了药材资源，也影响了附子或川乌药效作用的充分发挥。

发明内容

    鉴于此，本发明提供了一种附子或川乌总生物碱提取物的制备方法，特别是对由各种方法得到的附子或川乌总生物碱提取物粗品制备其纯化提取物产品的方法。

    本发明附子或川乌总生物碱提取物的制备方法，是将含有附子或川乌提取物的水溶液，用大孔吸附树脂吸附后，先用水或pH 8~10的碱性水溶液洗涤除杂质后，至少用pH≤5和乙醇体积含量为50~90%的酸性乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，即得到附子或川乌总生物碱提取物。其中，所说的大孔吸附树脂，可以按照目前常规的方式操作，如选择常用的HPD100、HPD300、D101、AB-8等各种型号的大孔树脂，其中优选HPD100或D101等型号的大孔吸附树脂。

上述所说的含有附子或川乌提取物的水溶液，可以为附子或川乌的水提取液，或是其它各种来源的含有附子或川乌提取物成分的水溶液，特别是由不同的有机溶剂对附子或川乌提取并除去溶剂后的提取物配制的水溶液。

实验显示，用大孔树脂进行吸附处理的所说含有附子或川乌提取物的水溶液，优选为使溶液中所说的提取物含量为不超过相当于1克生药/毫升的量。

上述制备方法中，洗涤除杂质时的以采用碱性水溶液为佳，除优选为工业生产中最为常用和易得的氢氧化钠或碳酸钠的水溶液外，也可以使用药物中允许使用的其它碱性成分的水溶液。

基于同样理由，上述制备方法中，所说的酸性乙醇溶液，除优选以工业生产中最为常用和易得的盐酸进行酸化的乙醇-水溶液外，也可以使用药物中允许使用的其它酸性成分进行酸化。

上述制备方法中，另一种优选的方式是，可采用先用酸性乙醇-水溶液洗脱，最后再用中性乙醇-水溶液洗脱，即先采用酸性（特别是酸性较强的）乙醇-水溶液洗脱，使大孔吸附树脂柱呈酸性后，最后再改用中性乙醇洗脱。

所收集的洗脱液，除上述可直接除去乙醇等溶剂后，得到所说的提取物（或含有附子或川乌总生物碱相应酸盐）外，还可以采用的其它方式包括，将所说收集的洗脱液先用医药中允许使用的碱性成分（可优选氢氧化钠或碳酸钠、碳酸氢钠等）调节至pH值5~7后，再进行除去溶剂的操作；或者是将所说收集的洗脱液用碱型阴离子交换树脂，如选择目前已有广泛报道和/使用的717、D201、D202、711、D301、D311、D318等型号的碱型阴离子交换树脂处理后，再进行除去溶剂的操作。

实验结果表明，本发明上述制备方法与目前传统方法比较，特别是采用碱性水溶液洗脱除杂时，既能充分除去杂质，又不会明显损失或破坏所需要的生物碱成分，而且用酸性乙醇-水溶液对吸附树脂进行洗脱，能使相应的生物碱成分被充分洗脱，回收率高，有效避免了传统方法的生物碱损失严重问题，大大节省了药材资源，提高了药材的利用率，使附子或川乌的药效作用得以更充分的利用和发挥。

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1

取生附子10kg，加水10倍，浸泡4小时，煎煮2小时，滤过，水煎液备用；药渣再加水8倍，煎煮1小时，滤过，合并水煎液，按常规方法上HPD100型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除杂后，再用pH 2~3的70(v)%（以下同）盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，用氢氧化钠溶液调节pH 值至6~7，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得附子总生物碱提取物。

实施例2

取生附子10kg，加水12倍，浸泡2小时，煎煮3小时，滤过，水煎液备用；药渣再加水10倍，煎煮2小时，滤过，合并水煎液，上HPD100型大孔吸附树脂柱，先用pH值9~10的氢氧化钠溶液洗脱除杂，再用pH 2~3的70%盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，上717碱型阴离子交换树脂柱，收集乙醇流出液，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得附子总生物碱提取物。

实施例3

取制附片10kg，加水10倍，煎煮2次，每次2小时，滤过，合并水煎液，上D101型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除杂，再用pH 4~5的90%盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得附子总生物碱提取物。

实施例4

取黑附片10kg，加水12倍，煎煮2次，每次3小时，滤过，合并水煎液，上HPD300型大孔吸附树脂柱，先用pH值8~9的氢氧化钠溶液洗脱除杂后，再用pH 2~3的60%盐酸乙醇-水溶液洗脱，至流出液呈酸性时，改用中性60%乙醇-水洗脱，收集酸乙醇和乙醇洗脱液，加氢氧化钠溶液调节pH 值至5~7，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得附子总生物碱提取物。

实施例5

取白附片10kg，加70(v)%乙醇10倍，回流提取2次，每次2小时，滤过，合并乙醇提取液，减压回收除尽乙醇，浓缩物用水溶解，配制成含量不超过相当于1克/毫升生药的水溶液，滤过，上D101型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除杂，再用pH 4~5的80%盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得附子总生物碱提取物。

实施例6

取制川乌10kg，加水12倍，煎煮2次，每次2小时，滤过，合并水煎液，上HPD100型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除杂，再用pH 2~3的50%盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，加氢氧化钠溶液调节pH 值至5~6，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得川乌总生物碱提取物。

实施例7

取生川乌10kg，加水8~10倍，煎煮2次，每次3小时，滤过，合并水煎液，上HPD300型大孔吸附树脂柱，先用pH值8~10的氢氧化钠溶液洗脱除杂后，再用pH 1~2的70%盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，上D201碱型阴离子交换树脂柱，收集乙醇流出液，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得川乌总生物碱提取物。

实施例8

取生川乌10kg，加80(v)%乙醇8倍，回流提取3次，每次2小时，滤过，合并乙醇提取液，减压回收除尽乙醇，浓缩物用水溶解，配制成pH 3~4、含量不超过相当于1克/毫升生药的水溶液，滤过，上AB-8型大孔吸附树脂柱，先用pH值8~10的氢氧化钠溶液洗脱除杂后，再用pH 0.5的60%盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，上D301碱型阴离子交换树脂柱，收集乙醇流出液，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得川乌总生物碱提取物。

以下通过有效成分的含量和药效作用为评价指标，进一步说明本发明附子或川乌总生物碱提取物的制备方法所具有的有益效果。

1、有效成分的含量测定

取生附子3kg，加水10倍，浸泡4小时，煎煮2小时，滤过，水煎液备用；药渣再加水8倍，煎煮1小时，滤过，合并水煎液，分成3等份，按常规方法分别上3根完全相同的柱床体积为1.5L的HPD100型大孔吸附树脂柱（A、B、C）：

A柱：采用常规方式，先用2倍柱床体积的水洗脱除杂，再用70%乙醇-水溶液洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，备用（A液）；

B柱：采用上述实施例1的方式，先用2倍柱床体积的水洗脱除杂，再用pH 2~3的70%盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，用氢氧化钠溶液调节pH 值至6~7，备用（B液）；

C柱：采用上述实施例2的方式，先用2倍柱床体积的pH值9~10的氢氧化钠溶液洗脱除杂，再用pH 2~3的70%盐酸乙醇溶液洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，上717碱型阴离子交换树脂柱，收集乙醇流出液，备用（C液）。

按中国药典2010年版一部177页附子项下的HPLC色谱方法，分别测定上述A液、B液、C液中生物碱成分的含量（以生药计），结果见表1。

另取黑附片3kg，加水12倍，煎煮2次，每次3小时，滤过，合并滤液，分成3等份，按常规方法分别上3根完全相同的柱床体积为1.5L的HPD100型大孔吸附树脂柱（D、E、F）：

D柱：同A柱方式，先用2倍柱床体积的水洗脱除杂，再用70%乙醇-水溶液洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，备用（D液）；

E柱：同B柱方式，先用2倍柱床体积的水洗脱除杂，再用pH 2~3的70%盐酸乙醇-水溶液洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，用氢氧化钠溶液调节pH 值至6~7，备用（E液）；

F柱：同C柱方式，先用2倍柱床体积的pH值9~10的氢氧化钠溶液洗脱除杂，再用pH 2~3的70%盐酸乙醇溶液洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，上717碱型阴离子交换树脂柱，收集乙醇流出液，备用（F液）。

分别测定上述D液、E液、F液中生物碱成分的含量（以生药计），结果见表1。

表1  A～F洗脱液中生物碱成分的含量测定结果（mg·g^-1,以生药计）

生物碱苯甲酰乌头原碱苯甲酰次乌头原碱苯甲酰新乌头原碱乌头碱次乌头碱新乌头碱A 液0.1210.3920.853———B 液0.1670.4341.579———C 液0.1620.4361.571———D 液0.0610.1220.1810.0150.940.031E 液0.0830.1360.3480.0210.1030.059F 液0.0810.1380.3450.0200.1040.058

注：“—”为未检出。

由表1可见，酸乙醇洗脱（解吸）的效果显著优于中性乙醇洗脱，碱水洗脱除杂对生物碱成分无明显影响。

2、抗寒冷、耐缺氧实验

将上述D液、E液、F液减压回收乙醇，浓缩至清膏，备用。参照文献（李立纪等，中药药理与临床，2005，21(6)：31-33）方法进行药效实验。

2.1抗寒冷实验

小鼠80只雌雄各半，随机分成5组，连续给药5天，未次给药后1小时放入冰箱冷冻室中，-10℃半小时，观察其死亡只数，结果见表2，表明本发明制备方法得到的附子总生物碱提取物（E、F提取物）具有更好的抗寒冷作用。

表2    附子提取物对小鼠耐寒冷的影响

组  别剂量(g生药/Kg)试验鼠数(只)死亡鼠数(只)存活率(%)对  照—201335D提取物20201050E提取物2020575F提取物2020670

2.2 耐缺氧实验

小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，连续给药5天，未次给药后1小时，断头观测其张口呼吸的时间，结果见表3，表明本发明制备方法得到的附子总生物碱提取物具有更好的耐缺氧作用。

表3   附子提取物对小鼠断头张口呼吸时间的影响（x±s）

组  别剂量(g生药/Kg)试验鼠数(只)呼吸时间(秒)对  照—1019.7±4.23D提取物201021.5±3.41E提取物201026.1±3.97^**F提取物201024.9±3.04^*

注：与对照组比较^*P＜0.05, ^**P＜0.01。

3、镇痛、抗炎实验

将上述A液、B液、C液减压回收乙醇，浓缩至清膏，备用，进行下述药效实验。

取小鼠40只，雌雄各半，随机分成5组，即正常对照组、A提取物组、B提取物组和C提取物组。各组按表4剂量给药3天，未次给药后1h腹腔注射1%酒石酸钠0.2ml/只，观察其扭体次数，结果见表4，表明本发明制备方法得到的附子总生物碱提取物（B、C提取物）具有更好的镇痛作用。

表4   附子提取物镇痛实验结果

组  别剂量(g生药/Kg)试验鼠数(只)扭体次数(次)正常对照—1029±9.7A提取物121019±9.3^*B提取物121011±5.1^***C提取物121013±7.6^***

注：与对照组比较^*P＜0.05, ^**P＜0.01, ^***P＜0.001。

另取雄性小40只，随机分成5组，即正常对照组、A提取物组、B提取物组和C提取物组。各组按表5剂量给药3天，末次给药后40分钟给小鼠左耳均匀涂布二甲苯0.05ml/只，在致炎后30分钟处死动物，用直径为8mm的不锈钢冲子取下左右相同部位耳片，称重，按下式计算肿胀度和肿胀抑制率，结果见3，表明本发明制备方法得到的附子总生物碱提取物具有更好的抗炎作用。

肿胀度 =（左耳片重 – 右耳片重）

表5    附子提取物抗炎作用实验结果

组  别剂量(g生药/Kg)试验鼠数(只)肿胀度(mg)抑制率(%)正常对照—1011.03±2.41—A提取物12108.07±3.65^*26.8B提取物12106.45±2.47^***41.5C提取物12106.69±2.62^***39.3

注：与对照组比较^*P＜0.05, ^**P＜0.01, ^***P＜0.001。

上述的实验结果充分表明，采用本发明方法制备得到的附子、川乌总生物碱提取物，能很好地保留附子、川乌提取物中生物碱成分，避免了现有技术方法对生物碱成分的严重损失。进一步药效学实验更清楚地表明，采用本发明方法制备得到的附子提取物，在抗炎、镇痛、抗寒冷、耐缺氧等方面，能具有更好的药效作用，临床上可应用于寒湿痹痛、类风关、以及心衰、回阳救逆等，具有广阔的应用前景。