运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增ACE基因的引物混合物；所述扩增后试剂包括：基因分型标准物和内标。本发明以上述基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，大大节约了人力物力和时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术 领域。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术 在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是历史必然、 大势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行 运动选材已经有了初步进展。

目前人们普遍认为ACE（血管紧张素转化酶）水平和心血管的形态、功能密切相关。ACE 基因的多态性是人耐力素质优劣的决定性因素之一，其作为一个有价值的遗传标志，有望成 为科学选材的理想指标。

肾素―血管紧张素系统（RAS）在心血管系统中作用显著，如调节血压、血容量、血管 张力，引起血管壁增厚或心肌细胞肥大和非心肌细胞的增殖，是血压和体液、电解质平衡的 主要调节因素之一。ACE是RAS酶/底物链反应体系中的关键酶，ACE的作用是催化十肽血 管紧张素I（Ang I）转变为八肽的血管紧张素II（Ang II）。ACE的水平决定着RAS中Ang II 的生成量。临床上认为ACE为高血压的致病因素之一。

分子遗传学研究发现ACE基因位于第16内含子的一段287bp的Alu序列的插入（I）/ 缺失（D）有多态性，使ACE基因有三种基因型：II(插入纯合型)、ID（插入/缺失型）和DD （缺失纯合型）。I使人体血液中的ACE水平较低，形式D起相反作用。II型的人，其耐力 比拥有两个D基因的人要强。I基因能增强肌肉吸收氧和营养成份的能力，助于增强人的有 氧耐力。有实验证明在不同基因型的个体中，机体局部耐力机能的改善有明显的个体差异： 在对训练的敏感度上，II纯合子比DD纯合子大l1倍。

目前常用的基因检测方法有：直接测序（direct sequencing,DS）、连接酶检测反应（ligase  detection reaction，LDR）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length  polymorphism，RFLP）、变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid  chromotography，DHPLC）、定量PCR。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不 易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。

采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带不同荧光标记物的引物对运动机能相关基 因ACE特异性的扩增，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对该运动机 能相关基因位点的检测，灵敏度高、判读清晰准确、采样方便。

发明内容

本发明目的是提供一种运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法。

本发明所述的运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒，包括扩增试剂和扩增后的基因分 型用试剂；

所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及 超纯水；

所述扩增后试剂包括：内标和用于基因分型的基因分型标准物；

使用所述的试剂盒进行PCR扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子 浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，引物 终浓度为0.2-0.4μM。

用于ACE基因检测的引物为：

SEQ NO.1：5’-CTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCT-3’

SEQ NO.2：5’-TAAGGGGAGCTCAGAGAATTTCAG-3’

SEQ NO.3：5’-GCA CTC CAG CCT GGG C-3’

所述的引物中SEQ NO.1的5’端进行荧光染料标记，内标所用的荧光染料为不同的荧光 素。

所述扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。

采用所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，是通过荧光引物PCR及毛细管电 泳特异性检测运动机能相关基因ACE；用于ACE检测的引物为：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ  NO.3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。

其中所检测的人基因组DNA为：使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样 本进行处理得到的DNA；所述的来源样本为：来源于人类的：滤纸片血斑/口腔拭子样本、 FTA卡血斑/口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液。

使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增 程序：94-98℃1-5min；26-32个循环的94-98℃15-60s，55-65℃15-60s，72℃15-60s；60℃ 30-60min。

本发明的有益效果如下：

本发明以ACE基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物 的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育 选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特 异性检测，大大节约了人力物力和时间。

附图说明

图1是本发明的试剂盒对71-2号样本ACE基因个体DNA扩增后的分型结果图；

图2是本发明的试剂盒对74-2号样本ACE基因个体DNA扩增后的分型结果图；

图3是本发明的试剂盒对69-4号样本ACE基因个体DNA扩增后的分型结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

本发明的试剂盒检测40个不同个体的DNA样本。用于运动机能相关基因检测的引物 采用蓝色荧光染料标记，内标采用红色荧光染料标记。

1、待测样本40份，下文列举的是不同基因型个体3份的结果。相关样本都已经使用 “DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对ACE进行过测序检测。其中，71-2号、74-2号、 69-4号样本的分型结果依次为：D/D、I/I、I/D。

2、检材的基因组DNA提取

Chelex提取法：剪下1～3mm血斑置于1.5mL离心管中，加入sdH₂O 1mL，振荡离 心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5%Chelex-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪 头吸取200μL加入离心管中，振荡数秒，。于56℃水浴保温30min后，振荡数秒。95℃沸 水浴10min，轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。

3、扩增和扩增产物的检测分析

3.1PCR扩增体系：

3.2PCR扩增程序：

4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔（0.2μL分子量内标）×（进样数）＋ （9.8μL去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将10μL上样混合物与1μL扩增产物或等位基因分 析标准物混合，避免产生气泡。95℃变性5min，冰浴5min，并尽快电泳。用遗传分析仪 检测分析。

5、结论

本发明分型完整清晰，结果如图1-3所示：

图1：71-2号样本ACE基因分型位置出现114bp峰值约2650H的单峰，检为D/D纯合， 与测序结果一致。

图2：74-2号样本ACE基因分型位置出现110bp峰值约1500H的单峰，检为I/I纯合， 与测序结果一致，提示该个体耐力更强。

图3：69-4号样本ACE基因分型位置出现110bp峰值约1200H、114bp峰值约1600H的 双峰，检为I/D杂合，与测序结果一致。

以上实施例中所用的不同pH的2.5×PCR缓冲液，用不同pH值的Tris-HCl缓冲液配 制，1×PCR缓冲液中的Tris-HCl浓度为10mM，KCl浓度为50mM；本发明中所用的Taq 聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。