一种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法

摘要

一种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法的要求依次是：首先进行生物转化处理：通过酶的转化将底物转化为葡萄糖醛酸结合物；其次进行分离纯化处理：将上述生物转化过程获得的反应液通过快速色谱柱富集并纯化后获得目标葡萄糖醛酸结合物。本发明同已有葡萄糖醛酸结合物的制备方法相比具有如下优点：1）反应条件温和，不需要强酸强碱；2）操作简便，不需从动物体内富集，也不要多步纯化；3）具有广泛的适用性，适于所有含有酚羟基但不含有酸性基团的尿苷酰二磷酸葡萄糖醛酸转移酶底物的葡萄糖醛酸结合物的制备。

说明书

技术领域

本发明涉及药物葡萄糖醛酸结合物技术领域，特别提供了一种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法。

背景技术

现有技术中，葡萄糖醛酸结合代谢是一类重要的药物代谢反应，临床上超过1/3的药物或其Ⅰ相代谢产物都是尿苷酰二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）的底物，在人及动物体内会生成O-,N-,S-,或C-连接的葡萄糖醛酸结合物（PHarmacol. Ther. 2005;106(1):97-132.）。结合物同底物相比，具有更高的溶解度，易于排出体外，从而影响药物的药效。另外，有些葡萄糖醛酸结合物具有较强的药理活性或者毒性，如吗啡-6-葡萄糖醛酸结合物具有更强的麻醉效果，雌二醇-17-葡萄糖醛酸结合物具有诱导胆汁淤积的能力（Lancet. 1988;1(8589):828， Drug Metab Rev. 1997;29(1-2):183-203.）。因此，制备药物的葡萄糖醛酸结合物对临床上安全有效用药具有非常重要的意义。

制备葡萄糖醛酸结合物的方法主要分为两类：化学法和生物法。化学法可以实现较大规模的制备，但是却不是通用的一类方法，针对不同的底物常常需要开发具体的方法。另外，化学法的制备葡萄糖醛酸代谢产物常常需要强酸强碱等的苛刻的反应条件，有些药物分子在这些条件中不稳定，使得有些药物分子的葡萄糖醛酸结合物无法由化学法制备。传统上，药物分子的葡萄糖醛酸结合物的制备主要从动物的尿液、胆汁中获得，但是这种方法费时费力，很难大量获得高纯度的葡萄糖醛酸结合物。而且，结合物常常伴随生物样品一起，需要多步分离纯化，才能获得一定量的葡萄糖醛酸结合物，很难对药效和毒效进行进一步的评价。

因此，人们期望获得一种高效制备葡萄糖醛酸代谢产物的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效制备葡萄糖醛酸代谢产物的方法。

本发明一种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，所述制备方法的要求依次是：

首先进行生物转化处理：通过酶的转化将底物转化为葡萄糖醛酸结合物；所用的酶具体为：重组表达的尿苷酰二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（即：UGT），或为来源于动物组织的含有UGT酶活性的微粒体或含有微粒体的细胞液（S9），动物组织优选自肝、肾、肠等强代谢能力的组织；所述底物是含有酚羟基但不含酸性基团的化合物；

其次进行分离纯化处理：将上述生物转化过程获得的反应液通过快速色谱柱富集并纯化后获得目标葡萄糖醛酸结合物；

所述快速色谱柱所用填料为含有反相硅胶和阴离子交换树脂的混合填料，两种填料的质量比控制在1-10；所用硅胶键合有苯基，C8和C18中的一种碳链，硅胶粒径介于10-100 μm，所用阴离子离子交换树脂中要求含有伯胺基、仲胺基、叔胺基、季氨基中的一种碱性基团。

本发明所述高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，优选要求保护下述内容：

生物转化处理过程中，所用酶要求预先使用聚氧乙烯烷基醚类非离子型表面活性剂（如鲸蜡醇聚氧乙烯醚）活化，具体要求是微粒体蛋白和活性剂质量之比控制在0.1-100之间，以便发挥最大催化活性。

生物转化过程需要尿苷酰二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），或为其对应的钠盐、铵盐或钾盐中的一种，摩尔用量为UGT底物摩尔用量的0.1-100倍。上述物质旨在为生物催化过程提供葡萄糖醛酸基团。

生物转化反应要求在PH值为6-8缓冲盐溶液里进行，并保持30-50℃的转化温度，优选用35-40℃。

所述快速色谱柱的填料中，硅胶键合有不同长度碳链，碳链长度优选C8和C18，粒度优选40-60 μm。阴离子交换树脂为弱碱性或强碱性离子交换树脂，优选含有伯胺基或仲胺基团的离子交换树脂，树脂粒径为0.2-1 mm。两种填料的总质量为不低于底物和代谢产物总质量的20倍。

所述生物转化样品置于快速色谱柱柱头后，先后经过水淋洗、醇淋洗及酸化醇淋洗的过程，水淋洗旨在洗脱反应液里水溶性物质，醇淋洗旨在洗脱底物和反应液里其它脂溶性物质，酸化醇淋洗旨在洗脱葡萄糖醛酸结合物。

所用醇为脂肪醇，具体指甲醇、乙醇、异丙醇；所用酸为低沸点有机酸，具体指甲酸、乙酸，醇中酸的摩尔浓度为0.01-0.1 mol/L。

水洗过程中水的用量不低于5倍柱体积；醇具体为甲醇或者乙醇，醇淋洗的节点为洗脱液里不再含有底物；酸化醇的用量为柱体积的3-5倍。

所述生物转化样品上柱且依次通过水洗、醇洗、酸化醇洗之后，经高效液相色谱及液相-质谱检测，代谢产物富集于酸化甲醇中；然后经低压蒸发或惰性气体（N₂）吹干，即得纯度>95%的代谢产物。

葡萄糖醛酸结合代谢是由尿苷酰二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）介导的反应，基于化学法和传统生物法制备葡萄糖醛酸结合物的缺陷，本发明利用高活性的酶，包括重组UGT和源自动物具有强代谢能力组织（肝、肾、肠等）的微粒体或含有微粒体的细胞液（S9）成分，在体外高效制备萄糖醛酸结合物。反应液通过同时含有离子交换树脂和反相填料的快速色谱柱，一次性获得高纯度的葡萄糖醛酸结合物。不仅操作简单，而且可以获得大量的葡萄糖醛酸结合物。

本发明同已有葡萄糖醛酸结合物的制备方法相比具有如下优点：

1）反应条件温和，不需要强酸强碱；

2）操作简便，不需从动物体内富集，也不要多步纯化；

3）具有广泛的适用性，适于所有含有酚羟基但不含有酸性基团的UGT底物的葡萄糖醛酸结合物的制备。

附图说明：

图1,为己烯雌酚葡萄糖醛酸结合物的高效液相色谱及质谱图;

图2,为厚朴酚葡萄糖醛酸结合物的高效液相色谱及质谱图。

具体实施方式：

实施例1 己烯雌酚葡萄糖醛酸结合物的制备，如下所示：

己烯雌酚溶于二甲基亚砜（DMSO）中配置成5 mg/ml的贮存液，取出50 ml贮存液加入PH7.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液中，搅拌后加入非离子表面活性剂（Brij 58）预先活化的猪肝微粒体（PLM），加入葡萄糖醛酸的供体UDPGA（钠盐），体系中己烯雌酚终浓度为0.25 mg/ml，蛋白终浓度为0.5 mg/ml，UDPGA终浓度2 mM，37℃恒温水浴搅拌孵育2-4 h。高效液相色谱检测底物转化率达90%以后将反应液转移至-80 ℃冰箱中冷却。取反应液200 ml直接上快速色谱柱。该快速色谱柱的填料为混合填料，其中反相硅胶键合有C18，粒径为50 μm，用量为4 g，离子交换树脂含有伯氨基，用料为2 g。先后用30 ml水淋洗，30 ml甲醇淋洗，30 ml甲酸化甲醇淋洗。酸化甲醇淋洗液于40 ℃下真空旋转蒸发得代谢产物77 mg，HPLC分析产物纯度>95%（参见图1）。

实施例2，厚朴酚葡萄糖醛酸结合物的制备，如下所示：

厚朴酚溶于甲醇当中配成5 mg/ml的贮存液，取出20 ml加入PH7.4的磷酸盐的缓冲盐，搅拌后依次加入预先活化的重组UGT2B7，加入葡萄糖醛酸的供体UDPGA（铵盐），体系中厚朴酚终浓度为0.10 mg/ml，蛋白终浓度为0.5 mg/ml，UDPGA终浓度1 mM，37℃恒温水浴搅拌孵育1 h。HPLC检测底物转化率达50%以后将反应液转移至-80℃冰箱中冷却。取反应液100 ml直接上快速色谱柱。该快速色谱柱的填料为混合填料，其中硅胶键合有苯基，粒径为40 μm，用量为2.5 g，离子交换树脂含有仲氨基，用料为2.5 g。先后用30 ml水淋洗，30 ml甲醇醇淋洗，30 ml甲酸化甲醇淋洗。酸化甲醇淋洗液于室温下N₂吹干得葡萄糖醛酸结合物9 mg，HPLC纯度>95%（图2）。

实施例3，七叶亭葡萄糖醛酸结合物的制备，如下所示：

七叶亭溶于甲醇当中配成10 mg/ml的贮存液，取出20 ml加入PH7.4的Tris-HCl的缓冲盐，搅拌后依次加入预先活化的混合微粒体（等量人肝微粒，猪肝微粒体，狗肝微粒，和鼠肝微粒体混合），加入葡萄糖醛酸的供体UDPGA（钾盐），体系中七叶亭终浓度为0.20 mg/ml，蛋白终浓度为0.4 mg/ml，UDPGA终浓度1 mM，37 ℃恒温水浴搅拌孵育2 h。HPLC检测底物转化率达80%后，取反应液100 ml直接上快速色谱柱。该快速色谱柱的填料为混合填料，其中反相硅胶键合有C8，粒径为50 μm，用量为2 g，离子交换树脂含有仲氨基，用料为6 g。先后用50 ml水淋洗，50 ml甲醇淋洗，50 ml乙酸化甲醇淋洗，得葡萄糖醛酸结合物16 mg，HPLC纯度>95%，葡萄糖醛酸结合物核磁数据如表1所示。

 

表1 七叶亭和其葡萄糖醛酸结合物的C和H原子的化学位移