五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体及其制备方法，其主要组成包括五环三萜类化合物系列中的一种或几种，如熊果酸，齐墩果酸，白桦酸，β-乳香酸；环糊精包合剂；磷脂材料及胆固醇。本发明通过环糊精将五环三萜类化合物包合提高亲水性，并以脂质体为载体进行包覆，通过冷冻干燥得到前体脂质体。五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体可提高五环三萜类化合物的生物利用度和稳定性，促进透皮吸收，降低皮肤刺激性。此外，该环糊精包合物前体脂质体为粉末状，稳定性及复水重建性好，使用方便，可应用于霜膏、乳液、凝胶、精华液等多种化妆品剂型。

说明书

技术领域

本发明涉及一种五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体及其制备方法和作为化妆品活性成分的应用。

背景技术

以熊果酸及齐墩果酸为代表的五环三萜类化合物具有诸多生物活性，如抗氧化、抗炎、抑制黑色素形成及胶原蛋白再造作用。日本发明专利JP8165231A、JP2000302659A公开了其作为抗光老化护肤品活性成分的应用；专利CN101111289A发明的一种防皱化妆品，其主要成分包含熊果酸和齐墩果酸。虽然大多五环三萜类化合物具有广泛生物学活性，但由于五环三萜类化合物母核结构的特殊性，使其具有强疏水性，不利于吸收，缺少贮存稳定性，生物利用度较低，这些副作用在很大程度上限制了其在化妆品领域的应用。

环糊精是一类具有疏水性中央空腔和亲水表面的环状低聚糖，能够选择性键合各种有机、无机和生物分子形成主-客体包合物。所谓“包合”就是主体与客体通过分子间非共价键相互作用，完成彼此识别的过程，最终使得客体分子部分或全部进入主体内部的现象。β-环糊精的分子空腔内径大小适中，约70- 80nm，可与多数化合物形成包合物，应用范围广。羟丙基-β-环糊精水溶性极好，对肾无毒，对肌肉、粘膜几乎无刺激作用。疏水性物质作为客体分子与环糊精形成包合物后可改善药物的溶解性能，调节释放速度，提高稳定性，掩盖不良气味和降低毒副作用和刺激性。中国发明专利CN1785203A公开了一种黄芪甲苷环糊精包合物及其制备方法，经包合后黄芪甲苷的溶解度从22.2μg/ml增加至188.4-386.8μg/ml，生物利用度由3%提高到11%。中国专利CN102342897A发明了一种皮肤用防晒剂的环糊精包合物的制备方法，防晒剂形成包合物后降低了不良气味，提高了光稳定性。美国发明专利US6596263公开了一种α-羟基酸环糊精包合物及其在皮肤制剂方面的应用。

脂质体是由磷脂等类脂形成的双分子层的完全封闭的单层或多层囊泡。其结构类似于细胞，可包封水溶性和脂溶性物质。脂质体作为局部药物载体，与皮肤角质层细胞间脂质结构相似，能很快地透过角质层进入皮肤深层，使更多活性物质留在表皮到真皮之间。美国发明专利US20110081402A1公开了一种胶原脂质体成分及含有该成分的皮肤化妆品。中国专利CN1437931发明了辅酶Q10前体脂质体，提高了辅酶Q10的稳定性并方便其在化妆品中的应用。中国专利CN101214198发明的神经酰胺纳米脂质体制剂具有高稳定性，水相溶性及良好的生物相容性。但此类发明均为包覆亲水活性成分，对于包覆强疏水性活性成分，其疏水性使分子不能够直接嵌入脂质体囊泡内腔，存在包封率低且稳定性差的不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体，以克服强疏水性的五环三萜类化合物作为化妆品活性成分的不足，通过环糊精包合提高亲水性，并以脂质体为载体进行包覆，制成前体脂质体粉末，提高其生物利用度和稳定性。

本发明的另一目的是提供上述五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体的制备方法。

本发明实现过程如下：

一种五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体，由下述物质制备得到：

五环三萜类化合物  2-50份

环糊精  30-100份

磷脂材料  100-220份

胆固醇  20-70份

冻干保护剂  40-155份。

所述五环三萜类化合物选自熊果酸、齐墩果酸、白桦酸、β-乳香酸中的一种或几种。

所述环糊精为β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。

所述磷脂材料选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄磷脂、氢化大豆磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂磷脂酰甘油中的一种或几种。

所述冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、棉籽糖、右旋糖酐、乳糖中的一种或几种。

上述环糊精包合物前体脂质体复水重建后粒径为80-600nm。

一种五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体的制备方法，采用二步法制备，由五环三萜类化合物通过环糊精包合后形成环糊精包合物，再内嵌入脂质体囊泡形成环糊精包合物脂质体，并通过冷冻干燥得到五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体。

具体地说，制备方法包括以下步骤：

（1）五环三萜类化合物溶于乙醇或95%乙醇，环糊精溶于水，将五环三萜类化合物的乙醇溶液加至环糊精水溶液中搅拌均匀，经离心取上清液，真空浓缩、干燥得五环三萜类环糊精包合物；

（2）磷脂材料与胆固醇溶于乙醚，五环三萜类环糊精包合物溶于pH 6～8的磷酸盐缓冲溶液中，将两溶液混合后超声，蒸发除去乙醚形成胶态溶液，加入pH 6～8的磷酸盐缓冲溶液得到包合物脂质体混悬液；

（3）将冻干保护剂加至脂质体混悬液中，溶解后冷冻干燥即得五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体。

本发明将五环三萜类化合物强化透皮作用，降低了皮肤刺激性，同时成分中环糊精、磷脂材料及冻干保护剂均为对皮肤有益的成分，使其可应用为化妆品活性成分，如乳液、霜膏、凝胶、精华液等多种化妆品剂型。

上述五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体可用于皮肤外用化妆品中，添加至化妆品中制成皮肤乳液，营养霜，按摩霜，面部凝胶，眼霜，眼部精华液，眼部凝胶，清洁霜，洁面乳，粉底，身体乳液，身体霜，身体凝胶，添加量为0.1~10%。

本发明的五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体具有以下显著优点：

（1）解决了疏水性五环三萜类化合物作为化妆品活性成分的不足，提供五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体的制备方法及其作为化妆品活性成分的应用。

（2）将疏水性五环三萜类化合物通过环糊精包合提高了亲水性，并以脂质体为载体进行包覆，将其制备为前体脂质体粉末，提高了其生物利用度和稳定性，强化透皮作用，降低皮肤刺激性。

（3）本发明中的环糊精材料、磷脂材料及冻干保护剂均为对皮肤有益的化妆品原料，可协同作用于皮肤。

（4）本发明的五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体为粉末状，方便使用，复水重建后粒径小，制备方法简单，包封率高，使其可应用于乳液、霜膏、凝胶、精华液等多种化妆品剂型。

附图说明

图1为五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体制备工艺流程图;

图2为五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体外观;

图3为五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体稳定性;

图4为五环三萜类化合物环糊精包合物脂质体透射电镜图，图（1）实施例1：熊果酸β-环糊精包合物脂质体；（2）实施例2：熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物脂质体；（3）实施例3：熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物脂质体；（4）实施例4：齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合物脂质体；

图5为五环三萜类化合物环糊精包合物脂质体粒径分布图，图（A）、（B）、（C）和（D）对应于实施例1-4制备得到的脂质体。

具体实施方式

下面结合具体案例对本发明作进一步说明。

如图1所示，更具体地说，本发明五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体的制备方法如下：

（1）将五环三萜类化合物溶于95%乙醇中，环糊精在去离子水中溶解，持续搅拌下，将五环三萜类化合物溶液缓慢滴加至环糊精水溶液中，20-60℃搅拌1-6h之后将包合物分散液在70000g下离心60min，上清液为五环三萜类环糊精包合物的水溶液，将上清液真空浓缩，浓缩液在真空干燥箱40℃干燥3-6h即得白色粉末状的五环三萜类环糊精包合物；

（2）将磷脂材料与胆固醇混合溶于乙醚中，五环三萜类环糊精包合物溶于0.02M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。水浴超声下将包合物溶液滴加至磷脂膜材溶液中，继续超声5 min，旋转蒸发仪中减压除去乙醚，形成胶态后，加入0.02M 的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，水合至瓶壁上的凝胶脱落，即得到乳白色的包合物脂质体混悬液，将该混悬液采用高压均质机均质4-5次；

（3）将冻干保护剂加入以上脂质体混悬液中，溶解后将包合物脂质体混悬液倾倒于培养皿中进行冷冻干燥，冻干条件为：预冻温度-60±2℃，采用速冻方式进行，预冻时间6h，冷阱温度-50~-55 ℃，真空度＜100mT，冻干时间24h，即得五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体。使用时加去离子水水化重建，轻轻震荡溶解完全即得重建后的包合物脂质体混悬液。

该五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体可作为皮肤外部化妆品应用组合中的活性成分使用。

该五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体在化妆品配方中的添加量为0.1~10%。

本发明五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体可使用于皮肤乳液，营养霜，按摩霜，面部凝胶，眼霜，眼部精华液，眼部凝胶，清洁霜，洁面乳，粉底，身体乳液，身体霜，身体凝胶等。

实施例1：熊果酸β-环糊精包合物前体脂质体的制备

熊果酸β-环糊精包合物的制备：称取3.75g的β-环糊精，加入100ml的蒸馏水使其充分溶解，另取熊果酸0.50g，用95%乙醇20ml溶解后缓慢滴加于上述β-环糊精水溶液中，30℃搅拌6h后将包合物的分散液在70000g下离心60min，上清液为熊果酸β-环糊精包合物的水溶液，将上清液真空浓缩，浓缩液在真空干燥箱40℃，0.08MPa干燥6h即得白色粉末状的熊果酸β-环糊精包合物，通过测定包合率达到82.34%。

熊果酸含量测定：采用高效液相色谱法测定熊果酸，色谱条件为AtlantisTM C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钠甲醇溶液（体积比为15:85）；检测波长为215 nm；流动相流速为0.8 ml/min。

包合率的测定：精密称取一定量熊果酸β-环糊精包合物置于容量瓶中，加入蒸馏水充分溶解，定容。按熊果酸含量测定方法测定游离熊果酸含量，计算包合物中熊果酸含量。熊果酸包合率根据下面公式计算：

包合率%=m包合物×m包合物中熊果酸/m加入熊果酸×100%

将10.25g大豆卵磷脂与2.50g胆固醇混合溶于50ml无水乙醚中；熊果酸β-环糊精包合物3.00g溶于50ml 0.02M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。将两溶液充分混合后，水浴超声5 min，形成稳定的W/O型乳液，之后于旋转蒸发仪中减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入50ml 0.02M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，旋转水合至瓶壁上的凝胶脱落，即得到乳白色的包合物脂质体混悬液，将该混悬液采用高压均质机均质5次。

将5.00g海藻糖入以上脂质体混悬液中，充分溶解后将包合物脂质体混悬液倾倒于塑料培养皿中冷冻干燥，冻干条件为：预冻温度-60±2℃，采用速冻方式进行，预冻时间6h，冷阱温度-50~-55 ℃，真空度＜100mT，冻干时间24h，即得五环三萜类环糊精包合物前体脂质体（如图2所示），使用时加去离子水水化重建，轻轻震荡溶解完全即得重建后的包合物脂质体混悬液，测定包封率为56.37%。

包封率测定：采用超速离心法，将10mL脂质体溶液在20000 r/min下离心60min，取上清液适量，测定游离熊果酸浓度，计算包封率。

实施例2：熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物前体脂质体的制备

熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物的制备：称取8.00g的羟丙基-β-环糊精，加入100ml的蒸馏水使其充分溶解，另取熊果酸0.38g，用95%乙醇20ml溶解后缓慢滴加于上述β-环糊精水溶液中，20℃搅拌3h后将包合物的分散液在70000g下离心60min，上清液为熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物的水溶液，将上清液真空浓缩，浓缩液在真空干燥箱40℃，0.08MPa干燥6h即得白色粉末状的熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物，通过测定包合率达到79.08%。

将20.00g氢化大豆磷脂与5.50g胆固醇混合溶于50ml无水乙醚；熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物4.20g溶于80ml 0.02M 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中。将两溶液充分混合后，水浴超声5 min，形成稳定的W/O型乳液，之后于旋转蒸发仪中减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入100ml 0.02M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，旋转水合至瓶壁上的凝胶脱落，即得到乳白色的包合物脂质体混悬液，将该混悬液采用高压均质机均质4次。

将5.00g的甘露醇和2.00g右旋糖酐加入以上脂质体混悬液中，充分溶解后将包合物脂质体混悬液倾倒于塑料培养皿中冷冻干燥，冻干条件为：预冻温度-60±2℃，采用速冻方式进行，预冻时间6h，冷阱温度-50~-55 ℃，真空度＜100mT，冻干时间24h，即得熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物前体脂质体（如图2所示），使用时加去离子水水化重建，轻轻震荡溶解完全即得重建后的包合物脂质体混悬液，测定包封率为48.98%。

实施例3：齐墩果酸β-环糊精包合物前体脂质体的制备

齐墩果酸β-环糊精包合物的制备：称取4.80g的β-环糊精，加入100ml的蒸馏水使其充分溶解，另取齐墩果酸0.70g，用95%乙醇20ml溶解后缓慢滴加于上述β-环糊精水溶液中，60℃搅拌4h后将包合物的分散液在70000g下离心60min，上清液为熊果酸β-环糊精包合物的水溶液，将上清液真空浓缩，浓缩液在真空干燥箱40℃，0.08MPa干燥6h即得白色粉末状的熊果酸β-环糊精包合物，通过测定包合率达到86.27%。

齐墩果酸含量测定：采用高效液相色谱法测定熊果酸，色谱条件C18分析柱（250×3.0mm,10μm）；流动相为甲醇-0.1%醋酸溶液（体积比为88:12）；检测波长为215 nm；流动相流速为1.0 ml/min。

将10.50g蛋黄卵磷脂与3.50g胆固醇混合溶于50ml无水乙醚；齐墩果酸β-环糊精包合物4.00g溶于50ml 0.02M 的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。将两溶液充分混合后，水浴超声5 min，形成稳定的W/O型乳液，之后于旋转蒸发仪中减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入50ml 0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，旋转水合至瓶壁上的凝胶脱落，即得到乳白色的包合物脂质体混悬液，将该混悬液采用高压均质机均质5次。

将4.00g的山梨醇、4.00g海藻糖、2.00g木糖醇加入以上脂质体混悬液中，充分溶解后将包合物脂质体混悬液倾倒于塑料培养皿中冷冻干燥，冻干条件为：预冻温度-60±2℃，采用速冻方式进行，预冻时间6h，冷阱温度-50~-55 ℃，真空度＜100mT，冻干时间24h，即得齐墩果酸β-环糊精包合物前体脂质体（如图2所示），使用时加去离子水水化重建，轻轻震荡溶解完全即得重建后的包合物脂质体混悬液，测定包封率为52.49%。

实施例4：齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合物前体脂质体的制备

齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合物的制备：称取4.00g的羟丙基-β-环糊精，加入100ml的蒸馏水使其充分溶解，另取齐墩果酸0.50g，用95%乙醇20ml溶解后缓慢滴加于上述羟丙基-β-环糊精水溶液中，50℃搅拌3h后将包合物的分散液在70000g下离心60min，上清液为齐墩果酸羟丙基-β-环糊精的水溶液，将上清液真空浓缩，浓缩液在真空干燥箱40℃，0.08MPa干燥6h即得白色粉末状的齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合物，通过测定包合率达到82.34%。

将9.00g二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱与2.50g胆固醇混合溶于50ml乙醚中；齐墩果酸羟丙基-β-环糊精3.00g溶于80ml 0.02M 的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。将两溶液充分混合后，水浴超声5 min，形成稳定的W/O型乳液，之后于旋转蒸发仪中减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入80ml 0.02M 的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，旋转水合至瓶壁上的凝胶脱落，即得到乳白色的包合物脂质体混悬液，将该混悬液采用高压均质机均质4次。

将8.00g的甘露醇、1.00g海藻糖、1.00g棉籽糖加入以上脂质体混悬液中，充分溶解后将包合物脂质体混悬液倾倒于塑料培养皿中冷冻干燥，冻干条件为：预冻温度-60±2℃，采用速冻方式进行，预冻时间6h，冷阱温度-50~-55 ℃，真空度＜100mT，冻干时间24h，即得齐墩果酸羟丙基-β-环糊精前体脂质体（如图2所示），使用时加去离子水水化重建，轻轻震荡溶解完全即得重建后的包合物脂质体混悬液，测定包封率为50.16%。

实施例5：五环三萜类化合物环糊精包合物性质的测定

1、溶解度的测定：取上述实施例1-4制备的环糊精包合物及熊果酸（齐墩果酸）适量，分别于25±1℃磁力搅拌5h，制成水饱和溶液，用微孔滤器（0.45μm）取样，用外标两点法测定熊果酸（齐墩果酸）溶解度，测定结果为熊果酸β-环糊精包合物中熊果酸的溶解度为32.82mg/100ml，熊果酸羟丙基-β-环糊精包合物中熊果酸的溶解度为39.36mg/100ml，熊果酸的溶解度为2.54mg/100ml。齐墩果酸β-环糊精包合物中熊果酸的溶解度为36.78mg/100ml，齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合物中熊果酸的溶解度为40.03mg/100ml，齐墩果酸的溶解度为2.86mg/100ml。

2、温度稳定性实验：将熊果酸β-环糊精包合物前体脂质体铝箔袋真空密封包装后分别置于4℃、25℃、45℃下，避光保存；60d内每隔10d分别取样，并测定熊果酸的保留率。

光稳定性实验：将用透明袋真空包装熊果酸β-环糊精包合物前体脂质体于室温自然光照条件下及在强光下照射(强度300LX)，60d内每隔10d分别取样，并测定熊果酸的保留率。

如图3所示，结果表明，熊果酸β-环糊精包合物前体脂质体在室温及避光条件下稳定性良好。

3、五环三萜类化合物环糊精包合物脂质体透射电镜及粒径分布

用去离子水将实施例1-4制备的环糊精包合物前体脂质体复水重建并稀释到合适浓度，用马尔文动态光散射仪（Zetasizernanos，英国马尔文公司）测定脂质体的平均粒径及其分布。采用透射电子显微镜（JEM-2100，日本电子公司）观察脂质体形态，见图4、图5。

实施例6：五环三萜类化合物环糊精包合物脂质体体外经皮渗透性评价

用接收室容积为5ml、池口扩散面积为0.785cm²的Franz透皮扩散仪进行透皮试验，将离体鼠皮的真皮层面向接受室，角质层面向供给室，控制水浴温度为37±0.1℃，转 子 搅 拌 速 度 为600r.min^-1，以磷酸盐缓冲液（pH 7.4）为 接 收 液， 向 供 给 室 加 入2ml复水重建的实施例1-4的环糊精包合物脂质体溶液， 分 别 在0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10和12h由取样口取2ml接收液，同时补充2ml接收液。将取出的接收液样品采用HPLC进行熊果酸（齐墩果酸）浓度测定，测定时破乳使脂质体内包覆的熊果酸（齐墩果酸）全部释放后测定，计算其稳态透皮速率Js（μg·cm^-2·h^-1）。同时以相同浓度的熊果酸（齐墩果酸）卡波姆基质水凝胶作对照，重复实验5次。结果表明，环糊精包合物脂质体的稳态透皮速率均大于熊果酸（齐墩果酸）水凝胶（P＜0.05），能显著地促进渗透，增加在皮肤中的滞留量。具体见表1。

实施例7：五环三萜类化合物环糊精包合物脂质体皮肤刺激性评价

取雌性家兔20只，采用电动剃毛刀于实验前24h将家兔背部两侧进行脱毛处理，并用刮刀将毛去除干净，去毛处皮肤完全裸露，去毛范围左右各约3.0×5.0cm。涂敷前检查去毛皮肤完全无损。左侧均匀涂布2ml实施例1-4的复水重建脂质体混悬液，右侧以熊果酸（齐墩果酸）水凝胶2ml为对照，左右侧熊果酸（齐墩果酸）浓度相同。涂敷后将家兔放于兔盒内以保证涂敷物在皮肤上有足够的停留时间。4h后，用温水去除涂敷物，30min后肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况，相同步骤连续涂敷7天，末次除去涂敷物后24h，48h，72h分别观察记录。结果表明环糊精包合物脂质体的刺激性较水凝胶刺激性小，具体结果见表2。

实施例8：添加五环三萜类化合物环糊精包合物脂质体护肤霜的制备

产品处方见表3：

将E组分中的包合物前体脂质体采用去离子水水化重建，轻微震荡形成脂质体混悬液。将A和B组分分别加热到75°C。将B缓慢加入A中，搅拌20min。当AB乳化均匀后，将C加入，高速均质5min之后冷却到65°C，中速搅拌，迅速冷却到室温，保持中速搅拌45°C添加D，膏体可以变成光滑均匀的状态，在温度30°C时，添加E组分，低速搅拌10min后出料。

实施例9：添加五环三萜类化合物环糊精包合物脂质体护肤凝胶的制备

产品处方见表4：

将E组分中的包合物前体脂质体采用去离子水水化重建，轻微震荡形成脂质体混悬液。A相搅拌均匀加热至40℃，B相加热至40℃后缓慢加入A相，搅拌10min，加入C相后搅拌30min，之后加入D相搅拌10min，降温至30℃加入E相降温低速搅拌10min后出料。