一种抗卵巢功能衰退的中药组合物及其应用

摘要

本发明属于中药领域，公开了一种抗卵巢功能衰退的中药组合物及其应用。一种抗卵巢功能衰退的中药组合物，主要由菟丝子30-70%，枸杞子10-50%，桑椹4-20%，生地黄10-20%和红花1-10%组成。由该组合物制备的抗卵巢功能衰退的中成药可在制备抗卵巢功能衰退药物中的应用，所述的卵巢功能衰退症状优选多囊卵巢综合征、功能性月经不调、卵巢早衰或绝经期综合征。结果显示本发明抗卵巢功能衰退中成药对离体卵巢颗粒细胞具有显著的增殖作用，能显著提高离体卵巢颗粒细胞的雌孕激素分泌水平，能显著增加离体卵巢颗粒细胞的抗凋亡作用，能降低多囊卵巢综合征模型鼠FSH、LH、T水平，能对环磷酰胺所致卵巢早衰大鼠有性激素调节作用。

说明书

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种抗卵巢功能衰退的中药组合物及其应用。 

背景技术

卵巢功能衰退可引发不孕不育、生殖系统、心血管系统、骨质疏松等系列疾病，卵巢过早衰退(Prematureovarian failure，POF，即卵巢早衰)致使患者生活质量下降。此外，随着社会经济的发展，越来越多的职业女性选择延迟生育时间，但女性的最佳生殖时间窗同样受到卵巢功能的严重限制。因此探讨卵巢功能衰退衰老机制、预测卵巢功能衰退的指标以及防治卵巢功能过早衰退的措施是当今生殖健康领域的研究热点和难点。 

流行病学研究显示卵巢早衰的发生率为1%，然而这l%的妇女如何最终达到卵巢衰竭的状态，POF初始阶段的状态如何，目前仍有很多未知。有研究发现，随年龄增加，卵泡密度逐渐下降，35岁以上妇女卵泡密度明显降低，是35岁以下者卵泡密度的1/4，40岁以上妇女卵泡密度急剧降低，部分妇女卵泡密度降至0。Nikolaou估计在一般人群中至少有10%的妇女经历着过早的卵巢功能衰退，那根据POF的1%发生率，至少有9%的妇女处于卵巢功能衰退的早期状态，有专家对此状态命名为卵巢早老化(prematureovarian aging，POA)，并对两者病因学进行比较研究，结果支持了POA是POF一种早期阶段表现的观点。有研究提示治疗高促性腺激素闭经的效果与病程以及促卵泡生成素(FSH)水平有关。 

激素替代治疗（Hormone replacement therapy，HRT）是目前现代医学治疗卵巢衰老相关症状和疾病的重要方法，但现有研究明显表明其具有多种副作用和远期致癌性，使其临床应用受到明显的限制。对应此状态，在中国遵循传统中医理论，主张“补肾益阴、疏肝养血”而延缓卵巢衰老，采用中药方剂治疗，存在活性明确，毒副作用小的特色。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种抗卵巢功能衰退的中药组合物及其应用。 

本发明的另一目的是提供一种抗卵巢功能衰退的中成药及其制备方法。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种抗卵巢功能衰退的中药组合物，主要由菟丝子30-70%，枸杞子10-50%，桑椹4-20%， 生地黄10-20%和红花1-10%组成，优选为由菟丝子30-55%,枸杞子17-38%,桑椹8-18%，生地黄13-19%和红花3-6%组成。 

所述的抗卵巢功能衰退的中药组合物在制备抗卵巢功能衰退药物中的应用。 

所述的卵巢功能衰退症状为多囊卵巢综合征、功能性月经不调、卵巢早衰或绝经期综合征。 

一种抗卵巢功能衰退的中成药的制备方法，包括如下步骤： 

a．先将菟丝子、枸杞子、桑椹、红花、生地黄五种原料分别干燥粉碎，目数不少于20目； 

b．将粉碎后的粉状原料按所规定的重量百分比称重后，加入相当于原料5-200倍质量的大极性提取液，再一同搅拌混合均匀，使原料中的活性成分溶解到提取液中，滤去残渣后得到本发明中成药的粗品；其中所述的原料的重量百分比组成为：菟丝子30-70%，枸杞子10-50%，桑椹4-20%，生地黄10-20%和红花1-10%，优选为菟丝子30-55%,枸杞子17-38%,桑椹8-18%，生地黄13-19%和红花3-6%； 

c．将得到的粗品进行干燥、粉碎、制剂即得本发明的中成药。 

其中，所述菟丝子、枸杞子、桑椹、红花、生地黄原料粉碎的目数为20-80目。 

所述大极性提取液优选水，甲醇，乙醇，或是它们的任意混合液；所述大极性提取液进一步优选浓度60-80%，PH值为5.6-6.3的乙醇溶液。 

所述的抗卵巢功能衰退的中成药的制备方法，优选所述菟丝子、枸杞子、桑椹、红花、生地黄按量混合并与大极性提取液搅拌均匀后的混合物，在静止状态下用超声振荡法、加热回流提取法或逆流提取法，使混合物中的原料的活性成分更多的溶解到大极性提取液中。 

所述的抗卵巢功能衰退的中成药的制备方法，进一步优选所述菟丝子、枸杞子、桑椹、红花、生地黄原料按量混合并与大极性提取液搅拌均匀后的混合物从管中缓慢通过，管周壁设置的超声波发生器对其进行超声振荡处理，处理时间10-30分钟，使混合物中各原料的活性成分充分溶解到大极性提取液中。 

所述的抗卵巢功能衰退的中成药的制备方法，所述粗品的干燥工序优选采用高温干燥、喷雾干燥或冷冻干燥；所述粗品的干燥工序进一步优选采用-20℃下的低温真空干燥，以保持生物活性。 

按照上述方法制备的抗卵巢功能衰退的中成药。 

所述的抗卵巢功能衰退的中成药在制备抗卵巢功能衰退药物中的应用，所述的卵巢功能衰退症状优选多囊卵巢综合征、功能性月经不调、卵巢早衰或绝经期综合征。 

卵巢功能衰退在中医理论上认为病机以肾气不足，肾精亏耗为基础，气血虚弱，瘀血阻滞为主要环节，最终导致卵巢老化及衰老，出现多脏受累，脏腑、气血、经络、胞宫功能失常，其中尤与肾和瘀这两者最为关键。对于卵巢衰老或卵巢早衰，中医均归属肾虚精亏之证。遵循中医理论配伍组成方剂，在方中： 

枸杞子为君，补益肾阴,滋养精血，起主要治疗作用。古本草记载枸杞子功效，“补益精气，强盛阴道”（《本草经集注》）；“凡真阴不足之证，悉宜用之”（《药品化义》）；“滋肾”（《本草纲目》）；“补肾填精”（《本草汇言》）。 

生地黄、桑椹为臣。关于生地黄，虽性寒能清热凉血，但亦擅长滋阴补血。《名医别录》记载“补五脏内伤不足，通血脉，益气力，利耳目”；《日华子本草》记载“助心胆气，安魂定魄”；《本草经疏》记载“补肾家之要药，益血阴之上品”；《本草从新》记载“养阴退阳，凉血生血。调经安胎”。关于桑椹，《滇南本草》记载“益肾脏而固精，久服黑发明目”；《随息居饮食谱》记载“滋肝肾，充血液”。本方用生地黄、桑椹协助枸杞子滋肾养血，增强补益作用，同时又发挥生地黄退虚热、安心神之长。 

红花为佐。古本草记载红花“惟入血分，专治女科”（《本草蒙荃》）；谓其能“生新破瘀”（《药性考》），“逐腹中恶血而补血虚之虚”（《医切集览》），是“行血，和血，调血之药也”（《本草汇言》）。而《药品化义》在分析红花用量时指出：“若多用三四钱，使血走散。若只用二三分，令血调和，此其滋养而生血也”。本方选用少量红花活血和血，既能祛瘀生新而增强枸杞子、生地黄、桑椹等生精养血作用，又能协同生地黄活血消癥通血脉，解决女性常见的子宫肌瘤、多囊卵巢、乳房结节等肿块。 

菟丝子同为佐药。《神农本草经》谓其“补不足，益气力，久服明目，轻身延年”；《本草汇言》又曰:“补肾养肝，温脾助胃之药也”；《扁鹃心书》则用以“补肾气，壮阳道，助精神”。本方遵循张景岳“善补阴者，必于阳中求阴”之法，于大队补益阴血药中佐以药性微温的菟丝子，使“阴得阳升，而源泉不竭”，进一步增强补养阴精的作用。 

综上所述，五药合用，全方共奏补肾抗衰、益精滋阴、养血调经之效，以达延缓卵巢衰老目的。 

本发明是由菟丝子、枸杞子、桑椹、红花、生地黄五种药材组方而成，目前未见此组方治 疗卵巢功能衰退的报道，仅见申请号为CN201010175581.4，公开号为CN101829303A的中国专利文献“延年益寿酒”公开了一种延年益寿酒，其特征是在每1000-5000ml的25°-60°纯粮白酒中浸泡有下列药物原料：人参3-25g，淫羊藿3-20g，酸枣仁3-20g，鹿茸3-20g，远志2-20g，龟版3-25g，鳖甲3-30g，茯苓2-20g，砂仁2-20g，山萸肉3-30g，黄芪3-30g，巴戟天3-30g，山楂3-30g，熟地黄2-20g，菟丝子3-30g，川芎2-20g，当归2-20g，女贞子3-30g，白芍药5-20g，枸杞子3-30g，红花1-10g，锁阳3-30g，桑椹3-30g，灵芝草3-30g，肉苁蓉3-30g，三七3-10g，石斛2-30g，何首乌3-25g，龙眼肉3-50g，杜仲2-20g，夜交藤2-30g，大枣20-500g，天麻2-20g，甘草2-20g，菊花3-30g。“延年益寿酒”是由菟丝子、枸杞子、桑椹、红花、熟地黄组方而成，且其功效为健康长寿，对老年人性功能减退者有防治作用，对各种疼痛、劳损、久治不愈的慢性病有扶正而愈的作用，而本发明选用生地黄，《本草纲目》载：地黄生则大寒，而凉血，血热者需用之，熟则微温，而补肾，血衰者需用之。男子多阴虚，宜用熟地黄，女子多血热，宜用生地黄。故本发明主要针对女性卵巢作用，故选用生地黄。 

有益效果： 

近年来，随着生活水平的不断提高，人们对自身的健康越来越重视，适当服用一些保健食品防治疾病与保持健康已逐渐成为世界各国民众的重要手段。抗卵巢功能衰退保健品市场是一个新兴市场，我国约有上亿人患有不同程度的卵巢功能衰退，平均每人每年用药20元，抗卵巢功能衰退保健药物每年销售额就有20亿元。因此，具抗卵巢功能衰退作用的本方其市场潜力十分巨大，并具有很大的市场优势。特别由于本方是在本公司所有的原专利“提高女性卵巢功能的中成药及其制作方法以及在制药中的应用”（专利号ZL03152889.9）加味后重新配比制备而成，新配方对离体卵巢颗粒细胞增殖及雌孕激素分泌能力与原方相当；对离体卵巢颗粒细胞抗凋亡活性优于原方，并具显著性差异；且能降低多囊卵巢综合征模型鼠FSH、LH、T水平，能对环磷酰胺所致卵巢早衰大鼠有性激素调节作用，因此，新配方可在制备抗卵巢功能衰退药物中应用，特别是在制备抗卵巢功能衰退症状为卵巢早衰、更年期综合征或卵巢抵抗综合征的药物中应用。本发明活性优于原方，且为新配方提供了临床新用途，扩大了其应用范围。 

附图说明

图1不同配方对离体卵巢颗粒细胞凋亡的影响 

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。本发明的实验动物，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（生产许可证号：SCXK(军)2007-004）。 

实施例1 

取100千克菟丝子、50千克枸杞子、40千克桑椹、30千克生地黄和8千克红花，分别经粉碎机粉碎得到他们的粉状物，目数控制在80目。将上述粉状菟丝子、枸杞子、桑椹、生地黄和红花与20000千克的浓度为70%、pH值为6的乙醇溶液混合，并在搅拌器内搅拌均匀，然后经管道缓慢流入容器，在该管道的管壁上设有超声波发生器，他对管道内缓慢流动的混合物进行超声振荡破碎处理，处理时间为30分钟，使原始细胞中的活性成分充分溶解到乙醇溶液中。将超声处理后的混合物溶液进行过滤，去除残渣，得到约20000千克的本发明中成药的粗品溶液。将上述粗品溶液至于乙醇回收器和真空干燥箱中浓缩后取出，得到约25千克的本发明中成药的干浸膏，最后将该干浸膏经制剂加工处理即得到片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂或散剂的中成药。 

实施例2 

取200千克菟丝子、100千克枸杞子、80千克桑椹、70千克生地黄和20千克红花，分别经粉碎机粉碎得到他们的粉状物，目数控制在20目。将上述粉状菟丝子、枸杞子、桑椹、生地黄和红花与5000千克的浓度为75%、pH值为6.3的乙醇溶液混合，并在搅拌器内搅拌均匀，然后经加热回流12小时，使原始细胞中的活性成分充分溶解到乙醇溶液中。滤除残渣，得到约4500千克的本发明中成药的粗品溶液。将上述粗品溶液至于真空干燥器中，在-20℃条件下进行低温真空干燥，干燥48小时后取出，得到约56.4千克的本发明中成药的干浸膏，最后将该干浸膏经制剂加工处理即得到片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂或散剂的中成药。 

实施例3 

取400千克菟丝子、200千克枸杞子、150千克桑椹、120千克生地黄和31千克红花，分别经粉碎机粉碎得到他们的粉状物，目数控制在20目。将上述粉状菟丝子、枸杞子、桑椹、生地黄和红花与10000千克的浓度为80%、pH值为5.8的乙醇溶液混合，并在搅拌器内搅拌均匀，然后经加热回流12小时，使原始细胞中的活性成分充分溶解到乙醇溶液中。滤除残渣，得到约9000千克的本发明中成药的粗品溶液。将上述粗品溶液至于真空干燥器中，在-20℃条 件下进行低温真空干燥，干燥48小时后取出，得到约100千克的本发明中成药的干浸膏，最后将该干浸膏经制剂加工处理即得到片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂或散剂的中成药。 

实施例4 

取300千克菟丝子、100千克枸杞子、50千克桑椹、100千克生地黄和32千克红花，分别经粉碎机粉碎得到他们的粉状物，目数控制在20目。将上述粉状菟丝子、枸杞子、桑椹、生地黄和红花与6000千克的浓度为75%、pH值为6.0的乙醇溶液混合，并在搅拌器内搅拌均匀，然后经加热回流12小时，使原始细胞中的活性成分充分溶解到乙醇溶液中。滤除残渣，得到约5000千克的本发明中成药的粗品溶液。将上述粗品溶液至于真空干燥器中，在-20℃条件下进行低温真空干燥，干燥48小时后取出，得到约60千克的本发明中成药的干浸膏，最后将该干浸膏经制剂加工处理即得到片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂或散剂的中成药。 

实施例5 

取150千克菟丝子、180千克枸杞子、50千克桑椹、90千克生地黄和16千克红花，分别经粉碎机粉碎得到他们的粉状物，目数控制在20目。将上述粉状菟丝子、枸杞子、桑椹、生地黄和红花与5000千克的浓度为75%、pH值为6.3的乙醇溶液混合，并在搅拌器内搅拌均匀，然后经加热回流12小时，使原始细胞中的活性成分充分溶解到乙醇溶液中。滤除残渣，得到约5000千克的本发明中成药的粗品溶液。将上述粗品溶液至于真空干燥器中，在-20℃条件下进行低温真空干燥，干燥48小时后取出，得到约58千克的本发明中成药的干浸膏，最后将该干浸膏经制剂加工处理即得到片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂或散剂的中成药。 

实施例6不同配方对离体卵巢颗粒细胞活性的影响 

样品制备：样品1：本产品（按实施例1方法制备）；样品2（按照本公司所有的原专利“提高女性卵巢功能的中成药及其制作方法以及在制药中的应用”（专利号ZL03152889.9）组方提取样品）：将枸杞子60g，地黄10g和红花30g粉碎，加浓度为75%，PH值为5.6-6.3的乙醇溶液，回流提取12小时，过滤得提取液，提取液浓缩并干燥得干浸膏； 

动物实验方法：取22-27日龄雌性大鼠，常规饲养48h后颈椎脱臼法处死，无菌摘取大鼠的双侧卵巢，将卵巢破碎使颗粒细胞释放，用2mL含青霉素和链霉素的DMEM-F12培养液中稀释，并轻轻吹打，使其分散成单个细胞。离心过滤收集颗粒细胞。（1）MTT法：将一定浓 度细胞悬液接种于24孔板，每孔80μl，每孔再加120μl培养液调整细胞密度至200μl/孔，每组设6个平行孔。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。取CO₂培养箱内培养了24h的颗粒细胞悬液，每孔先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1不同样品，平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水）。常规培养20h后于每孔中加入MTT溶液（5mg·mL^-1）20μL继续培养4h，每孔加入80μL的三联液，过夜培养，选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度，结果见表1。（2）放射免疫法：将一定浓度细胞悬液接种于24孔板，每孔80μl，每孔再加120μl培养液调整细胞密度至200μl/孔，每组设6个平行孔。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。取CO₂培养箱内培养了24h的颗粒细胞悬液，每孔先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1不同样品，平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水）。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。离心取其细胞上清液，用放免试剂盒测定E₂、P的含量，结果见表1。（3）流式细胞术：同法取得卵巢颗粒细胞后，将一定浓度细胞培养于培养瓶中，先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1不同样品与培养瓶中，平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水），24小时后消化取得细胞悬液进行流式细胞仪检测（见图1），分析给药与卵巢颗粒细胞的凋亡关系。 

MTT法和放射免疫法结果显示模型组与正常对照组在细胞增殖活性及雌孕激素分泌能力上均有显著性差异（p<0.01），可见造模成功。而相同剂量下，阳性药（戊酸雌二醇）、样品1、样品2在细胞增殖活性及雌孕激素分泌能力上无显著性差异，但在细胞增殖活性上均与模型组有显著性差异（均p<0.01）。 

表1不同提取方法对离体卵巢颗粒细胞活性的影响（ n=6） 

*P<0.05，**P<0.01 vs模型组.^ΔP<0.05，^△△P<0.01vs正常对照组 

流式细胞术结果显示：细胞凋亡图中，UL代表死细胞，UR代表晚期凋亡，LL代表活细胞，LR代表早期凋亡，UR+LR为凋亡总值。图1A（正常对照组）凋亡值为7.30，图1B（模型组）凋亡值为56.42，图1C（阳性对照组）凋亡值为27.02，图1D（样品1组）凋亡值为26.30，图1E（样品2组）凋亡值为33.64，根据数值可见样品1对卵巢颗粒细胞的抗凋亡作用较样品 2显著，与阳性药（戊酸雌二醇）相当。 

综合卵巢颗粒细胞增殖效果、雌孕激素分泌水平及卵巢颗粒细胞的抗凋亡作用，可见样品1的各项作用活性均强于样品2，特别是样品1的抗凋亡作用较样品2有显著提高。 

实施例7本发明对多囊卵巢综合征模型大鼠的影响 

24d龄未成年SD雌性大鼠，体重30-40g，0.5mg18-甲基炔诺酮日1次皮下注射，在27d龄时，加用HCG 1.5IU日2次皮下注射，共注射21d。造模成功后，随机分为模型组、样品(按实施例1方法制备，高中低剂量，分别为648,324,162mg/kg)组及阳性药组（二甲双胍0.018g/d），每组各10只，另取45d龄SD雌性大鼠10只为正常对照组，每天灌胃1次，正常对照组和模型组给予等容积生理盐水，连续给药15天后，末次给药后取血检测血清中FSH、LH、T浓度，结果见表2。结果显示模型组与正常对照组均有显著性差异（p<0.01），灌服阳性药、本发明（高中低剂量）15天后FSH、LH、T水平均与模型组有不同显著性的差异。 

表2本发明组和对照组血清中FSH、LH、T浓度的比较（ n=10） 

*P<0.05，**P<0.01 vs模型组.^ΔP<0.05，^△△P<0.01vs正常对照组 

实施例8本发明对卵巢早衰大鼠性激素水平的影响 

采用9d龄SD雌性大鼠，连续腹腔注射14天环磷酰胺8mg/（kg·d）造模。造模成功后，随机分为模型组、样品(按实施例1方法制备，高中低剂量，分别为648,324,162mg/kg)组及阳性药组（倍美力0.075mg/kg），每组各10只，另取23d龄SD雌性大鼠10只为正常对照组，每天灌胃1次，正常对照组和模型组给予等容积生理盐水，连续给药35天后，末次给药后取血检测血清中FSH、E₂浓度，结果见表3。结果显示模型组与正常对照组均有显著性差异（p<0.01），灌服阳性药、本发明（高中剂量）35天后FSH、E₂水平均与模型组有不同显著性的差异。 

表3本发明组和对照组血清中FSH、E₂浓度的比较（ n=10） 

*P<0.05，**P<0.01 vs模型组.^ΔP<0.05，^△△P<0.01 vs正常对照组。