乳胶增强免疫比浊法测定粪胰弹性蛋白酶-1

摘要

本发明首次利用将单克隆抗体结合到乳胶增强免疫比浊法中，用于人粪便中胰弹性蛋白酶1的检测，用于诊断慢性胰腺炎或者胰腺外分泌功能障碍，与现有技术相比，本申请采用特异性识别胰弹性蛋白酶1的单抗，显著提高了检测灵敏度和特异性，具有一定的临床应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医学检验和体外诊断技术领域，涉及一种测定粪便中胰弹性蛋白 酶1的试剂盒，具体地说涉及一种利用乳胶增强免疫比浊法定量测定人体粪便中 胰弹性蛋白酶1的试剂盒及其应用。

背景技术

粪胰弹性蛋白酶1(Fecal elastase 1,FE-1)是由外分泌腺分泌的一种胰腺内 切蛋白酶，经十二指肠乳头排入十二指肠，其浓度降低时可特异性地提示发生慢 性胰腺炎或胰腺外分泌功能不全的情况。粪胰弹性蛋白酶1在肠道内具有稳定性， 通过检测其在粪便中的含量可间接反映胰腺外分泌的功能，这种方法安全、无创 且不受胰酶替代治疗的影响。但是目前常用的免疫层析法检测粪胰弹性蛋白酶1 的方法存在准确性和特异性低的问题，且操作复杂，检测不便。

当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一 部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比 浊法。这一方法早于1959年Schultre和Schuick等报道应用于血浆蛋白与其抗 体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对 抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射。但是经典的免疫比浊法，少量的小的抗 原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间：如形成较大的复合物，则抗原 和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了现在广泛应用于生化 分析仪的乳胶增强免疫比浊法(PETIA)。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结 合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。

乳胶增强免疫比浊法(Latex-enhanced turbidimetric immunoassay)是一种 体液蛋白均相透射免疫比浊检测方法，原理是在纳米级高分子乳胶微球的表面交 联多克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一 起，改变了反应液的透光性能；反应液透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的 浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。其具有如下优点： 1、省时省力：在均相反应体系中进行抗原、抗体反应，利用全自动生化分析仪 直接测定反应液的吸光度值，几分钟就能获得结果，省却酶联免疫法反复孵育和 洗板等烦琐操作步骤；2、稳定准确：操作步骤的简化也相应地避免了许多人为 操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实 地反映被测人体血液或粪便排泄物中胰弹性蛋白酶1的含量；3、应用广泛：乳胶增强免疫比浊法的灵敏度足以检测到胰弹性蛋白酶1的下限值，可完全满足临 床检测要求，明显优于免疫层析法(胶体金)。

随着检验医学的发展，对于低浓度检测物质的检测越来越多，检测物质的浓 度正在从μg/mL级别下降至ng/mL级别，对于诊断试剂的灵敏度要求也越来越 高，对于传统的乳胶增强免疫比浊法来说需要进一步的提升检测的灵敏度，以适 应检测要求，传统的提升检测灵敏度的方法包括采用亲和力更高的抗体，采用更 大颗粒，稳定性更好的乳胶颗粒，选用更好的促进抗原抗体反应的缓冲液体系等， 但是这些都会增加试剂的成本，如何提升面对ng/mL级别被分析物的分析灵敏 度和精密度，同时不增加成本一直是试剂开发的一大挑战。

现有技术中，目前尚无利用乳胶增强免疫比浊法测定人体粪便中胰弹性蛋白 酶1的相关试剂盒及检测方法。且目前的乳胶增强免疫比浊法是基于多克隆抗体， 并未有记载基于单克隆抗体的检测方法。

发明内容

为此，本发明正是要解决上述技术问题，从而提出一种利用乳胶增强免疫比 浊法定量测定人体粪胰弹性蛋白酶1的试剂盒及其应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明的一个方面是提供可以用于乳胶比浊法检测的胰弹性蛋白酶1的单克 隆抗体。在一个具体的实施例中，所述的单抗是结合文献并应用DNASTAR软 件,对胰弹性蛋白酶1蛋白序列(SEQ ID NO:1)的抗原性、亲水性及表面结构 可能性进行分析,选择抗原性高,亲水性强,表面可能性大的17个氨基酸左右的肽 段作为免疫肽段：LPQEGAILANNSPCYITC(命名为FE-1-AG，SEQ ID NO:2)， 序列对应于蛋白的132-148位的氨基酸，末端的半胱氨酸是人为加上的,以提供 游离巯基与载体蛋白偶联。委托杭州中肽生化有限公司进行免疫肽段的合成及偶 联，并提供完整的质检报告，并与核酸数据库比对以确定其特异性。在一个具体 的实施例中，所述的抗体制备过程如下：

(1)抗原制备，

(2)动物免疫BALB/C小鼠免疫，

(3)细胞融合，

(4)单克隆抗体筛选，

(5)单克隆抗体制备。

本发明的一个方面是提供一种定量测定粪便中胰弹性蛋白酶1的试剂盒，所 述试剂盒包括试剂1、试剂2和胰弹性蛋白酶1抗原校准品溶液；其中，所述试 剂1包括电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；所述试剂2包括包 被抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体的乳胶颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、 防腐剂、缓冲液；所述胰弹性蛋白酶1抗原校准品溶液包括胰弹性蛋白酶1和 稳定剂。在一个具体的实施例中，所述抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体通过化学 交联偶联于所述乳胶颗粒表面，所述化学交联包括如下步骤：

S1、向交联缓冲溶液中加入乳胶颗粒和交联表面活性剂，得到乳胶颗粒溶液；

S2、将抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体溶解于交联缓冲溶液中，至浓度为 1-10μmol/mL，得到抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体溶液；

S3、将所述乳胶颗粒溶液与所述抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体溶液混合， 加入化学交联剂后在室温下反应1-3h，即得包被抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗 体的乳胶颗粒。

在另外一个具体实施例中，所述电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁 中的至少一种，在试剂中的浓度为0.1-10％。

在另外一个具体实施例中，所述稳定剂为酪蛋白、甘露醇、壳聚糖、乙二胺 四乙酸二钠、牛血清白蛋白中的至少一种，在试剂中的浓度为0.1-10％。

在另外一个具体实施例中，所述缓冲液为MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸 盐缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，所述缓冲液的浓度为 10-500mmol/L，所述缓冲液的pH值为5-9。

在另外一个具体实施例中，所述表面活性剂为吐温、脂肪醇聚乙二醇醚、聚 氧乙烯苯基醚中的至少一种，所述表面活性剂在试剂中的浓度为0.1-10％。

在另外一个具体实施例中，所述防腐剂为叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对 羟基苯甲酸乙酯、Proclin防腐剂中的至少一种，所述防腐剂在试剂中的浓度为 0.1-10％。

在另外一个具体实施例中，所述化学交联剂为EDC、N-羟基琥珀酰亚胺、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾中的至少一种；所述交联 缓冲液为MES、MOPSO、MOPS、HEPES、PBS缓冲液中的一种，所述交联 缓冲液的pH值为6-9。

在另外一个具体实施例中，所述胰弹性蛋白酶1抗原校准品溶液中，胰弹性 蛋白酶1的浓度为0.01-1600μg/mL。

本发明还提供一种定量测定粪便中胰弹性蛋白酶1的试剂盒在检测胰腺外分 泌功能中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明所述的定量测定粪便中胰弹性蛋白酶1的试剂盒，所述试剂盒包括试 剂1、试剂2和胰弹性蛋白酶1抗原校准品溶液；其中，所述R1试剂包括电解 质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；所述试剂2包括包被抗人胰弹性 蛋白酶1单克隆抗体的乳胶颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、缓冲 液；所述胰弹性蛋白酶1抗原校准品溶液包括胰弹性蛋白酶1和稳定剂。所述 试剂盒是一种利用乳胶增强免疫比浊法测定粪便中胰弹性蛋白酶1的装置，具 有稳定准确、省时省力的优点，可与全自动生化分析仪相结合，实现全自动快速 测定样品的临床检测分析的效果，与传统免疫比浊试剂相比，检测灵敏度提高了 10倍以上，抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体通过化学交联的方法偶联于乳胶颗 粒表面，乳胶颗粒与抗体Fc片段之间通过化学键结合，提高了抗体的结合率

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并 结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例所述的定量测定粪便中胰弹性蛋白酶1的试剂盒检测试 样时吸光度差值曲线图，其中，x轴表示反应时间(每个点为22.5秒)，y轴表示 吸光度值；

图2是本发明实施例所述的定量测定粪便中胰弹性蛋白酶1的试剂盒测试胰 弹性蛋白酶1标准品的标准曲线图，其中，x轴表示胰弹性蛋白酶1的浓度(μ g/ml)，y轴表示吸光度的差值。

具体实施方式

实施例1单抗制备

a)由公司合成能够表达上述抗原多肽的原核表达质粒pET-28a(+)，质粒命 名为pET-EF-1-AG；

b)将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经卡那青霉素抗性筛选， 挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET -EF-1-AG的工程菌。

c)表达纯化重组抗原蛋白——重组质粒pET-EF-1-AG在E.coliBL21(DE3) 中的表达和纯化：将含有重组质粒pET-EF-1-AG的E.coliBL21(DE3)单菌落 接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下200r/min震 荡培养9～10h，将5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培 养基中，1：100扩大培养2h，至OD600约为0.6。向菌液中加入终浓度为 0.6mmol/l的IPTG，16℃震荡培养过夜。离心收集过夜诱导的菌体，LysisBuffer 重悬，冰浴30min后超声破碎15min，离心收集上清。用Ni-NTA纯化上清液 中的重组GroEL蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含 200mmol/l咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。

(2)动物免疫BALB/C小鼠免疫

第1天经眼静脉采集免疫前小鼠血清作为阴性对照。起始免疫抗原重组蛋白 20μg与等体积的弗氏完全佐剂混合,采用注射器法使抗原和佐剂充分乳化。对小 鼠进行腹腔多点皮下注射。第14天加强免疫抗原用量为初始免疫量的，与等体 积的弗氏不完全佐剂充分乳化，采用腹腔多点注射。第21天静脉取血，间接方 法检测抗体滴度。第28天加强免疫直到产生满意的免疫效果。冲击免疫，在融 合前三天进行一次免疫。

(3)细胞融合

无菌条件下取免疫后的小鼠脾脏，放入平皿中用不完全培养基冲洗脾脏组织， 用两只镊子剥离脾脏包膜并将脾脏组织镊碎，使细胞尽可能多地游离加入更多的 不完全培养基，以利于过滤用目不锈钢丝网，过滤脾细胞。过滤前先从下面湿润 网，将细胞过滤入50mL融合管将生长状态好、处于对数生长期的SP2/0细胞 与脾细胞混合，比例为1:10。

以分子量为1500的PEG为介导进行融合，离心后用HAT培养基重悬细胞， 并用该含有细胞的HAT培养基铺孔板，每孔2滴。置于37℃，5％CO2培养箱 中培养。融合后第3天用HAT培养基半量换液，第五天、第七天分别半量换液 一次。两周后换HT培养基。

(4)单克隆抗体筛选

观察杂交瘤细胞的生长情况，当克隆生长至孔底面积的1/3-1/2时，取上清， 用间接方法进行检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行 克隆化培养，五次后，克隆化细胞抗体阳性率为100％。将阳性克隆细胞进行进 一步扩大培养。杂交瘤细胞经体外连续传代3月以上，反复冻存、复苏，定期收 集上清，用筛选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗 体。

(5)单克隆抗体制备

选用12周龄以上的小鼠,腹腔注射液体石蜡，一周后收集生长状态良好的单 克隆杂交瘤细胞，每只小鼠腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞。7-10天后收集腹水，>

实施例2标准品制备

a)由公司合成能够表达上述全长多肽的原核表达质粒pET-28a(+)，质粒命 名为pET-EF-1；

b)将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经卡那青霉素抗性筛选， 挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET-EF-1的 工程菌。

c)表达纯化重组抗原蛋白——重组质粒pET-EF-1在E.coliBL21(DE3)中 的表达和纯化：将含有重组质粒pET-EF-1的E.coliBL21(DE3)单菌落接种于 5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下180r/min震荡培养9～10h，将5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中， 1：100扩大培养2h，至OD600约为0.6。向菌液中加入终浓度为0.6mmol/l 的IPTG，16℃震荡培养过夜。离心收集过夜诱导的菌体，Lysis Buffer重悬，冰浴30min后超声破碎15min，离心收集上清。用Ni-NTA纯化上清液中的重 组GroEL蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/l 咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。

实施例3试剂盒制备

本实施例提供一种定量测定粪便中胰弹性蛋白酶1的试剂盒，所述试剂盒包 括试剂1、试剂2和胰弹性蛋白酶1抗原校准品溶液。

其中，所述试剂1由如下配比的组分组成：0.2％的电解质、8％的稳定剂、 0.15％的表面活性剂、5％的防腐剂，余量为浓度10mmol/L的缓冲液，所述电 解质为氯化钠，所述稳定剂为酪蛋白，所述表面活性剂为吐温，所述防腐剂为叠 氮钠，所述缓冲液为MED缓冲液，其pH值为6.5。

所述试剂2由如下配比的组分组成：4mg/mL的包被抗人胰弹性蛋白酶1单 克隆抗体的乳胶颗粒、0.2％的电解质、8％的稳定剂、0.15％的表面活性剂、5％ 的防腐剂、余量为浓度10mmol/L的缓冲液。所述电解质为氯化钾，所述稳定剂 为甘露醇，所述表面活性剂为脂肪醇聚乙二醇醚，所述防腐剂为苯酚，所述缓 冲液为磷酸缓冲液，其pH值为6.5。

本实施例中，所述抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体通过化学交联的方法偶联 于乳胶颗粒表面，具体包括如下步骤：

S1、将100mg的乳胶颗粒在5ml MES缓冲液中(50mM,pH 6.5)，加入交联 表面活性剂SDS(最终浓度0.01％)，得到乳胶颗粒溶液，所述乳胶颗粒的粒径 为100-500nm。

S2、将抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体溶解于5ml MES交联缓冲溶液 (50mM，pH6.5)中，至浓度为1μmol/mL，得到抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体 溶液。

S3、将所述乳胶颗粒溶液与所述抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体溶液混合， 加入100mg化学交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)后在 室温下反应2h，即得包被抗人胰弹性蛋白酶1单克隆抗体的乳胶颗粒。

所述胰弹性蛋白酶1抗原校准品溶液包括胰弹性蛋白酶1和稳定剂，所述胰 弹性蛋白酶1的浓度为0μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、 1500μg/mL，所述稳定剂为牛血清白蛋白。

实验例4试剂盒应用

1、标准品的制备

以通过基因重组技术提纯的人胰弹性蛋白酶1为母液，使用牛血清白蛋白梯 度稀释母液，制备校准品：S5：1600μg/mL，S4：800μg/mL，S3：400μg/mL， S2：200μg/mL，S1：100μg/mL，S0：0μg/mL。所述牛血清白蛋白浓度为1～ 9999μg/mL。

2、质控品的制备

以通过基因重组技术提纯的人胰弹性蛋白酶1为母液，使用牛血清白蛋白梯 度稀释母液，制备两种浓度的质控品：C1：300μg/mL，C2：110μg/mL。所述 牛血清白蛋白浓度1～9999μg/mL。

3、标准曲线的制定

使用全自动生化分析仪检测主波长：600nm，副波长：750nm。

试剂用量：样本3μl；试剂1：300μl；试剂2：100μl。

测定方法(两点终点法)：300μl试剂1加入3μl样本，于37℃反应5分钟， 然后加入100μl试剂2即开始读点测得吸光度A1，10分钟之后再次读点测得 吸光度A2，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1，如图1所示。

制作标准曲线：采用本发明的胰弹性蛋白酶1标准品，浓度分别为S6：1600 μg/mL，S5：800μg/mL，S4：400μg/mL，S3：200μg/mL，S2：100μg/mL， S1：50μg/mL,S0：0μg/mL。按照上述步骤测得本发明胰弹性蛋白酶1标准品 的标准曲线。如图2所示。图2中曲线上的每个点代表一个含量的标准品，其 中x轴表示胰弹性蛋白酶1的浓度，y轴表示吸光度的差值。

4、线性范围的确定

将接近线性范围上限的胰弹性蛋白酶1高浓度样本1600μg/mL，用生理盐水 按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的比例稀释，共配制成6个不同浓度的溶液，另 以不含胰弹性蛋白酶1的生理盐水作为空白溶液。用所述两点终点法检测各浓度， 将测定浓度值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程为：y＝ 0.9893x-0.944，相关系数r＝0.9998，表明本发明试剂盒在0～1600μg/mL线性 范围内相关性较好。

5、准确度测定

使用本发明的试剂盒采用全自动生化分析仪对20例人(深圳市大鹏新区葵涌 人民医院)进行粪便测定(≥200μg/mL为正常标本，100-200μg/mL为轻中度胰 腺外分泌功能不全标本，<100μg/mL为重度胰腺外分泌功能不全标本)。测试结 果如下表1所示，结果显示本发明的试剂盒和临床病症的相关性很高。

表1

6、灵敏度测定

灵敏度定义为单位浓度吸光度的变化。用胰弹性蛋白酶1校准品对胰弹性 蛋白酶1试剂在全自动生化分析仪上定标，记录校准品(浓度为100μg/mL)时试 剂反应的吸光度变化为0.09，即该试剂在校准浓度为100μg/mL时的灵敏度为 0.09。

7、批内精密度的测定

按本发明试剂盒测定同一份样本10次，计算测定均值和批内精密度，测试 结果如表2所示，结果显示批内精密度为1.7％。

表2

8、抗干扰分析

干扰物选择配方和测试结果如下表3所示。结果显示，使用本发明所述的试 剂盒抗干扰能力良好。

表3

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限 定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不 同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引 伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 深圳市鸿美诊断技术有限公司

<120> 乳胶增强免疫比浊法测定粪胰弹性蛋白酶-1

<130> 1

<141> 2019-09-10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 258

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Leu Val Leu Tyr Gly His Ser Thr Gln Asp Leu Pro Glu Thr Asn

1 5 1015

Ala Arg Val Val Gly Gly Thr Glu Ala Gly Arg Asn Ser Trp Pro Ser

202530

Gln Ile Ser Leu Gln Tyr Arg Ser Gly Gly Ser Arg Tyr His Thr Cys

354045

Gly Gly Thr Leu Ile Arg Gln Asn Trp Val Met Thr Ala Ala His Cys

505560

Val Asp Tyr Gln Lys Thr Phe Arg Val Val Ala Gly Asp His Asn Leu

65707580

Ser Gln Asn Asp Gly Thr Glu Gln Tyr Val Ser Val Gln Lys Ile Val

859095

Val His Pro Tyr Trp Asn Ser Asp Asn Val Ala Ala Gly Tyr Asp Ile

100 105 110

Ala Leu Leu Arg Leu Ala Gln Ser Val Thr Leu Asn Ser Tyr Val Gln

115 120 125

Leu Gly Val Leu Pro Gln Glu Gly Ala Ile Leu Ala Asn Asn Ser Pro

130 135 140

Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Lys Thr Lys Thr Asn Gly Gln Leu Ala

145 150 155 160

Gln Thr Leu Gln Gln Ala Tyr Leu Pro Ser Val Asp Tyr Ala Ile Cys

165 170 175

Ser Ser Ser Ser Tyr Trp Gly Ser Thr Val Lys Asn Thr Met Val Cys

180 185 190

Ala Gly Gly Asp Gly Val Arg Ser Gly Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly

195 200 205

Pro Leu His Cys Leu Val Asn Gly Lys Tyr Ser Val His Gly Val Thr

210 215 220

Ser Phe Val Ser Ser Arg Gly Cys Asn Val Ser Arg Lys Pro Thr Val

225 230 235 240

Phe Thr Gln Val Ser Ala Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Asn Val Ile Ala

245 250 255

Ser Asn

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Leu Pro Gln Glu Gly Ala Ile Leu Ala Asn Asn Ser Pro Cys Tyr Ile

1 5 1015

Thr Cys