一种评价肌浆网钙泄漏的方法

摘要

一种评价肌浆网钙泄漏的方法，步骤1)进行心肌细胞离体分离与培养实验并在激光共聚焦显微镜记录心肌细胞的钙活动；步骤2)对步骤1)采集的荧光图像进行标准化，再对标准化处理后的图像进行荧光强度统计，获取其幅度分布直方图；步骤3)对步骤2)中幅度分布直方图围成的曲线进行以其峰值为中心的左右不对称高斯拟合，通过原曲线及拟合曲线中心两侧的面积计算得到荧光偏差参量；步骤4)、对原始图像进行时间差分，得到流量图：对流量图重复步骤3)的操作，得到其幅度分布直方图后进行不对称高斯拟合，再通过计算得到流量偏差参量，得到两个描述肌浆网钙泄漏的新参数。本发明能够更加快速有效且准确的评价肌浆网钙泄漏水平。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学图像处理技术领域，具体涉及一种评价肌浆网钙泄漏的方法。

背景技术

心血管疾病患病人数日益增加，已经成为我国居民因病致死的主要病因。钙离子所参与的钙信号传递是影响心脏生理功能的重要机制，它的正常与否直接决定并调控着心肌细胞的兴奋收缩。已有研究表明，心律失常、心衰等心血管疾病的发生与心肌细胞钙信号异常密切相关，因此胞浆内钙离子浓度是后续钙离子调控心肌细胞活动的的基石。

由于钙泄漏的表现形式有多种，包括钙火花，钙波等。但其中钙火花还是主要存在形式。钙火花是心肌细胞钙信号的最基本单元，他描述的就是细胞内大量存储钙离子的肌浆网通过单一或少量雷诺丁受体RyR开放从而释放钙离子进入细胞质内这一钙活动的过程。Bassani与Bers等人通过使用毒胡萝卜素来抑制肌浆网钙离子回收通道SERCA回摄Ca2+，同时结合咖啡因测量肌浆网钙离子浓度的方式，第一次检测到了细胞膜穿透情况下单向的兔心肌细胞肌浆网的钙泄漏值。但是细胞膜的穿透显然极大降低了细胞的完整性，会严重影响其生理功能，因此这样的测量方式难以具有显著的生理意义。而Shannon等人则是采用无Ca2+无Na+但包含丁卡因的细胞外液下在完整的心肌细胞上测量不同时间点或条件下的肌浆网钙离子浓度变化情况，从而得出一条肌浆网钙泄漏-负载曲线。但是上述过程对钙泄漏的测量都是间接的，并且在非正常生理条件下心肌细胞也将产生无可预知的变化，因此此时测量的钙泄漏其病理生理价值将受到限制。另外在直观测量上，由于肌浆网钙负载的增加会使得钙火花发生频率指数型增加，因此尽管钙火花仅代表一部分钙泄漏，但其仍旧不失为测量肌浆网钙泄漏的一个有效指标。但现有的钙火花检测方式由于经验参数的存在，其结果很大程度上受到研究者主观因素的影响；并且部分钙火花幅度与持续时间变化较大，这也使得检测难度升高，难以控制其与真实值误差。因而由钙火花测量所得出的钙泄漏情况也不尽如人意。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种评价肌浆网钙泄漏的方法，基于激光共聚焦线扫描荧光图像的肌浆网钙泄漏程度评价方法，具有数据来源精确，实验操作简单，结论获取快捷的特点。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种评价肌浆网钙泄漏的方法，包括以下步骤：

步骤1)

进行心肌细胞离体分离与培养实验并用激光共聚焦显微镜采集荧光图像记录心肌细胞的钙活动；

步骤2)

对步骤1)采集的荧光图像进行标准化，再对标准化处理后的图像进行荧光强度统计，获取其幅度分布直方图；

步骤3)

对步骤2)中幅度分布直方图围成的曲线进行以其峰值为中心的左右不对称高斯拟合，通过原曲线及拟合曲线中心两侧的面积计算得到荧光偏差参量R_fluo；

步骤4)

对原始图像进行时间差分，得到全新流量图：

y₂(x，t)＝y(x，t)-y(x，t-1)

对流量图重复步骤3)的操作，得到其幅度分布直方图后进行不对称高斯拟合，再通过原曲线及拟合曲线中心两侧的面积计算得到流量偏差参量R_flow，至此得到两个描述肌浆网钙泄漏的新参数。

其中步骤2)-4)可在计算机系统中执行，其第一虚拟模块执行步骤2)，第二虚拟模块执行步骤3)，第三虚拟模块执行步骤4)，所得结果可通过显示设备显示。

进一步的，步骤1)中，分离下来的心肌细胞需在生长状况良好的情况下用荧光染料染色，再使用激光共聚焦显微镜通过线扫描的方式记录细胞钙活动情况。

进一步的，步骤2)中，对于采集到的荧光图像，先获取荧光基线值，再用图像上各点荧光强度除以基线强度，得到标准化图像：

其中ΔF为各点荧光强度，而F₀则为基线荧光强度。

进一步的，对幅度分布直方图以其峰值为中心，将曲线左右两部分分别用参数不同的高斯函数进行拟和：

其中，A为峰值；b为峰值对应位置的横坐标，即中心位置；C1、C2分别为中心位置左右两侧的半高宽。x_max为曲线峰值所在位置横坐标。

进一步的，对幅度分布直方曲线及拟和后曲线分别计算其面积：

其中x1，x2为计算的起止位置。

进一步的，得到荧光偏差参量：

其中S₁为幅度分布直方图中心位置左侧面积，S₂为幅度分布直方图中心位置右侧面积，S_N2为拟合曲线中心位置右侧面积。

进一步的，与上述过程相同，计算得出流量偏差参量：

其中S′₁为流量图的幅度分布直方图中心位置左侧面积，S′₂为幅度分布直方图中心位置右侧面积，S′_N2为拟合曲线中心位置右侧面积。

本发明的有益效果：

本发明一种基于激光共聚焦线扫描荧光图像的肌浆网钙泄漏评价方法，通过培养离体的心肌细胞并使用荧光指示剂染色后于激光共聚焦显微镜下观察并记录钙火花荧光信号；然后对荧光信号图像进行标准化预处理；然后通过对标准化后钙火花图像荧光强度的幅度分布直方图进行面积计算，得到其相对荧光释放量与总荧光量的比值，我们叫他荧光偏差参量；最后对原始图像进行时间差分，再对差分后的图像进行面积计算，得到其相对荧光释放量与总荧光量的比值，为流量偏差参量。荧光偏差参量和流量偏差参量均可作为评价肌浆网钙泄漏的有效指标。相比于其他指标，该两项指标来源于激光共聚焦显微图像，数据来源更直接更精确。但相比于通过检测钙火花的释放来评价肌浆网钙泄漏，本发明规避了钙火花检测时由于均值方差等参数的计算以及经验参数的判定等原因所无法避免的检测误差，从荧光图像的整体荧光强度入手评价肌浆网的钙泄漏情况。应用此方法能够更加快速有效且准确的评价肌浆网钙泄漏水平。

附图说明

图1为激光共聚焦显微镜线扫描下钙火花图像。

图2为标准化后的钙火花图像。

图3为标准化后钙火花图像的荧光幅度分布直方图及其拟合曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

一种基于激光共聚焦线扫描荧光图像的肌浆网钙泄漏程度评价方法，包括以下步骤：

步骤1)、进行心肌细胞离体分离与培养实验并在激光共聚焦显微镜记录心肌细胞的钙活动。

步骤2)、对步骤1)采集的荧光图像进行标准化，再对标准化处理后的图像进行荧光强度统计，获取其幅度分布直方图。

步骤3)、对步骤2)中幅度分布直方图围成的曲线进行以其峰值为中心的左右不对称高斯拟合，通过原曲线及拟合曲线中心两侧的面积计算得到荧光偏差参量R_fluo。

步骤4)、对原始图像进行时间差分，得到全新流量图：

y₂(x，t)＝y(x，t)-y(x，t-1)

对流量图重复步骤3)的操作，得到其幅度分布直方图后进行不对称高斯拟合，再通过原曲线及拟合曲线中心两侧的面积计算得到流量偏差参量R_flow。以此得到两个描述肌浆网钙泄漏的新参数。

1、观察并记录心肌细胞肌浆网钙泄漏：

将心肌细胞进行分离与离体培养，然后对生理状况良好的细胞使用荧光指示剂进行染色，然后使用激光共聚焦显微镜获取肌浆网钙活动荧光图像。

具体的，采用的实验具体过程：选取成年小鼠进行麻醉，随后取下心脏，再进行Legendoff离体灌流，使用胶原酶对细胞进行消化。一段时间后从灌流器上取下心脏，在缓冲液中将心脏剪碎，并使用胶头滴管进行吹打，使心脏组织块散开，获得离散的心肌细胞。将分离下来的心肌细胞在培养箱中进行培养，择生理状况良好的细胞使用Fluo-4荧光指示剂对细胞进行染色，使细胞在荧光指示剂工作液中适温培养20分钟，随后再换用胎牛血清缓冲液培养，最后使用HEPES缓冲液清洗细胞并使之重悬，制成细胞液。将细胞液置于激光共聚焦显微镜之下，激发光波长488nm，发射波长516nm。，线扫描记录，获得心肌细胞肌浆网钙活动荧光图像。

2、图像预处理

(1)图像标准化

采集到的荧光图像对其反复求取均值后保留小于均值的部分，从而获取荧光基线值，再用图像上各点荧光强度除以基线强度，得到标准化图像：

其中ΔF为各点荧光强度，而F₀则为基线荧光强度。

(2)计算流量图

对标准化后的荧光图像进行时间差分，计算得出流量图：

y₂(x，t)＝y(x，t+1)-y(x，t)

该流量图反映的是荧光强度随时间的变化情况，不受荧光信号释放时长的影响。

(3)计算幅度分布直方图拟合线

分别获取标准化后的原始图像及差分后流量图的幅度分布直方图，对两个幅度分布直方图以其峰值为中心，将曲线左右两部分分别用参数不同的高斯函数进行拟和：

其中，A为峰值；b为峰值对应位置的横坐标，即中心位置；c1、c2分别为中心位置左右两侧的半高宽。x_max为曲线峰值所在位置横坐标。

3、钙泄漏参数计算

根据上述过程得到的幅度分布直方图曲线及其拟合曲线以峰值所在位置为中心，分别对其左右进行面积计算：

其中x1，x2为计算的起止位置。

(1)计算荧光偏差参量(R_fluo)：

其中S₁为幅度分布直方图中心位置左侧面积，S₂为幅度分布直方图中心位置右侧面积，S_N2为拟合曲线中心位置右侧面积。

(2)计算得出流量偏差参量(R_flow)：

其中S′₁为流量图的幅度分布直方图中心位置左侧面积，S′₂为幅度分布直方图中心位置右侧面积，S′_N2为拟合曲线中心位置右侧面积。

4、传统钙泄漏描述情况

为了与传统描述钙泄漏情况的方法进行对比，在本次举例中，将采集到的野生型小鼠和CPVT病理模型小鼠的两组钙信号荧光图像，先通过常规方式在标准化后检测其钙火花情况，并统计其钙火花释放频率(Frequency)与钙离子释放量(ReleaseMass&Signalmass)。具体的：

SignalMass＝∑Amplitude*FWHM*riseTime

ReleaseMass＝∑Amplitude*FWHM

其中此二者释放量均为叠加图像上所有检测到的单个钙火花的释放量得出的。

表1野生型和病理模型小鼠钙泄漏独立t检验结果

(注：与野生型相比，*表示存在显著差异，数据表示为mean±SEM)

由统计结果可以看到，相比于野生型，CPVT病理模型小鼠的心肌细胞钙火花发生频率显著增高，考虑到时间参数与不考虑时间参数的释放量均显著增大，可得出结论：CPVT病理模型下的小鼠心肌细胞肌浆网钙泄漏多于野生型小鼠。

5、新参数统计结果分析

表2新偏差参量统计结果

(注：与野生型相比，^*表示存在显著差异，数据表示为mean±SEM)

从从表中统计结果可以看出，CPVT病理模型小鼠的荧光偏差参量和流量偏差参量均有显著增加。出现这一结果的主要原因是，CPVT病理模型小鼠的RyR调控基因的某一位点被敲除，影响了RyR正常生理功能，使之倾向于不正常开放。

6、新参数与钙火花计算参数相关性分析

利用三个参数：钙火花频率、钙离子平面释放量ReleaseMass及时空释放量Signalmass，分别与流量偏差参量Rfluo和荧光偏差参量Rflow进行Pearson相关性分析。结果如表3，及表4所示。

表3荧光偏差参量与钙火花参数的相关结果

通过表3的荧光偏差参量与钙火花参数的相关结果我们可以得出，荧光偏差参量与钙火花发生频率及考虑时间参数的钙离子释放量Signalmass及不考虑时间参数的平面钙离子释放量ReleaseMass均有很好的相关性，且全部呈现正相关的关系。并且由于荧光偏差参量受到钙火花持续时间的影响，因此与考虑时间参数的钙离子释放量Signalmass相关性最高，这也符合我们的预期猜想。因此荧光偏差参量可以作为评价心肌细胞肌浆网钙泄漏的有效指标。

表4流量偏差参量与钙火花参数的相关结果

通过表4的流量偏差参量与钙火花参数的相关结果我们可以得出，流量偏差参量与钙火花发生频率及考虑时间参数的钙离子释放量Signalmass及不考虑时间参数的平面钙离子释放量ReleaseMass均有很好的相关性，且全部呈现正相关的关系。并且由于流量偏差参量是由时间差分图像得出，不受钙火花持续时间的影响，因此与不考虑时间参数的钙离子释放量ReleaseMass相关性最强，这也符合我们的预期猜想。因此流量偏差参量可以作为评价心肌细胞肌浆网钙泄漏的有效指标。

在本次举例说明中，选用了野生型及病理模型小鼠的心肌细胞的钙泄漏数据作为处理对象，使用传统的荧光指示剂染色激光共聚焦显微镜记录荧光信号的实验方式获取数据。应用本发明所提及的方法可以得到两个有效描述肌浆网钙泄漏程度的指标：荧光偏差参量和流量偏差参量。并且，本次举例中还一并提取并分析了传统的钙火花参数。用荧光及流量偏差参量分别与由提取钙火花得到的参量钙火花频率，和两种钙离子释放量进行对比分析和相关分析。结果证明，荧光偏差参量和流量偏差参量均可以作为评价肌浆网钙泄漏的有效指标。相比于传统测量肌浆网钙泄漏的方式，本方法数据测量更加简便直接；相比于用钙火花相关参量表示钙泄漏，本方法避免了钙火花探测过程中人为设定阈值参数所带来的不可避免的检测误差。因此，应用此方法能够更加简便，直接且客观的对肌浆网钙泄漏进行有效评价。

如图1所示：图中为激光共聚焦显微镜线扫描钙火花荧光信号的典型图像。图中横坐标为时间，纵坐标为位置，显示的是该扫描线所在位置每一点的荧光信号强度随时间的变化情况。图中间断性随机出现的荧光点即为钙火花，反映了该处的肌浆网上RyR的钙泄漏事件。其他位置的荧光强度为背景噪声信号，可能由细胞内多余染料或其他杂质引起。

如图2所示：图中为激光共聚焦显微镜线扫描钙火花荧光信号经过标准化后得到的图像。从图中可以看出，经过标准化处理后，荧光图像的背景信号被很好的去除，感兴趣的荧光信号部分，如钙火花，其信号强度相对于背景信号有了很大的提升，信号更显著，对比度更高，也因此更易获取目标信息。

如图3所示：图中为标准化后图像的荧光强度幅度分布直方图及其拟和曲线，其横轴为荧光幅度，纵轴为图像上该幅度出现频次。其中平滑曲线为拟和曲线，不平滑的一条散点曲线为幅度分布直方图轮廓曲线。拟和时，以幅度分布直方图轮廓曲线峰值所在位置为中心，进行左右两侧不对称的加权高斯拟合，其中越靠近峰值的位置权重越高。从图中可以看到，中心位置左侧拟和程度高，而右侧越远离中心偏差越大。前期已被证明，激光共聚焦显微镜背景荧光噪声的强度分布符合泊松分布，因此我们对幅度分布直方图的左右两侧进行不对称高斯拟合刚好可以模拟泊松分布。而幅度分布直方图上荧光强度越大的部分，与背景噪声相关性越低，而与肌浆网钙泄露活动相关性越高。因此此图结果符合预想，且可有效评价肌浆网钙泄露情况。