一种原油降解微生物功能互补的配伍方法及其指导配伍的原油降解菌群

摘要

本发明公开了一种利用功能互补的方法来配伍降解原油菌群及所得降解原油的菌群。本发明提供的菌群的配伍方法包括：将类型一、类型二、类型三、类型四和类型五中的至少四种类型的菌株组合在一起，得到用于降解原油的菌群；类型一、类型二、类型三、类型四和类型五对十六烷和菲的降解率不同。利用本发明的菌群的配伍方法获得的菌群降解原油，降解率均可达到60％以上，菌群A、菌群B和菌群C对原油的降解率均达到了90％以上。表明，利用本发明的用于降解原油的菌群的配伍方法以及所得到的菌群可以提高原油降解率，可用于降解原油。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种原油降解微生物功能互补的配伍方法及其指导配伍的原油降解菌群。

背景技术

石油在全世界范围内被广泛的应用。其开采、运输、储存、加工等过程中的泄漏，致使大量的石油及其产品进入环境，造成严重石油污染。原油由饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质成分组成，其可通过呼吸、皮肤接触、饮食等途径进入人体，影响肝、肾等器官的正常功能，甚至存在潜在的致癌、致畸、致突变作用。目前，石油污染治理是全世界关注的热点之一。。

石油污染修复技术主要分为物理修复、化学修复和生物修复等类型。物理或化学修复技术通常具有速度快，处理彻底等优点，但是成本高，容易产生二次污染。生物修复技术因其成本低、效果好、绿色环保被认为是最有前景的可靠的土壤污染治理技术之一。自然界中，微生物通常以群落方式共生于环境中，它们的很多特性和功能都基于整个群落。由于微生物个体间相互影响，微生物群落作为一个整体的重要性不可忽视。然而目前通常采用的生物修复技术中对微生物的相互联系不够重视，而是将微生物菌株进行随机组合来配伍，对于菌株的筛选和组合完全是一个随机的过程，却忽略了外源微生物和目标环境中的本源微生物的拮抗作用。

发明内容

本发明的目的是提供利用“功能互补”原则来进行降解原油的微生物菌群配伍的方法以及所得菌群。该“功能互补”配伍方法利用具有不同功能的菌株，在“功能互补”的基础上进行配伍形成微生物菌群，实现对原油的快速降解。

本发明提供的“功能互补”配伍方法(即用于降解原油的菌群的配伍方法)包括：将类型一、类型二、类型三、类型四和类型五中的至少四种类型的菌株组合在一起，得到用于降解原油的菌群；

所述类型一的菌株满足如下条件：对十六烷的降解率大于等于80％，对菲的降解率大于等于65％；

所述类型二的菌株满足如下条件：对十六烷的降解率大于等于80％，对菲的降解率低于40％；

所述类型三的菌株满足如下条件：对十六烷的降解率低于60％，对菲的降解率大于等于65％；

所述类型四的菌株满足如下条件：对十六烷的降解率大于等于60％小于80％，对菲的降解率大于等于40％小于65％；

所述类型五的菌株满足如下条件：对十六烷的降解率小于60％，对菲的降解率小于40％。

上述方法中，所述菌群中可含有所述类型一、所述类型二、所述类型三、所述类型四和所述类型五中的四种类型。

上述方法中，所述菌群中各类型菌株的菌量可相等。

上述方法中，所述菌群中同种类型的菌株菌量可相等。

利用所述用于降解原油的菌群的配伍方法得到的菌群，也属于本发明的保护范围。

上述菌群中，所述类型一的菌株可为Paracoccus marcusii和/或Brevundimonasdiminuta；

所述类型二的菌株可为Rhodococcus erythropolis；

所述类型三的菌株可为Aquamicrobium lusatiense；

所述类型四的菌株可为Acinetobacter pittii；

所述类型五的菌株可为Pseudomonas putida和/或Sphingobacterium suaedae。

上述菌群中，所述菌群为可菌群A、菌群B、菌群C、菌群D、菌群E、菌群F、菌群G、菌群H、菌群I、菌群J、菌群K、菌群L、菌群M、菌群N、菌群O或菌群P；

所述菌群A由Paracoccus marcusii、Aquamicrobium lusatiense、Acinetobacterpittii和Sphingobacterium suaedae组成；

所述菌群B由Brevundimonas diminuta、Aquamicrobium lusatiense、Rhodococcus erythropolis和Acinetobacter pittii组成；

所述菌群C由Brevundimonas diminuta、Aquamicrobium lusatiense、Acinetobacter pittii和Pseudomonas putida组成；

所述菌群D由Aquamicrobium lusatiense、Rhodococcus erythropolis、Acinetobacter pittii和Sphingobacterium suaedae组成；

所述菌群E由Aquamicrobium lusatiense、Rhodococcus erythropolis、Acinetobacter pittii和Pseudomonas putida组成；

所述菌群F由Paracoccus marcusii、Aquamicrobium lusatiense、Rhodococcuserythropolis和Acinetobacter pittii组成；

所述菌群G由Paracoccus marcusii、Aquamicrobium lusatiense、Rhodococcuserythropolis和Sphingobacterium suaedae组成；

所述菌群H由Paracoccus marcusii、Aquamicrobium lusatiense、Rhodococcuserythropolis和Pseudomonas putida组成；

所述菌群I由Paracoccus marcusii、Aquamicrobium lusatiense、Acinetobacterpittii和Pseudomonas putida组成；

所述菌群J由aracoccus marcusii、Rhodococcus erythropolis、Acinetobacterpittii和Sphingobacterium suaedae组成；

所述菌群K由aracoccus marcusii、Rhodococcus erythropolis、Acinetobacterpittii和Pseudomonas putida组成；

所述菌群L由Brevundimonas diminuta、Aquamicrobium lusatiense、Rhodococcus erythropolis和Sphingobacterium suaedae组成；

所述菌群M由Brevundimonas diminuta、Aquamicrobium lusatiense、Rhodococcus erythropolis和Pseudomonas putida组成；

所述菌群N由Brevundimonas diminuta、Aquamicrobium lusatiense、Acinetobacter pittii和Sphingobacterium suaedae组成；

所述菌群O由Brevundimonas diminuta、Rhodococcus erythropolis、Acinetobacter pittii和Sphingobacterium suaedae组成；

所述菌群P由Brevundimonas diminuta、Rhodococcus erythropolis、Acinetobacter pittii和Pseudomonas putida组成。

上述菌群中，所述Paracoccus marcusii可为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.8602的菌株。

所述Rhodococcus erythropolis可为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.12196的菌株。

所述Aquamicrobium lusatiense可为中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CICC No.10733的菌株。

所述Acinetobacter pittii可为中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CICC No.10526的菌株。

所述Pseudomonas putida可为中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CICCNo.1036的菌株。

所述Brevundimonas diminuta可为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.8077的菌株。

所述Sphingobacterium suaedae可为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.15277的菌株。

所述菌群A、菌群B、菌群C、菌群D、菌群E、菌群F、菌群G、菌群H、菌群I、菌群J、菌群K、菌群L、菌群M、菌群N、菌群O和菌群P中，各菌株活菌量均相等。

本还提供了的原油的降解方法，所述方法包括：利用所述菌群处理待降解原油实现原油的降解。

上述方法中，利用所述菌群处理待降解原油可包括：向无机盐培养基中添加所述菌群，得到混合物；向所述混合物中添加待降解样品后进行培养实现原油的降解；

所述无机盐培养基含有如下物质：NH₄NO₃>2PO₄>2HPO₄>2>4·6H₂O>4>

所述微量元素溶液TES含有如下物质：ZnSO₄·7H₂O>4·4H₂O>3BO₃>4·5H₂O>2MoO₄·2H₂O>2·6H₂O>2·6H₂O>

所述混合物的OD600可为0.1。

上述方法中，所述培养可在30℃下进行。培养的时间以满足石油降解为准，在本发明的一个实施例中，培养时间为21天。培养可在动态环境中进行，如摇床中。在本发明的一个实施例中，摇床的转速为150rpm。

所述待降解样品可为原油或含有原油的物质。

本发明还提供了一种成套产品，所述成套产品由所述菌群与所述无机盐培养基组成。

所述成套产品具有如下任一功能：

X1)降解原油；

X2)制备降解原产品；

X3)消除或降低原油污染；

X4)制备消除或降低原油污染产品；

X5)消除或降低土壤原油污染；

X6)制备消除或降低土壤原油污染产品。

所述用于降解原油的菌群的配伍方法或所述菌群或所述成套产品的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

X1)降解原油；

X2)制备降解原产品；

X3)消除或降低原油污染；

X4)制备消除或降低原油污染产品；

X5)消除或降低土壤原油污染；

X6)制备消除或降低土壤原油污染产品。

利用本发明的用于降解原油的菌群的配伍方法获得的菌群降解原油，降解率均可达到60％以上，菌群A、菌群B和菌群C对原油的降解率均达到了90％以上。表明，利用本发明的用于降解原油的菌群的配伍方法以及所得到的菌群可以提高原油降解率，可用于降解原油。

附图说明

图1为各菌株对十六烷和菲的降解率。

图2为各菌群对石油的降解率的检测结果。横坐标为时间(min)，纵坐标为丰度。C1-1:菌群A；C2-1：菌群B；C3-1：菌群C；Oil：对照组(不加微生物)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

MSM培养基(即无机盐培养基)(1L)：NH₄NO₃>2PO₄，4g；Na₂HPO₄，5.68g；CaCl₂，0.78mg；MgSO₄·6H₂O，197.18mg；FeSO₄，1.112mg；微量元素溶液TES，0.1mL；补充去离子水至1L；调节pH>

微量元素溶液TES(1L)：ZnSO₄·7H₂O，2.32g；MnSO₄·4H₂O，1.78g；H₃BO₃，0.56g；CuSO₄·5H₂O，0.78g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.39g；CoCl₂·6H₂O，0.42g；EDTA，0.10g；NiCl₂·6H₂O，0.004g；KI，0.66g。

气相色谱-质谱联用仪GC-MS(7890-5975C，Agilent，USA)，pH计和凝胶成像系统(BIO-RAD，USA)。

实施例1、用于降解石油的菌株组合及其在降解石油中的应用

1、芳香烃降解菌的选择

选择15株不同种属的细菌，所用菌株信息及在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)和中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)的编号如下表所示：

按照如下方法分别检测这15株菌对人工原油的降解能力：

a)菌株从甘油管接入平板活化，挑取单克隆细胞后再转接试管进行培养，最终接入装有300mL LB培养基的500mL三角瓶培养获得种子液；

b)种子液培养至对数生长期后，于5000rpm，4℃离心10min收集细胞，并用无机盐培养基洗涤3次，饥饿处理30min，再用无机盐培养基悬浮得到菌株悬液，利用紫外分光光度计检测600nm波长下菌株悬液中的菌体浓度(OD600)；

c)将步骤b)获得的菌株悬液接种到含有0.77g·L^-1十六烷和1g·L^-1菲的无机盐培养基(该培养基为向无机盐培养基中添加十六烷和菲得到的十六烷和菲的浓度分别为0.77g·L^-1和1g·L^-1的培养基，该培养基中十六烷和菲的碳原子的摩尔质量比相等)中使菌株浓度达到OD600≈0.10，得到菌株培养基混合物；

d)将步骤c)得到的菌株培养基混合物在30度下，150rpm的条件下培养至稳定期，得到各菌株培养液；

e)检测各菌株培养液中的十六烷与菲的残留量，通过降解率评判这些菌株对人工原油的降解能力，十六烷与菲的残留量的检测步骤如下：

将步骤d)得到的100ml菌株培养液，利用30mL二硫化碳在250mL分液漏斗振荡器中进行萃取，用分液漏斗振荡器将混合液振荡10min，然后将其倒置静置10min，此时培养液被分为水相和有机相两部分，未被分解的人工石油被二硫化碳萃取在有机相溶液中。收集有机相溶液到准备好的50mL离心管中。取1.0mL有机相溶液，利用0.22μm的有机滤膜过滤，将滤液(即待测样品)收集在样品瓶中，检测待测样品中的十六烷和菲的含量。气质分析采用Agilent 7890C(GC)-5975C(MS)气质联用仪，色谱柱为Agilent HP-5AS(30m×0.25mm)；温度程序为40℃恒温10min，5℃/min升温至295℃,恒温29min。氦气载体流速为2.5ml/min。进样量为1μl，进样温度为295℃，分流比为29:1。检测器为四级杆质谱，质谱条件为：EI源，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，EI源电子能量69.9eV，质量范围为40-550m/z。

利用不添加各菌株作为对照组，其余记为实验组。

计算各菌株对十六烷和菲的降解率，十六烷降解率(％)＝(对照组十六烷峰图积分值-实验组十六烷的积分值)/对照组十六烷峰图积分值×100％，菲降解率(％)＝对照组菲峰图积分值-实验组菲的积分值)/对照组菲峰图积分值×100％，各菌株对十六烷和菲的降解率见表1和图1。

表1、各菌株对十六烷和菲的降解率(％)

根据对十六烷和菲的降解率的不同，将分离出的细菌分为如下五种类型：

类型一：对十六烷与菲均有显著降解效果的菌，即十六烷的降解率大于等于80％，菲的降解率大于等于65％；

类型二：对十六烷降解效果显著，但对菲降解效果不佳的菌，即十六烷的降解率大于等于80％，菲的降解率低于40％；

类型三：对菲降解效果显著，但对十六烷降解效果不佳的菌，即十六烷的降解率低于60％，菲的降解率大于等于65％；

类型四：对十六烷与菲均降解效果一般的菌，即十六烷的降解率大于等于60％小于80％，菲的降解率大于等于40％小于65％；

类型五：对十六烷与菲均降解效果不佳的菌，即十六烷的降解率小于60％，菲的降解率小于40％。

根据上述分类方法，对步骤1分离出的15株菌进行分类，每种类型的菌株如下：

类型一：XJ-A3、XJ-A11、XJ-A12；

类型二：XJ-A1、XJ-A4、XJ-A5、XJ-A13；

类型三：XJ-A6；

类型四：XJ-A7；

类型五：XJ-A2、XJ-A8、XJ-A9、XJ-A10、XJ-A14、XJ-A15。

3、菌株配伍

根据不同菌株对十六烷和菲的降解能力进行配伍组成用于降解石油的菌群，组配方法满足下述①和②：

①类型一至类型五中至少含有四种类型；

②菌群中各菌株活菌量相等。

根据各菌株对十六烷和菲的降解能力，选择如下七株菌组成三种菌群：XJ-3、XJ-12、XJ-4、XJ-6、XJ-7、XJ-10、XJ-14。

所组成的三种菌群为群落A、群落B和群落C：群落A由XJ-3、XJ-6、XJ-7、XJ-14组成；群落B由XJ-12、XJ-4、XJ-6、XJ-7组成；群落C由XJ-12、XJ-6、XJ-7、XJ-10组成(表2)。

表2、微生物群落构成信息

注：表2中，“√”表示含有该菌株，“-”表示不含有该菌株。

4、配伍菌群对石油降解能力的检测

将步骤3配伍的三个菌群作为待测菌群按照如下方法检测对石油的降解能力，各待测菌群的制备方法如下：

将待测菌群中的每株菌进行培养，然后将各菌株等活菌量混合，得到待测菌群种子液，待测菌群种子液。

将待测菌群种子液接种至100ml无机盐培养基(300ml锥形瓶)中，得到混合物，所加菌群的生物量满足混合物的OD600＝0.1，再向该该混合物中添加1g原油后，于30℃、150rpm摇瓶培养21天，得到培养液，然后检测培养液中原油降解率。利用不加菌作为对照组，其余组记为实验组。

原油降解率检测步骤如下：

将得到的100ml菌株培养液，利用30mL二硫化碳在250mL分液漏斗振荡器中进行萃取，用分液漏斗振荡器将混合液振荡10min，然后将其倒置静置10min，此时培养液被分为水相和有机相两部分，未被分解的被二硫化碳萃取在有机相溶液中。收集有机相溶液到准备好的50mL离心管中。取1.0mL有机相溶液，利用0.22μm的有机滤膜过滤，将滤液(即待测样品)收集在样品瓶中，检测待测样品中原油的含量。气质分析采用Agilent 7890C(GC)-5975C(MS)气质联用仪，色谱柱为Agilent HP-5AS(30m×0.25mm)；温度程序为40℃恒温10min，5℃/min升温至295℃,恒温29min。氦气载体流速为2.5ml/min。进样量为1μl，进样温度为295℃，分流比为29:1。检测器为四级杆质谱，质谱条件为：EI源，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，EI源电子能量69.9eV，质量范围为40-550m/z。

原油的降解率＝(对照组原油峰图积分值-实验组原油的积分值)对照组原油峰图积分值×100％。

测定的全烃色谱结果图2所示，群落C对原油降解率最高，平均为98.2％，群落A和群落B对原油的平均降解率分别为92.3％和94.6％，远高于之前文献(李宝明,阮志勇,姜瑞波.石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建[J].中國土壤與肥料,2007,2007(3):68-72.)报道的原油降解率(平均降解率为55.5％)。

表明，利用上文中菌群配伍方法得到的菌群可以提高原油降解率，可用于降解原油。

按照上述方法，分别将表2中的菌群D-P作为待测菌群，其他步骤均不变，检测各菌群的石油降解率，结果见表2，各菌群的石油降解率均显著高于文献(李宝明,阮志勇,姜瑞波.石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建[J].中國土壤與肥料,2007,2007(3):68-72.)报道的原油降解率(平均降解率为55.5％)。

表2其他组合菌群配伍的石油降解率

表2中，“菌株组合”列中的“A”均表示“XJ-A”。