分泌人铁蛋白轻链单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

摘要

本发明公开了一株杂交瘤细胞株3F6，其保藏编号是CCTCC NO:C2019173，其能够分泌特异性识别人铁蛋白轻链的单克隆抗体FTL‑McAb1，同时公开了该单克隆抗体FTL‑McAb1在检测人铁蛋白上的用途，以及由该单克隆抗体FTL‑McAb1制备的人血清铁蛋白免疫检测试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体地说是涉及一种能够分泌人铁蛋白轻链单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及在检测人血清铁蛋白中的用途，以及由该单克隆抗体制备的人铁蛋白检测试剂盒。

背景技术

缺铁性贫血(Iron deficiency anemia，IDA)是由于各种不同的原因导致体内储存铁缺乏，影响细胞血红素的生成而导致的贫血，该类贫血红细胞形态变小，中央淡染区扩大，属于小细胞低色素性贫。贫血的患者中大约50％都是由于缺铁导致的缺铁性贫血。缺铁性贫血的实验室检查主要有两个目的：一是确定患者所处的缺铁阶段，二是在临床上区分缺铁性贫血(IDA)和慢性病贫血(ACD)。

研究表明，血清铁蛋白的含量与机体储存铁是成一定比例的，lug/L的血清铁蛋白对应于8-10mg或每公斤体重120ug储存铁。大量的研究均证实了血清铁蛋白相较于其他铁相关检测用于诊断缺铁性贫血诊断的优越性，从多份的研究中得出血清铁蛋白作为诊断缺铁性贫血的ROC曲线的AUC平均值为0.95(95％的置信区间)，而锌原卟啉(zincprotoporphyrin，ZPP)为0.77、平均红细胞体积(MCV)为0.74、转铁蛋白饱和度(transferrin saturation)为0.74。随着血清铁蛋白在临床诊断上越来越广泛的应用和标准化的建立，血清铁蛋白已逐渐取代骨髓铁染色作为评价机体储存铁状态的新金标准。不仅如此，血清铁蛋白在铁缺乏期(iron depletion，ID)就有很明显的变化，是机体内储存铁缺乏灵敏的标志物。临床上血清铁蛋白的检测能甄别出缺铁的早期阶段，从而能尽早地采取调整膳食结构或补充铁剂等措施，预防缺铁性贫血的发生。人血清铁蛋白水平降低，一般代表缺铁性贫血，水平升高原因是恶性肿瘤，炎症，肝病等。因此，检测血清铁蛋白含量，对缺铁性贫血的、恶性肿瘤、炎症、肝病的监测有重要意义。

人血清铁蛋白主要由L亚基组成，只含有少量的H亚基，铁原子的含量也很少。人血清铁蛋白在血液中均以24聚体的纳米颗粒形式存在，未发现未组装的亚基。

免疫学检测由于其灵敏度高，速度快的优势，已经在检测人血清铁蛋白上得到越来越广泛的应用。血清铁蛋白免疫学检测试剂盒质量的最主要制约因素就是生物活性原材料的质量。从方法学上来说，血清铁蛋白检测试剂盒大多采用双抗体夹心法，其生物活性原材料就是铁蛋白单克隆抗体。而市场现有的铁蛋白单克隆抗体质量水平参差不齐，严重限制了试剂盒的质量。

鉴于此，有必要开发出高质量的铁蛋白单克隆抗体，以满足试剂盒的质量要求。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种杂交瘤细胞株3F6，保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)，杂交瘤细胞株3F6保藏编号是CCTCC NO:C2019173，能够分泌特异性识别人铁蛋白轻链的单克隆抗体FTL-McAb1。

本发明的第二目的是提供一种由杂交瘤细胞株3F6所分泌的特异性识别人铁蛋白轻链的单克隆抗体FTL-McAb1。

本发明的第三目的是提供特异性识别人铁蛋白轻链的单克隆抗体FTL-McAb1在人铁蛋白检测试剂盒中的用途。

本发明的第四目的是提供特异性识别人铁蛋白轻链的单克隆抗体FTL-McAb1制备的人铁蛋白免疫检测试剂盒。

作为优选，所述人铁蛋白免疫检测试剂盒，包含了由杂交瘤细胞株3F6所分泌的特异性识别人铁蛋白轻链的单克隆抗体FTL-McAb1。

细胞保藏：

本发明的一株杂交瘤细胞株3F6是本发明的发明人自行筛选得到的，其保藏编号为CCTCC NO:C2019173，保藏日期为2019年7月19日，保藏单位为CCTCC，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

术语定义：

本发明所指的人铁蛋白轻链，即Ferritin light chain(简称FTL)，其氨基酸序列已公布在UniProt(https://www.uniprot.org/uniprot/P02792)，具体如SEQ ID NO:1所示，其对应的mRNA编码区核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

单克隆抗体(monoclonal antibody)，简称单抗(McAb)，是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。

人胚肾细胞(Human embryonic kidney 293cells)，简称HEK 293,HEK-293,293细胞，可以用来表达外源蛋白。

人铁蛋白检测试剂盒，其采用免疫学检测方法，利用抗原-抗体特异性反应，用来检测标本中人铁蛋白的含量，根据检测平台分为酶联免疫法、免疫层析法、化学发光法、免疫比浊法等。

为了实现上述目的，按照制备单克隆抗体的一般步骤，首先需要得到人铁蛋白作为免疫原，本发明人发现，采用天然人铁蛋白作为免疫原虽然免疫效价高，但是抗原量太少，价格太贵，而采用大肠杆菌等原核表达系统表达的人铁蛋白，可能是因为原核表达的人铁蛋白构象与天然铁蛋白有差异，其免疫效价偏低，因此免疫原首选真核表达的人铁蛋白，本发明实施例采用的就是自行研制的HEK-293重组表达FTL作为免疫原。但是，其它途径、方法以及表达系统获取的铁蛋白作为免疫原也是可用的，并不局限于HEK-293重组表达。

从人体组织(例如血液、肝脏、脾脏)提取RNA，反转录得到FTL的cDNA，再以cDNA为模板，用PCR法得到FTL基因片段，PCR酶在片段两个3’端加上碱基“A”，再将该片段连接到T载体上，挑选出阳性克隆进行DNA序列测定，由此即得到FTL基因，也可以在RT-PCR引物两端带上酶切位点，PCR产物直接酶切，连接到同样酶切之后的载体上，挑选阳性克隆进行测序。采用全基因合成的方法，将FTL基因交给商业化基因合成公司进行合成，也是可行的。获得的FTL基因，采用酶切或者非酶切的基因克隆方法，将其连接到表达载体上。

表达载体和表达系统是对应的，本领域的技术人员所周知的表达系统，有原核表达系统，包括大肠杆菌表达系统，有真核表达系统，包括酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物表达系统，都可以用来表达FTL蛋白。将连接了FTL基因的表达载体导入相应表达系统的宿主细胞中，其中原核表达系统对应的导入技术是转化，真核表达系统对应的导入技术是转染。转化或者转染需要加入相应的抗生素进行选择性筛选，选出携带有FTL基因的重组子细胞，进行表达鉴定，挑选FTL表达量大的细胞株，进行扩大培养。离心收集培养的细胞(胞内表达时)，或收集上清(分泌表达时)，经过纯化，得到重组FTL蛋白。

用天然或者重组FTL蛋白免疫小鼠数次，ELISA测定小鼠血清效价，选择值高者取脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选阳性单克隆细胞株，将其扩增培养之后注射到小鼠腹腔生产腹水，也可采用体外培养法生产培养物。收集富含抗体的腹水或者培养物，经过纯化，得到FTL单克隆抗体。将这些单克隆抗体进行亚型鉴定。

将FTL单克隆抗体标记HRP，与未标记的单克隆抗体ELISA配对来检测不同浓度的FTL，以考察其灵敏度、特异性、线性范围等性能指标，挑选性能最好的一株，进行更进一步的性能验证。最终选定了一株单克隆抗体FTL-McAb1，由杂交瘤细胞株3F6所分泌。因为铁蛋白是24个亚基，为了简化原料和试剂盒制备工艺，所以仅用一株单抗同时用来包被和标记也能实现发明目的。

以单克隆抗体FTL-McAb1用来包被和标记，免疫检测标本中的人血清铁蛋白含量，检测平台包括酶联免疫法、免疫层析法、免疫比浊法、化学发光法等都具有较好效果。

有益效果：

本发明的杂交瘤细胞株3F6所分泌的单克隆抗体FTL-McAb1，用来检测标本中的人血清铁蛋白含量，具有灵敏度高，特异性好，线性范围宽，不同检测平台通用性好的优点，能够替代现有试剂盒中的FTL单克隆抗体。

附图说明

图1：重组表达FTL纯化后的SDS-PAGE电泳图。

图2：FTL单克隆抗体FTL-McAb1纯化后的SDS-PAGE电泳图。

图3：FTL免疫层析检测结果与雅培试剂临床相关性。

图4：FTL化学发光检测结果与雅培试剂临床相关性。

图5：FTL免疫比浊法检测结果与雅培试剂临床相关性。

具体实施方式

实施例1：FTL抗原制备

首先以FTL的mRNA编码区(序列如SEQ ID NO:2所示)为模板，设计一对引物(序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)。

取新鲜人肝癌组织，用赛默飞世尔Trizol一步法提取RNA，用AMV反转录试剂盒把RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认分子量正确之后，切下目的条带，用AXYGEN胶回收试剂盒进行回收，即得到FTL基因片段。

扩增得到的FTL基因片段，其3’末端都带有一个碱基“A”，将其连接到TaKaRa的pMD-18T载体上，PCR鉴定阳性的克隆，进行测序，经过序列比对与SEQ ID NO:2有100％的同源性，证明基因获取成功，得到pMD-18T-FTL克隆。

用AXYGEN质粒提取试剂盒提取pMD-18T-FTL质粒，用NEB的BamHI和EcoRI酶，切下FTL基因片段，连接到经过同样酶切过的质粒载体pcDNA3.1(+)上，连接物转化DH5α菌株，挑选经过PCR鉴定阳性的单克隆进行测序验证，证明pcDNA3.1(+)-FTL质粒构建成功。

预先培养HEK-293细胞至对数生长期，接种24孔培养至80-90％密度，用其转染PEI/pcDNA3.1(+)-FTL的转染试剂/质粒混合物，用抗生素G418筛选转染了基因的细胞。

对阳性细胞进行传代，用ELISA法检测上清进行高表达筛选，成功获得一株能够稳定高表达FTL的细胞株pcDNA3.1(+)-FTL(HEK-293)3D2,其上清中FTL浓度达到10mg/L。

经过多次转瓶扩增培养3D2细胞，收集到5L的细胞上清，用S200以及DEAE纯化，最终得到40mg重组FTL蛋白，纯度达到95％以上，并且80％以上目的蛋白以24聚体形式存在。

表1 FTL单克隆抗体ELISA检测结果

实施例2 FTL抗体制备

将实施例1制备的FTL重组抗原用20mM PBS pH7.4透析，并用透析液稀释到1mg/ml，与佐剂按照1：1比例混合，乳化。

乳化后的FTL抗原免疫8周龄Balb/c小鼠，每只小鼠免疫100ug，初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂。

免疫三针后，采尾静脉血，测定效价，选择效价超过100万者进行细胞融合。

融合前72小时冲击免疫，，向腹腔内注射30-50ug FTL抗原。

将待融合的小鼠处死，取脾，在200目筛网中碾磨，同时用RPMI1640培养基洗，将细胞悬液转移到50ml离心管中，用RPMI1640培养基洗4遍，每次15000rpm离心5min。

将骨髓瘤细胞用RPMI1640培养基洗4遍，每次15000rpm离心5min，最后1遍和脾细胞一起洗。

将混合后的脾细胞和骨髓瘤细胞1500rpm离心5min，弃去上清，轻弹管底，将细胞弹起；缓慢加入1ml提前预温至37度的PEG1450，边加边混匀，60s内加完；随即加入40ml提前预温至37度的RPMI 1640培养基终止融合反应，1500rpm离心5min；将细胞弹起，转移至RPMI1640 HAT细胞培养基中，混匀后铺板。

铺板之后定时换液和检测上清，挑选高值阳性孔进行亚克隆，3次亚克隆之后，最终选定18株杂交瘤单克隆细胞，上清对HEK-293表达的人铁蛋白轻链和天然肝脏铁蛋白都有较高反应(OD值>1.0)。

将18株杂交瘤细胞分别注射小鼠，收集产生的腹水，离心去掉沉淀物，上清用饱和硫酸铵初纯，Protein A柱亲和层析精纯，再透析到PBS缓冲液，最终得到了18株单抗，浓度都在5.0mg/ml以上，纯度都在95％以上。

对18株单抗进行亚型鉴定，其中12株是IgG，另外6株是IgM。

实施例3单克隆抗体配对

将12株IgG单抗采用过碘酸钠法进行标记，取5mg HRP溶于0.5ml水中，加入新鲜0.06M NaIO4水溶液0.5ml，混匀，4度放置30min。

取出后加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min后，加入含5mg纯化抗体的水溶液1毫升，混匀并装透析袋对0.05M，pH9.51的碳酸盐缓冲液透析过夜。

取出后加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，置冰箱2h。

加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置30min后，离心，沉淀用2.5ml 20mM PBS重悬，加等体积甘油，混匀，保存。

将包被抗体用20mM PB7.4稀释至0.5-4ug/ml，每孔加100ul包被于96孔酶标板，37度包被2h。

取出酶标板，弃去包被液，用PBST洗1遍，每孔加入200ul封闭液，37度封闭2h。

取出酶标板，弃去封闭液，将稀释好的铁蛋白样品加入板中，每孔100ul，37度反应30min。

取出酶标板，弃去样品，用PBST洗5遍，每孔加入酶标二抗100ul，37度反应30min。

取出酶标板，弃去酶标二抗，用PBST洗5遍，每孔加入四甲基联苯胺和过氧化氢各50ul，37度反应15min。

取出酶标板，每孔加入2M硫酸终止反应，将酶标板放入酶标仪中读值。

选定一株性能最佳的单抗分别做包被和标记，即FTL-McAb1，它们由杂交瘤细胞株3F6所分泌。

实施例4免疫层析法检测

(1)胶体金制备：在锥形瓶中加入100ml超纯水，磁力加热搅拌器上加热至沸腾，加入1ml 1％氯金酸(Sigma-Aldrich公司，货号：16961-25-4)溶液，沸腾后立刻加入1ml 1％柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司，货号：6132-04-3)水溶液，继续沸腾10分钟，然后自然冷却即可。

(2)胶体金标记：取10ml上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入0.1M K₂CO₃调节pH至7.0，继续搅拌5分钟；加入一定量的单抗FTL-McAb1，继续搅拌15-30分钟；加入0.1ml>

(3)金标垫制备：将上述金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(Watman公司)，37度烘2小时，即制成金标垫，干燥密封保存备用。

(4)硝酸纤维素膜(NC)膜包被：用检测线稀释液(10mM PBS+2％蔗糖)稀释单抗FTL-McAb1至1mg/ml制成检测线工作液，用同一稀释液稀释羊抗鼠单抗至0.5mg/ml制成对照线工作液，用点膜仪将这两种工作液划到硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号：HF135002)的相应位置上，37度干燥8小时。

(5)将上述金标垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫等辅料组装成铁蛋白金标检测试剂盒。

(6)检测方法：加100ul待测样品(例如：血清)到样品垫处，室温放置5分钟之后，判定结果，判定标准如下，

①仅质控区出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性(-)；

②有两条条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，表示阳性(+)；

③质控区未出现条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

(7)对比检测：依照上述胶体金试纸条制备工艺，将本发明的铁蛋白单克隆抗体FTL-McAb1进行包被，将本发明所涉及的铁蛋白单克隆抗体FTL-McAb1进行标记，然后配对组装成试纸条，检测71份雅培(Abbott)公司铁蛋白检测检测试剂盒检测后的临床标本，结果表明，试纸条检测灵敏度可以达到2ng/ml,线性范围5-500ng/ml,与雅培检测结果相关性R＝0.97(图3：FTL免疫层析检测结果与雅培试剂临床相关性)。

由此可见，本发明所涉及的铁蛋白单克隆抗体制备的免疫层析试纸条性能优异。

实施例5化学发光法检测

(1)磁珠包被抗体：取2mg PM3-008磁珠到1.5ml离心管中，用500ul MEST(10mMMES，pH6.0，0.05％Tween 20)洗涤2次，弃上清。加入200ul新配制的EDC(5mg/ml)和200ulNHS(5mg/ml)，混匀，37度活化30min，弃上清。加入500ul BST(5mM boric acid，0.05％Tween 20，pH9.0)，混匀，弃上清，再用500ul BST洗涤2次。加入100ug单抗FTL-McAb1到磁珠，翻滚混匀，弃上清，再用1ml BST洗涤2次，用5ml磁珠保存液重悬。

(2)吖啶酯标记抗体：取单克隆抗体FTL-McAb1，200ul加入600ul 0.1M PBS(pH8.0)中，加入150ul 0.5mM的AE(溶于甲基甲酰胺中)，混匀，室温避光反应20min。加赖氨酸溶液(8mg赖氨酸溶于200ul pH8.0的PBS)放置15min，对10mM pH6.5的PBS透析过夜，次日用葡聚糖凝胶G50纯化。

(3)化学发光法检测：向封闭好的微孔板中加入50ul磁珠标记的抗体、25ul抗原或待测标本、50ul分析缓冲液，室温孵育15min，洗涤液200ul每次小心洗涤3次，吸干。每孔加入用分析缓冲液按照1：100倍稀释的吖啶酯标记抗体50ul，室温反应10min，洗涤液200ul每次小心洗涤5次，吸干。每孔加入200ul洗涤液，用移液器吹匀，转移到2ml发光管中，磁力架上吸干上清。加入100ul预激发液A液，上机检测再加入100ul激发液B液，检测发光值。

(4)用本发明单抗配对检测雅培(Abbott)试剂盒检测过的144份临床标本，从校准曲线中可以看出，用单克隆抗体FTL-McAb1包被磁珠，用FTL-McAb1标记吖啶酯，这株单克隆抗体建立的人血清铁蛋白化学发光检测试剂灵敏度为0.2ng/ml，线性范围为1-1000ng/ml，与雅培检测结果相关性R＝0.96(图4：FTL化学发光检测结果与雅培试剂临床相关性)。

实施例6免疫比浊法检测

(1)聚苯乙烯微球的活化：选择微球粒径307nm，浓度100mg/ml(10％)，羧基密度59，用50mM pH6.0MES-HCl将微球稀释20倍，加入NHS之后再加入EDC，其中EDC：COOH＝2:1，NHS：COOH＝3.4:1，活化20分钟。

(2)配制偶联用抗体：以每管75ug抗体/1mg微球的比例，用50mM pH6.0MES稀释抗体FTL-McAb1。

(3)微球偶联抗体：活化完成后的微球16000rpm/min离心15分钟，弃上清，用稀释抗体的MES复溶微球(超声75s)；复溶之后，微球加入抗体中并超声(75s)，微球：抗体＝250:500。将每管偶联物置于翻转仪上，室温翻转2h。

(4)终止：加入5ul/ml乙醇胺终止30分钟。

(5)封闭：离心终止后的偶联物(16000rpm/min,15min)，弃上清，用R2(封闭液，20mM pH8.0Gly-Tris，3％海藻糖，2％BSA，0.1％Tween-20，0.05％proclin)复溶，37度烘箱一夜，第二天上机检测。

(6)检测结果：检测32份雅培(Abbott)试剂盒测过的临床标本，灵敏度5ng/ml，线性范围10-2000ng/ml，与雅培检测结果相关性R＝0.97(图5：FTL免疫比浊法检测结果与雅培试剂临床相关性)。

综上所述：通过实施例1、2、3得到杂交瘤细胞株3F6所分泌的特异性识别人铁蛋白轻链的单克隆抗体FTL-McAb1，通过实施例4、5、6不同的检测平台检测，标本中的人血清铁蛋白含量，均具有灵敏度高，特异性好，线性范围宽，不同检测平台通用性好的优点，能够替代现有试剂盒中的FTL单克隆抗体。

序列表

<120> 分泌人铁蛋白轻链单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 175

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala

1 5 1015

Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu

202530

Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val

354045

Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu

505560

Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln

65707580

Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala

859095

Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu

100 105 110

Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp

115 120 125

Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys

130 135 140

Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala

145 150 155 160

Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp

165 170 175

<210> 2

<211> 421

<212> RNA

<213> Nucleotide sequence of coding region

<400> 2

agagccccag acgcagaaac caccgacggg aggcagccgc aacagccggc aagaccgcag 60

gccccacacc acccccgggc cacgaccgcg agagggccgg aaggcggagc caccccgcga 120

aggccgagga gaagcgcgag ggcacgagcg cccgaagagc aaaaccagcg ggcggccgcg 180

cccccaggac acaagaagcc agcgaagaga gggggaaaac cccagacgcc agaaagcgcc 240

aggcccggag aaaaagcgaa ccaggcccgg accagcccgg gcgcccgcac ggacccccac 300

cggacccgga gaccacccag agaggaagga agcacaagaa gaggggacca ccgaccaacc 360

ccacaggcgg gggcccggag gcgggcgggc gagacccgaa aggccaccca agcacgacga 420

a 421

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> amplified polymorphic

<400> 3

ggatccatga gctcccagat tcgt 24

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> amplified polymorphic

<400> 4

gaattcttag tcgtgcttga gagtgag 27