一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌GX-1

摘要

本发明公开一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌GX‑1。保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期为2018年11月29日，保藏编号为CCTCC NO:M 2018841，分类命名为Bacillus velezensis GX‑1。本发明的菌株能够产生纤维素酶，可高效降解纤维素，用于纤维素的生物降解。GX‑1菌株所产纤维素酶具有较好的热稳定性，40‑70℃范围内能保持较好的酶活力；菌株GX‑1具有快速生长、产酶量高，对培养条件和产酶条件要求不高，又易于在猪肠道定殖的优势；其对畜牧养殖业和饲料发酵工业的发展具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于农业畜牧应用领域，具体涉及一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GX-1。

背景技术

纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。尽管我国是一个拥有丰富纤维素资源的农业大国，但纤维素资源并没有得到合理利用，造成了极大的浪费。纤维素在养殖业中的合理利用，将会极大地减少日粮中常规能量饲料(如玉米) 的使用。自然界中能够对结构复杂的纤维素进行有效降解利用的主要是微生物，包括真菌、细菌、放线菌等。真菌易产生胞外纤维素酶，易提取分离、酶活性高、降解效果好，但大多数真菌对温度要求较高。例如Saroj从土壤中分离出15株能在50℃下生长的嗜热真菌——烟曲霉菌JCM 10253具有较高的纤维素酶和β- 葡萄糖苷酶及木聚糖酶的活性；而放线菌虽然在自然界中分布广泛，但放线菌繁殖较细菌慢，产酶能力没有真菌强。任大明从腐植土中筛选出一株暗灰链霉菌(放线菌)，该菌所产的酶对pH及温度的适应性良好。菌株在pH＝7.5的环境下生长的最好，为弱碱性菌，但其所产的纤维素酶最适酶促反应pH＝4.5，为酸性纤维素酶，菌株对生长环境的要求以及自身代谢的产物的特性有特殊性。同样，细菌在自然环境中广泛存在，纤维素分解菌株对环境的抵抗力极高。它们通常耐寒、耐热、对酸碱也有一定耐受力。因此，这些菌株能够在恶劣的条件下生存，它们通常会产生在极端压力条件下稳定的酶，用于生物转化过程。例如，Pourramezan (2012)从白蚁肠道中分离到的3株纤维素降解菌，分属于不动杆菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属，其中芽孢杆菌产生酶活最高，其所产酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性。从自然界中筛选出的纤维素分解细菌相较于真菌和放线菌而言，具有生长快、纤维素酶活性高、对培养条件和产酶条件要求都不高的优势，在应对目前纤维素酶应用、发酵饲料工业的发展等方面具有重要意义。

发明内容

基于以上畜牧养殖生产过程中实际问题及需求，本发明的目的在于提供一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GX-1，可产生高含量纤维素酶，能够高效降解纤维素，羧甲基纤维素钠等，有助于动物对纤维素的消化率，从而提高动物对纤维素资源的利用。

本发明的技术特征如下：一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillusvelezensis)GX-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码：430072，保藏日期为2018 年11月29日，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018841，分类命名为Bacillus velezensis GX-1。

本发明还具有如下技术特征：

1、如上所述的一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌GX-1，其生物学特征包括：白色蜡状，菌落为白色，边缘不整齐，干燥，有皱褶。

2、如上所述的一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌GX-1的发酵培养方法，其如下：取OD₆₀₀＝1.0的种子液1-5％的接种量至发酵培养基中，温度>

3、如上所述的一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌GX-1的发酵培养方法，优选温度35℃，pH＝5.0，接种量2％。

4、如上所述的一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌GX-1，其所产纤维素酶对纤维素降解条件为温度40-70℃，pH＝4.0-7.0，反应时间为5-40min。

5、如上所述的一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌GX-1，其所产纤维素酶对纤维素降解条件优选温度55℃，pH＝4.5，反应时间25min，酶活为 41.18U/mL。

6、如上所述的一种降解纤维素的民猪源贝莱斯芽孢杆菌GX-1在制备纤维性饲料中的应用。

本发明的优点及有益效果：本发明所提供的菌株GX-1产生纤维素酶的能力强，且所产生的纤维素酶能保持很高的活性，可对纤维素实现高效的降解、产酶条件要求不高，又易于在猪的肠道定植；该菌株对纤维性饲料资源的利用以及饲料发酵工业和畜牧养殖业的发展具有重要意义。GX-1菌株所产纤维素酶具有较好的热稳定性，40-70℃范围内能保持较好的酶活力；菌株GX-1具有快速生长、产酶量高，对培养条件和产酶条件要求不高，又易于在猪肠道定殖的优势；其对畜牧养殖业和饲料发酵工业的发展具有重要意义。

附图说明

图1GX-1菌体形态；

图2菌株GX-1的系统发育树；

图3葡萄糖标准曲线；

图4pH对菌GX-1产酶的影响；

图5温度对菌GX-1产酶的影响；

图6接种量对菌GX-1产酶的影响；

图7温度对纤维素酶酶活的影响；

图8pH对纤维素酶酶活的影响；

图9反应时间对纤维素酶活的影响；

具体实施方式

实施例1：菌株筛选与鉴定

民猪是我国地方八大优良猪种之一，具有肉质好、耐粗饲、产仔多、抗寒性强、抗病强等优点,民猪耐粗饲，适于放牧饲养，能大量食用青粗饲料，大量采食野草、野菜。有研究表明：粗纤维含量为9％、12％和15％的三种日粮饲喂情况下，民猪和大白猪谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶含量均有增加，但民猪增加程度较小；另外饲喂高粗纤维含量日粮的情况下民猪肝脏、心脏、肌肉等组织器官所受影响远小于大白猪。因此，我们推测民猪肠道内定居着大量能够利用植物纤维素的微生物。本实施例菌株经由成年的民猪粪便筛选分离得到，具体过程如下:

称取民猪粪便1.0g转移至盛有100mL无菌水的三角瓶中，在80℃电热恒温振荡水浴锅中振荡30min。按照平板涂布法涂布至以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的LB+1％CMC平板上，37℃培养24h。向培养皿中加入适量0.1％刚果红溶液染色1h后弃去染液，从平板上选择具有透明圈的菌落进行初筛，从中继续选出透明圈显著菌落，在LB平板上划线分离纯化得到单菌落。将得到的单菌落分别测定纤维素酶活进行复筛，选择纤维素降解效果最好、纤维素酶活最高的菌株命名为GX-1。

本实施例所发现的菌株GX-1的生物学特征包括：白色蜡状，菌落为白色，边缘不整齐，干燥，有皱褶(见图1)。产生纤维素酶的能力强，且所产生的纤维素酶能保持很高的活性，可对纤维素实现高效的降解。

本发明菌株的生理生化特征如下(见下表1)：

表1菌株GX-1生理生化特征

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性

分子鉴定过程及结果如下所示：

采用上海生工基因组DNA提取试剂SK8255提取本发明菌株的总DNA，通过SK8131试剂盒进行16S rDNA PCR扩增，获得1492bp16S rDNA片段。

委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成16S rDNA测序，测序引物为：上游引物：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；下游引物：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。获得 DNA测序结果，并在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对，与同源性最相近的菌株16S rDNA序列进行比对分析，绘制菌株的系统发育树，与菌株近似度比对达到99％(见图2)。

经形态观察、生理生化反应和16S rDNA分子鉴定，确定本菌株为贝莱斯芽孢杆菌种(Bacillus velezensis)的一个新种，首次发现民猪消化道中贝莱斯芽孢杆菌具有纤维素降解能力，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GX-1。

实施例2：纤维素酶活测定

方法如下：粗酶液制备：将活化培养菌液的OD₆₀₀调至1.0即为试验的种子液；然后种子液OD＝1.0以1.0％的接种量接种于50mL摇瓶发酵培养基内，在37℃、>

实施例3：不同培养条件对菌株GX-1生长繁殖的影响

本发明提供了所述菌株GX-1的发酵培养方法，具体为：实验室摇床培养方法：取OD₆₀₀＝1.0的种子液1％的接种量至发酵培养基中，在31-41℃、180-240rpm、pH＝4.0-7.0条件下振荡培养。其中，所述发酵培养基的配方为：酵母粉5g/L，胰蛋白脉10g/L，氯化钠10g/L，CMC-Na>

(1)不同初始pH对菌株GX-1的影响：本实施方式贝莱斯芽孢杆菌GX-1 随起始pH值变化的产酶曲线图如图4所示。起始pH值在4-7之间时菌株酶活比较稳定，在pH为5.0时酶活达到最高值，因此起始pH为5.0是贝莱斯芽孢杆菌GX-1产酶的最适起始pH值。

(2)不同温度对菌株GX-1的影响：本实施方式贝莱斯芽孢杆菌GX-1随温度变化的产酶曲线图如图5所示。在温度为35℃时酶活达到最大值，酶活为 22.03U，所以温度为35℃时为贝莱斯芽孢杆菌GX-1产酶的最适温度。

(3)不同接种量对菌株GX-1的影响：本实施方式贝莱斯芽孢杆菌GX-1 随接种量变化的产酶曲线图如图6所示。在接种量为2％时酶活达到最大值，酶活为26.39U，所以2％的接种量时为贝莱斯芽孢杆菌GX-1产酶的最适接种量。

(4)菌株GX-1的温度耐受：取于-80℃冻存菌株接种于LB液体培养基中活化8h后，取1％转接于LB液体培养基，分别置于70℃、80℃放置过夜，后培养24h，结果显示菌株GX-1能够于高温下以休眠方式存活。

实施例4：对菌株GX-1所产纤维素酶的酶学特性的研究

(1)贝莱斯芽孢杆菌GX-1产纤维素酶热稳定性检测：反应温度的变化曲线如图7所示。CMCase反应最适的温度为55℃。当温度上升至70℃时，其酶活大小仍为最适温度酶活的80％以上，说明GX-1所产纤维素酶具有良好的热稳定性。

(2)贝莱斯芽孢杆菌GX-1产纤维素酶pH耐受性检测：本实施方式贝莱斯芽孢杆菌GX-1酶反应pH的变化曲线如图8所示。CMCase反应最适的pH 为4.5。

(3)贝莱斯芽孢杆菌GX-1产纤维素酶对纤维素反应的有效时间检测：贝莱斯芽孢杆菌GX-1酶反应时间的变化曲线如图9所示。CMCase反应在进行 25min时酶活最高，此后，酶和底物随着反应时间的延长，其酶活逐渐降低。

实施例5：贝莱斯芽孢杆菌GX-1菌剂的制备

本实施例利用贝莱斯芽孢杆菌GX-1冻存菌株进行菌剂的制备，具体操作方法为：将菌株GX-1接入反应体系(配方：酵母粉5g/L，胰蛋白脉10g/L，氯化钠10g/L，CMC-Na 10g/L，pH＝6±0.5)中进行活化培养8h，后将活化培养物以2％的接种比例转接入反应体系(建议体系：50ml)中，培养条件为：温度35 ℃，pH＝5，经摇瓶培养24h后，可得GX-1菌剂，对所述GX-1菌剂进行纤维素酶活性测定，酶活为41.18U/mL(菌剂短期储存条件为：4℃，建议存放时间为 48h；长期储存条件为：-40℃)。

实施例6：短期灌服菌株GX-1发酵种子液对SD大鼠肠道菌群多样性的影响

本发明利用菌株GX-1并采用单因子随机区组试验设计，选取3周龄、体重相近、SPF级健康SD雌性大鼠24只，随机分成2组，每组6个重复，每个重复2只鼠。预饲3天，对照组(A组)灌服生理盐水0.2ml/d，试验组(B组) 灌服菌液0.2ml/d；每天灌胃1次，连续灌胃7d。自由采食，于试验第21天，处死A组和B组鼠取盲肠食糜，冻存用于DNA提取、建库测序、数据处理、OTU 划分、多样性分析；

短期灌服贝莱斯芽孢杆菌GX-1对SD大鼠盲肠微生物门水平的影响见表2。结果表明：灌服贝莱斯芽孢杆菌GX-1对SD大鼠盲肠微生物放线菌门和变形菌门的比例显著降低(P<0.05)。

表2短期灌服贝莱斯芽孢杆菌GX-1对SD大鼠盲肠微生物门水平的影响

注：同一行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著 (P>0.05)。

实施例7：长期灌服菌株GX-1发酵种子液对SD大鼠肠道形态发育的影响

本实施例利用菌株GX-1并采用单因子随机区组试验设计，选取3周龄、体重相近、健康SD大鼠24只，随机分成2组，每组6个重复，每个重复2只鼠。对照组灌服生理盐水0.2mL/d，试验组灌服菌液0.2mL/d(菌液浓度为1×10⁸>

灌服贝莱斯芽孢杆菌GX-1对SD大鼠空肠和回肠形态发育的影响见表3。全期灌服贝莱斯芽孢杆菌GX-1显著提高大鼠空肠的绒毛高度(P<0.05)，显著降低回肠隐窝深度(P<0.05)。对空肠隐窝深度有降低的趋势(P>0.05)，回肠绒毛高度有升高的趋势(P>0.05)。

表3贝莱斯芽孢杆菌GX-1对SD大鼠肠道形态发育的影响

注：同一行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著 (P>0.05)。

实施例8：短期灌服贝莱斯芽孢杆菌M2对35日龄SD大鼠血液生化和血液免疫因子的影响

本实施例利用菌株GX-1采用单因子随机分组试验设计，选取3周龄、体重相近、SPF级健康SD雌性大鼠(北京维通利华)24只，随机分成2组，每组6 个重复，每个重复2只鼠。对照组(A组)灌服生理盐水0.2ml/d，试验组(B 组)灌服菌液0.2mL/d；每天灌胃1次，连续灌胃7d。自由采食，预饲期3天，于正式期试验第11天每笼随机选取一只大鼠处死，用肝素钠抗凝管采集大鼠血液样品(采用眼球取血法)，在3500r/min离心10min，分离血浆，总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇采用GPO-PAP酶法，葡萄糖测定采用葡萄糖氧化酶法，血液免疫因子的测定采用酶联免疫吸附法 (ELISA)，测定血浆中IgA、IgG、IgM。TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的浓度；试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，操作严格按照试剂盒说明书进行。

短期灌服贝莱斯芽孢杆菌M2对35日龄SD大鼠血液生化和血液免疫因子的影响如表4、5所示：与对照组相比，短期灌服贝莱斯芽孢杆菌能降低血浆中总胆固醇、血糖、低密度脂蛋白胆固醇的浓度，但差异不显著(P>0.05)；提高了血浆中高密度脂蛋白胆固醇的浓度，但差异性不显著(P>0.05)；显著降低了甘油三酯浓度(P<0.01)。

表4短期灌服贝莱斯芽孢杆菌M2对35日龄SD大鼠血液生化的影响

注：同一行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著 (P>0.05)。

表5短期灌服贝莱斯芽孢杆菌M2对35日龄SD大鼠血液免疫因子的影响

注：同一行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著 (P>0.05)。

实施例9：全期灌服贝莱斯芽孢杆菌M2对SD大鼠饲粮营养物质表观消化率的影响

试验采用全收粪法，在试验第18d开始收粪。每天准确记录各组试验SD大鼠的采食量并准确收集每组试验SD大鼠每天排泄的粪，连续收集3d。将每天收集的粪便进行称重，加入质量为粪便鲜重10％的盐酸溶液充分混匀，于-20℃保存，试验结束后，将采自同一组的粪充分混合均匀，每组大约选取100g左右新鲜粪样，首先在120℃烘箱中烘15min灭酶活后，降至65℃烘干，经24h充分回潮后称重，至恒重，粉碎，制成待测样品。粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用乙醚抽提法测定；能量采用Parr 6300型氧弹量热仪测定；Ca和 P分别采用高锰酸钾法和比色法测定。

结果如表6所示：与对照组相比，全期灌服贝莱斯芽孢杆菌对粗蛋白、粗脂肪、粗纤维的表观消化率有提高趋势，但差异不显著(P>0.05)；钙的表观消化率有降低趋势，但差异性不显著(P>0.05)；总能、灰分和磷表观消化率显著提高(P<0.05)。

表6全期灌服贝莱斯芽孢杆菌M2对SD大鼠饲粮营养物质表观消化率的影响

注：同一行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著 (P>0.05)。